专利名称：：抗cd14抗体融合蛋白质的制作方法
技术领域：
：JP2744130B[专利文献2]WO02/42333[专利文献3]JP10-512142A[专利文献4]WO01/72993GoyertS.M.andFerreroE.，inMcMichaelA.(ed.):LeukocyteTypingIII.Oxford,OxfordUniversityPress,1987。ZhangG.andGhoshS.，EndotoxinRes.,2000，6,453-457。StdterF.，Structure/FunctionrelationshipofCD14;inJackR.S.(ed.):CD14intheInflammatoryResponse.Chem.Immunol.Basl,Karger,2000，74，第25-41页。ZieglerE丄，etal.,NewEngl.J.Med.，1991,324,429-436。FischerC丄etal.，N.EngU.Med.,1996，334，1697-1702。GachotB.，IntensiveCareMed.,1995，21，1027-1031。VincentJ丄.etal.，CID,2002，34，1984-1093。[非专利文献18]RivardG.E.etal.，J.Peditr.，1995,126,646-652,[非专利文献19]FournerF.etal.,Chest,1993，104,882-888。[非专利文献20]AbrahamE.etal.,Crit.CareMed.,2000，28,6]GreenmanR丄.etal.，JAMA，1991，266，1097-7]KawataT.etal.，ProgClmBiolRes.，1995,392，8]TaniT.etal.，Artif.Organs,1998,22，1038-1045。9]LinY.etal.，Antimicrob.AgentsChemother.,10]Cleveland,InfectImmim.,1996,64,1906-1912。11]GoyertS.M.，丄Imm腳l.，1995,154，6529-6532。12]FischerC丄etal.,Crit.CareMed.，1993，21，14]FischerC.J.etal.，JAMA，1994,271，1836-1843。15]DhainautJ.F.etal.,Crit.CareMed.,1994，22，S31画33。Bernard,G.R.etal.,N.Engl.J.Med.，2001，344，699-709。
发明内容本发明解决的问题考虑到该状况，本发明的发明人注意到通过将抗CD14抗体与蛋白酶抑制剂结合而制造的一种新型蛋白质将解决与现有技术有关的各种问题，并通过制造这样新型蛋白质确认其效果。本发明的目的是提供包含抗CD14抗体和蛋白酶抑制剂的新型蛋白质；编码所述新型蛋白质的多核苷酸；所述新型蛋白质的制造方法；和包含所述新型蛋白质的用于败血症的预防和/或治疗剂。解决问题的手段然后，以下将描述本发明的典型方面。本发明的第一方面是一种新型蛋白质，所述蛋白质包含(I)抗CD14抗体或其活性片段，或其衍生物和(n)蛋白酶的抑制剂，或其活性片段，或其衍生物。更具体的是，该方面的新型蛋白质是(1)一种蛋白质，所述蛋白质包含(I)抗CD14抗体或其活性片段，或其衍生物和(n)蛋白酶的抑制剂，或其活性片段，或其衍生物，(2)如(1)所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是蛋白质抑制剂，(3)如(1)或(2)所述的蛋白质,其中，(II)中的所述抑制剂是多价酶抑制剂，(4)如(i)(3)中任一项所述的蛋白质，其中，(n)中的所述蛋白酶是凝血因子(凝血蛋白酶)或炎性蛋白酶，(5)如(1)~(4)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是FXa和/或FXIa,(6)如(1)~(4)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是凝血酶，(7)如(i)-(6)中任一项所述的蛋白质,其中，(n)中的所述抑制剂来源于UTI，(8)如(1)(6)中任一项所述的蛋白质,其中，(II)中的所述抑制剂来源于凝血调节蛋白，(9)如(l)-(6)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于UTI结构域2，(10)如(1)(8)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于凝血调节蛋白的功能结构域，尤其是EGF样结构域，(11)如(1)(4)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是弹性蛋白酶，(12)如(1)(4)中任一项所述的蛋白质，其中，(n)中的所述抑制剂是分泌性白细胞蛋白酶抑制剂，(13)如(1)(11)中任一项所述的蛋白质,其中，(II)中的所述抑制剂是具有1~4个氨基酸取代的UTI结构域2的突变体，(14)如(1)(13)中任一项所述的蛋白质,其中，(I)中的所述抗CD14抗体是具有中和活性的抗体，(15)如()(]4)中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是识别人类CD14的氨基酸序列269~315的至少一部分的抗体，(16)如0)(15)中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是嵌合抗体，(17)如(1)(16)中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是人源化抗体，或(18)如(1)(17)中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所迷抗CD14抗体是下述抗体该抗体包含表2中所描述的重《连的CDR1、CDR2和CDR3作为所述重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3，或包含表2中所描述的轻链的CDR1、CDR2和CDR3作为所述轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3。本发明的第二方面是一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据第一方面的蛋白质的至少一部分。更具体的是，该方面的多核苷酸是(19)一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如(l)~(18)中任一项所述的蛋白质的至少一部分。本发明的第三方面是一种载体，所述载体包含根据本发明第二方面的多核苦酸，更具体的是，该方面的载体是(20)—种载体，所述载体包含如(19)所述的多核苷酸。本发明的第四方面是一种细胞，所述细胞包含根据本发明第二方面的多核苷酸或根据本发明第三方面的载体。更具体的是，该方面的细胞是(21)—种细胞，所述细胞包含如(19)所述的多核苷酸或如(20)所述的载体。本发明的第五方面是一种方法，所述方法用于制造根据本发明第一方面的蛋白质，该方法使用根据本发明第二方面的多核苷酸、根据本发明第三方面的载体和根据本发明第四方面的细胞中的至少一种。更具体的是，该方面的方法是(22)—种方法，所述方法用于制造如(l)-(18)中任一项所述的蛋白质，该方法使用如(19)所述的多核苷酸、如(20)所述的载体和如(21)所述的细胞中的至少一种。本发明的第六方面是一种用于疾病的预防和/或治疗剂，所述用于疾病的预防和/或治疗剂包含根据本发明第一方面的蛋白质、根据本发明第二方面的多核苷酸、根据本发明第三方面的载体和根据本发明第四方面的细胞中的至少一种。更具体的是，该方面的所述预防和/或治疗剂是(23)—种用于疾病的预防和/或治疗剂，所述用于疾病的预防和/或治疗剂包含如(1)~(18)中任一项所述的蛋白质，如(19)所述的多核苷酸、如(20)所述的载体和如(21)所述的细胞中的至少一种，或(24)如(23)中所述的预防和/或治疗剂，其中，所述疾病是败血症、严重败血症或败血病性休克、SIRS相关疾病、内毒素休克或ARDS。发明效果本发明的新型蛋白质对于疾病或病状，或与该疾病或病状有关的特定症状或疗效指标有效，而对于所述情况单独使用抗CD14抗体或蛋白酶抑制剂是无效的或效果不充分。所述蛋白质同时显示出稳定的体内消炎作用、抗凝血作用和/或弹性蛋白酶的抑制作用，因此，所述蛋白质可以用作用于败血症的预防和/或治疗剂。图1显示了抗体F1024的重链可变区的DNA序列和氨基酸序列。图2显示了抗体F1024的轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列。图3显示了抗体F1031-13-2的重链可变区的DNA序列和氨基酸序列。图4显示了抗体F1031-13-2的轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列。图5显示了抗体F]031-13-2的重链可变区的DNA序列和氨基酸序列。图6显示了抗体F1031-13-2的轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列。图7是显示融合蛋白质F1024D-D1D2的全部氨基酸序列的结构的视图。图8是显示融合蛋白质F1024D-D2的全部氨基酸序列的结构的视图。图9是显示融合蛋白质F1024D-D2(3)的全部氨基酸序列的结构的视图。图10是显示融合蛋白质F1024S-D1D2的全部氨基酸序列的结构的视图。图11是显示融合蛋白质F1024S-D2的全部氨基酸序列的结构的视图。图12是显示融合蛋白质F1024S-D2(3)的全部氨基酸序列的结构的视图。图13是显示融合蛋白质F1024D-SLP1(D1D2)的全部氨基酸序列的结构的视图。图14是显示融合蛋白质F1024D-SLP1(D2)的全部氨基酸序列的结构的视图。图15是显示融合蛋白质F1024S-SLP1(D1D2)的全部氨基酸序列的结构的视图。图16是显示融合蛋白质F1024S-SLP1(D2)的全部氨基酸序列的结构的视图。图17是显示融合蛋白质F1031-13S-D2(3)的全部氨基酸序列的结构的视图。图18是显示F1024(抗CD14抗体)或抗体融合蛋白质对于通过LPS诱导的U373MG细胞的IL-6的合成的抑制性活性的视图。图19是显示F1024(抗CD14抗体)或抗体融合蛋白质对于通过LPS诱导的U373MG细胞的IL-6的合成的抑制活性的视图。图20是显示抗体融合蛋白质对IL-6的合成的抑制活性的视图。图21是显示UTI及抗CD14抗体融合蛋白质的蛋白质胰蛋白酶抑制活性的视图。图22是显示抗CD14抗体融合蛋白质的因子Xa的抑制活性的视图。图23是显示抗CD14抗体融合蛋白质因子Xia的抑制活性的视图。图24是显示抗CD14抗体融合蛋白质的弹性蛋白酶抑制活性的视图。图25是显示抗CD14抗体融合蛋白质的血浆激肽释放酶抑制活性的视图。图26是显示融合蛋白质F1024S-D2(3)对于改善LPS诱导型家兔败血症样本的存活率的效果的视图。图27是显示融合蛋白质F1024S-D2(3)对于LPS诱导型家兔败血症样本的白细胞计数(初次施用LPS后28小时LPS诱导型家兔败血症样本的白细胞计数)的效果的—见图。图28是显示融合蛋白质F1024S-D2(3)对于LPS诱导型家兔败血症样本的血小板计数(首次施用LPS后26小时LPS诱导型家兔败血症样本的血小板计数)的效果的一见图。图29是显示融合蛋白质F1024S-D2(3)对于LPS诱导型家兔败血症样本的抗凝血酶(AT)III活性减小(首次施用LPS后28小时LPS诱导型家兔败血症样本的抗凝血酶(AT)III活性的减小)的效果的视图。图30是显示通过融合蛋白质F1024S-D2(3)对LPS诱导型家兔败血症样本的血压降低的改善的碎见图。图31是显示与抗体F1024的竟争性结合的实验结果的视图。图32显示了融合蛋白质F1024-D2的修饰UTI结构域2的氨基酸序列。图33显示了融合蛋白质F1024-D2的修饰UTI结构域2的氨基酸序列。图34显示了融合蛋白质F1024-D2的修饰UTI结构域2的氨基酸序列。图36是显示融合蛋白质F1024S-D2(4)的全部氨基酸序列(Rl1S/R15T/Q19K/Y46D)的视图。图37显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。图38显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。图39显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。图40显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。图41显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。图42显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。图43显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。图44显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。图45是显示融合蛋白质F1024S-TM23456L的全部氨基酸序列的结构的视图。图46是显示融合蛋白质F1024S-TM中TM的修饰功能结构域的凝血调节蛋白活'性的视图。图47是显示人源化F1024S-D2(3)的全部氨基酸序列的结构的视图。图48是显示F1024-l-3大鼠抗体的重《连及轻链可变区的氨基酸序列的视图；和具有与人源化F1024S-D2(3)的重链及轻链可变区的高度同源性的人类抗体的氨基酸序列的视图。图49是显示能够表达人源化抗体的重链并维持结合活性的氨基酸序列的视图。图50是显示APTT试剂诱导的人血浆中舒緩激肽的合成的抑制的视图。图51是显示APTT试剂诱导的兔血浆中舒緩激肽的合成的抑制的视图。图52是显示促凝血酶原激酶诱导的人血浆中凝血酶的合成的抑制的视图。图52是显示促凝血酶原激酶诱导的兔血浆中凝血酶的合成的抑制的视图。图54是显示施用F1024S-D2(3)后F1024S-D2(3)对于LPS诱导型家兔全血中的TNF-a合成的抑制作用的时间进程的;^见图。图55是显示对家兔施用F1024S-D2(3)后APTT的时间进程的视图。图56是显示对家兔盲肠结扎穿孔(CLP)样本施用F1024S-D2(3)后的存活率的时间进程的视图。图57是显示对家兔盲肠结扎穿孔(CLP)样本施用F1024S-D2(3)后血浆中的D二聚物水平的视图。具体实施方式下面，将对本发明进行更详细的描述。根据本发明第一方面的蛋白质并不特别限定其类型。示例性蛋白质包括单纯蛋白质(或多肽)和复合蛋白质(如糖蛋白)。在根据本发明第一方面的蛋白质中，(I)抗CD14抗体或其活性片段，或其衍生物与(II)蛋白酶的抑制剂或其活性片段，或其衍生物之间的结合不受特别限制。尽管(I)和(II)通常通过共价键连接，不过它们也可以通过例如化学手段(化学合成或化学结合)或遗传工程连接。根据本发明第一方面的蛋白质优选是由遗传工程制造的融合蛋白质。在本发明的蛋白质中，抗CD14抗体(I)或蛋白酶抑制剂(II)的活性片段是下述片段其包含能够表达或保持抗CD14抗体(I)或蛋白酶抑制剂(II)中固有的各活性或功能中的至少一种的部分，并包含活性区或功能结构域。在本发明的蛋白质中，抗CD14抗体(I)、蛋白酶抑制剂(11)、或其活性片段的衍生物是包括某些修饰、突变或添加的抗CD14抗体(I)、蛋白酶抑制剂(II)、或其活性片段，例如，包含其他化学物质(如聚乙二醇)的种类，或与突变有关的种类，如添加、删除、插入或取代至少一个，优选一个至数个氨基酸。换言之，(1)、(II)及其活性片段的衍生物包括(i)、(n)及其活性片段的突变体、修饰型和修饰产物，并且它们能够表达或保持抗CD14抗体(I)、蛋白酶抑制剂或其活性片段中固有的各活性或功能中的至少一种，优选为全部。根据本发明第一方面的蛋白质表达或保持抗CD14抗体(I)和蛋白酶抑制剂(n)中固有的各活性中的至少一种，优选为全部。由于根据本发明第一方面的蛋白质具有抗CD14抗体(I)和蛋白酶抑制剂(II)中固有的各活性中的至少一种，优选为全部，因此其对于疾病或病状，或与该疾病或病状有关的特定症状或疗效指标有效，而对于所述情况单独使用抗CD14抗体或蛋白酶抑制剂是无效的或效果不充分。在根据本发明第一方面的蛋白质中，蛋白酶抑制剂(n)不受特别限制，其可以为非蛋白质抑制剂或低分子量化合物。不过所述蛋白酶抑制剂(n)优选为蛋白质抑制剂。尽管所述蛋白酶抑制剂(II)也可以为对于特定酶具有特异性的种类，但所述蛋白酶抑制剂(II)优选为抑制两个或两个以上酶的多价酶抑制剂。具有多价酶抑制作用的示例性物质包括Kimitz型蛋白酶抑制剂，如尿道胰蛋白钠抑制剂(UTI)、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、组织因子途径抑制剂(TFPI)和抑肽酶，其中，优选UTI、SLPI和TFPI。UTI是与比库宁或乌司他丁相同的蛋白酶抑制剂，是用于诸如胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶和中心粒细胞弹性蛋白酶等蛋白酶的抑制剂。SLPI是用于中心粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶等蛋白酶的抑制剂。TFPI是也被称为脂蛋白相关凝结抑制物(LACI)或外源性途径抑制物(EPI)的蛋白酶抑制剂。TFPI与凝血因子Xa(FXa)结合从而抑制因子Vila-组织因子(factorIII)复合体，由此抑制外源性凝血的开始。其他的多价酶抑制剂包括a2-巨球蛋白(a2-MG)、抗凝血酶III(ATIII)和al-抗胰蛋白酶(al-AT)。a2-MG是具有约为770,000的巨大分子量的血浆蛋白质，并抑制凝血酶、FXa、血纤维蛋白熔酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶等。ATIII与诸如FXa或凝血酶等丝氨酸蛋白酶以1:1的比率形成复合体，由此控制凝结。ATIII在其N端具有肝素结合域，并在其C端具有与凝血酶反应的反应活性位，ATIII的抗凝血酶活性通过与肝素结合而增大约1000倍。al-AT是包含394个氨基酸的糖蛋白，其分子量为51000。al-AT抑制包括凝血酶、血纤维蛋白溶酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶等各种丝氨酸蛋白酶。本发明的蛋白质中的蛋白酶抑制剂(n)优选为对包括诱发抗凝血剂作用或舒緩激肽和成的因子的凝血因子(凝血蛋白酶)具有抑制作用，尤其是对活化凝血因子具有抑制作用，或对于炎性蛋白酶具有消炎作用或抑制作用的抑制剂。典型的凝血因子包括激肽释放酶、凝血酶、Fva、FVIIa、FVIIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa和FXIIIa,其中，激肽释放酶、凝血酶、Fva、FVIIIa、FIXa、FXa、FXIa是重要因子，；疑血酶或FXa和FXIa是最重要的耙标酶。典型的炎性蛋白酶包括弹性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和c叩hepsm,其中，弹性蛋白酶，特别是中心粒细胞弹性蛋白酶和胰弹性蛋白酶，尤其是中心粒细胞弹性蛋白酶是最重要的靶标酶。本发明的蛋白质或本发明的蛋白质中的抑制剂(II)的蛋白酶抑制活性可通过各种已知材料和方法进行测定，其典型例在实施例中描述。在根据本发明第一方面的蛋白质中，所述抗体(I)优选是单克隆抗体，尽管该抗体也可以为多克隆抗体，其来源并不限于特定种类。考虑到制造所述抗体的容易性时，所述来源优选是小鼠或大鼠。考虑到构成药物组合物时，所述抗体优选为嵌合抗体、CDR嫁接抗体、人源化抗体或人类抗体。所述人类抗体也可以包括通过将表达人类抗体基因的基因转录过的小鼠免疫而制造的人类抗体。本发明的抗体还包括噬菌体抗体等。所述人源化抗体是其中的恒定区和框架区(FR)来自人类，互补决定区(CDR)来自非人类的CDR移植抗体，或在其FR中具有引入的其他突变体的抗体。噬菌体抗体是通过将抗体与丝状噬菌体的病毒外壳蛋白融合而制造的抗体用以表达噬菌体颗粒上的抗体，主要使用单链Fv(scFv)形或Fab形。嵌合抗体是包含来自人类之外的哺乳动物，例如大鼠或小鼠的单克隆抗体的可变区，和人类抗体的恒定区的抗体。在根据本发明第一方面的蛋白质中，对抗体(I)的分子物种不作特别限定，所述抗体可以为属于任何纲(例如IgG、IgM和IgA，尤其是IgG)、亚纲(例如，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，尤其是IgG4)或同种型的抗体。关于所述抗体的轻链，可以使用卡巴链和拉姆达链中的任何一种。本发明中还包括活性片段或衍生物，如具有生物活性的Fab(抗原结合段)、Fab'、(Fab')2、通过连接物等连接的抗体活性片段，如单链抗体(单链Fv:scFv)(Bird,R.E.etal.,Science,1988;242:423-426)、二石克化物稳定抗体(二好u化物稳定Fv:dsFv)(Reiteretal.,ProteinEngineering,1994;7:697)和双价小抗体(HolligerP.etal.，ProcNatlAcadSciUSA1993;90:6444-8),单结构域抗体(dAb)(WardE.S.etal.,Nature.,1989;341:544-6)等。这些抗体可以通过本领域中已知的技术如遗传工程技术和利用适宜的蛋白酶对抗体的处理而制造。嵌合抗体是通常利用遗传工程手段制造的抗体，其中的轻链基因和重链基因由属于不同物种的抗体基因段构成。例如，来自大鼠或小鼠单克隆抗体的基因中的可变(v)段可以与人类恒定(c)段，如y1和丫4连接。因此，用于治疗目的的典型嵌合抗体是包含来自大鼠或小鼠抗体的v或抗原结合域和来自人类抗体(也可以使用其他的哺乳动物种类)的c或效应结构域的杂化蛋白质。根据本发明的第一方面中的抗体(i)可变区序列的优选例显示在图1和2中(SEQIDNO:123-126),其中的抗体是嵌合抗体的融合蛋白质的优选例是图7~17中和实施例中所示的嵌合抗体。尽管抗体在与抗原结合时通常为多价(在IgG的情况中为二价)，但本发明的蛋白质中的抗体(I)在一些阶段中优选为单价。典型的这种抗体是如下制造的单价抗体将氨基酸突变引入Fab中，或抗体的恒定区中，尤其是重链的恒定区(CH)中，从而防止重链之间的二好"建的常规形成，典型地，用另一种氨基酸残基取代Cys残基，尤其是抗体重链的铰链区中的Cys残基。其优选例在实施例中进行描述。"框架区"是轻链及重链可变区中的区域，正如在由Kabat等定义的区域的情况中其可以显著地保存在单一物种的各种抗体中(即，不同于CDR的区域)。在本发明中，"人类框架区，，是指基本上与天然存在的人类抗体或者某些这^^的抗体之间的^^共序列的片匡架区相同(同源性约为85%以上)的框架区。"人源化抗体"是包含人类框架和来自非人类抗体的至少一个CDR的抗体，人源化抗体的恒定区基本上与人类抗体的恒定区相同，即，同源性水平为至少约85%~90o/o，优选至少95%。因此，除CDR之外的人源化抗体每一部分有可能基本上与至少一个天然人类抗体序列的对应部分相同。例如，所述人源化抗体不包括包含小鼠可变区/人类恒定区的嵌合抗体。关于所述人类框架区，所述序列可以通过将由其获得CDRs的非人类抗体的框架或可变区的氨基酸序列与人类抗体序列集合中的对应序列进行比较，并选择具有高同源性的序列而获得。优选地，框架氨基酸序列的同源性为至少60%，更优选至少65%。另外，受体抗体的重链可变区的氨基酸序列选自人类抗体的重链可变区的典型集合中的5个，更优选为3个序列，这些序列与施主抗体的重链可变区的氨基酸序列具有最高同源性。人源化抗体的设计可以如下述完成。1)当特定氨基酸序列与下列范畴(a)~(c)相应时，人类抗体(受体抗体)的框架中该特定氨基酸可以由来自非人类抗体(施主抗体)的氨基酸取代。(a)所述受体抗体的人类框架区中的特定氨基酸很少在人类抗体的位置被发现，而施主抗体中的该对应氨基酸通常在人类抗体的^(立置,皮发现；(b)所述特定氨基酸临近或接近一级序列中的CDRs之一；或(c)所述特定氨基酸在施主抗体或人源化抗体的三维模型中在约5埃，优选4埃，更优选3埃的距离具有一个原子(Coetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991;88:2869)。2)当受体抗体的人类框架区中的特定氨基酸和施主抗体中的对应氨基酸在人类抗体的相应位置罕见时，所述氨基酸可由通常在人类框架的相应位置被发现的氨基酸取代。对于人源化抗体的制造的详细描述，可以参考Queenetal.,Proc,Natl.Acad.Sci.USA，1989'，86:10029,WO90/07861,WO92/11018、Coetal.,Proc，Natl.Acad.Sci.USA,1991;88:2869,CoandQueen,Nature,1991;351:501和Coeta1.，J.Immunol.,1992;148:1149,此处通过引用而引入。通常希望所有的或绝大部分的氨基酸取代达到上述标准。然而，由于不确定性与关于单个氨基酸是否实际上与上述标准相一致的判断体，因此CDR和FR的最优化可通过计算机模拟进行。当具有高同源性的人类抗体的V区被发现时，施主抗体的CDR序列，尤其是抗体F1024被移入该V区的框架部分，并且可以通过计算机分子模型来模拟所述构造。在该步骤中使用的程序包括ABMOD和ENCAD(Biochemistry，1990;29:10032)。通过该构造模拟，最优化可如下完成用其他氨基酸取代CDR附近的FR中的氨基酸，/人而使CDR区的氨基酸排列实现与CD14的最优化的结合活性。作为选择，CDR和FR的最优化也可以通过使用施主抗体，尤其是抗体F1024的FR的一部分的氨基酸序列(该序列中没有任何变化)，并将该序列移入人类抗体的V区中而实现。在这种情况中，抗体F1024的CDR和FR的一部分的序列被移入人类抗体的V区，并利用计算机分子模型模拟构造。可用于该步骤的示例性程序包括Modeler和QUANTA/CHARMm(MolecularSimulations)。当轻链中的3~4个部位和重链中的7~8个部位以来自施主，例如大鼠的氨基酸取代时，FR将具有与大鼠抗体相似的结构，CDR区中的氨基酸排列有助于优化与CD14的结合活性。只要抗CD14抗体的结合活性保持，单个或2个或2个以上的氨基酸的删除、取代、插入或添加就可以在CDR区的氨基酸中进^"。在这种情况中，当取代发生在被分为同组的氨基酸之间，例如在Gly禾口Ala之间；Val、Leu和lie之间；Asn和Gin之间；Cys和Met之间；或Lys和Arg之间，则抗CD14抗体的结合活性更有可能保持。另外，在框架区的某些位置的氨基酸涉及与抗原的直接相互作用，例如，以共价结合的方式与抗原接触，而且这样的位置也会经历上述取代。尤其是，在重链的第26个~第30个氨基酸根据其构造被描述为超变环的一部分(ChothiaandLesk，J.Mol.Biol.,1987;196:901-917)，并且这样的区域也可以如CDR的情况中一样一皮移植。人源化抗体基于所得的氨基酸序列制备。例如，人源化抗体的核苷酸序列可以根据由此确定的氨基酸序列确定，并由此制造编码该人源化单克隆抗体的基因。更具体地，编码CDR的DNA由编码人类V区的基因中删除，取代地插入编码来自诸如大鼠等施主的CDR的DNA。根据基于分子模型结果的变化的氨基酸，相应的DNA序列可通过例如使用PCR的定位诱变而改变，由此制造重组人类V基因。该基因被克隆为包含人类抗体的重链及轻链的C区的载体，从而制造表达载体。通过改变用于该阶段的来自人类的序列，可以制造所需亚纲的抗体，例如人类IgGl或IgG3，优选IgG4等。所述表达载体可以被引入小鼠骨髓瘤细胞Sp2-0-agl4(ATCCCRL1581)或仓鼠卵巢细胞CHO中并在其中被表达。所述人源化抗体用于人类的治疗处理时，与非人类抗体，如小鼠或大鼠抗体，在一些情况中为嵌合抗体相比具有至少三个潜在优点。1)由于有效部分来源于人类，因此抗体与人类免疫系统的其他部分的相互反应更好(例如，通过补体依赖的细胞毒性(CDC)或抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)可以更有效地破坏靶细胞)。2)人类免疫系统不识别作为异物的人源化抗体的框架或C区，因此，与完全是外来的小鼠抗体或部分外来的嵌合抗体相比，使用所述抗体时的该抗体的响应下降。3)据报道被施用的大鼠和小鼠抗体在人类的血液循环中具有的体内半衰期比正常抗体短得多(Shaw,D.etal.,J.Immunol.,1987;138:453(4538)。所述人源化抗体在施用后可能具有或多或少与天然存在的人类抗体的半衰期相似的半衰期，有效施用通过^[吏用较少的量或通过以较低的频率施用就可完成。抗CD14抗体(I)可包括各种抗体，尤其是各种人源化抗体，其具有在实施例中描述的抗体，尤其是F1024的CDRs中的至少一个，所描述的抗体在该抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)中优选具有位于相应位置的3个CDR，更优选具有该抗体的全部6个CDR。更具体地，抗CD14抗体(I)是包含表2中所描述的重链的CDR1、CDR2和CDR3作为所述重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3，或包含表2中所描述的轻链的CDR1、CDR2和CDRJ作为所述轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的抗体，尤其是人源化抗体。当抗CD14抗体(I)是人源化抗体时，用于制造的示例性方法包括其中的杂交瘤通过利用体外免疫作用导致人类淋巴细胞的活化而制造的方法；通过施用人类抗体噬菌体库执行的方法；和其中的杂交瘤通过使用具有重组人类抗体基因的非人类动物，尤其是诸如KM小鼠等转基因小鼠而制造的方法(WO2002/070648(JP2005-504507A)和WO2002/043478(JP2004-515230A))。根据本发明第三方面的载体包括其中的根据本发明第二方面的多核苷酸存在于单个载体上的情况，和其中的多核苷酸存在于2个或2个以上载体，例如2个或3个载体上的情况。根据本发明第三方面的载体除了包含根据第二方面的多核苷酸之外，还可以包含复制所述载体所需的成分和控制根据本发明第二方面的多核苷酸的表达的成分。用于与根据第二方面的多核苷酸结合的载体不受特别限制。不过所述载体优选为通常用于表达蛋白质基因的载体，尤其是适合于表达抗体或包含抗体的融合蛋白质的载体，或用于过表达的载体。示例性的优选载体包括包含人类延伸因子(EF)la启动子和/或CMV增强子的载体，例如，pEF-BOS或用于实施例的载体。尽管惯例是分别制备其中结合有编码VH部分，或VH部分与抑制部分，并优选VH部分和抑制部分的融合蛋白质的多核苷酸的表达载体，和其中结合有编码VL部分，或VL部分与抑制部分，并优选VL部分和抑制部分的融合蛋白质的多核苷酸的表达载体，且将这些载体在宿主细胞中协同转染，不过也可以将两种多核苷酸并入单个表达型造体中。上述过程可以通过使用已知的物质和方法进行，其典型例描述在实施例中。根据本发明第四方面的细胞可以通过本领域中的已知方法将根据本发明第三方面的载体引入适宜的宿主细胞中而制备。这样的细胞的实例包括杂种细胞、转化细胞和其中引入有本发明的多核苷酸或载体的基因修饰细胞。所用的宿主细胞不受特別限制，优选通常用于蛋白质基因等的表达的宿主细胞，尤其是适宜用于表达抗体、包含抗体的融合蛋白质等的细胞。示例性宿主细胞包括细菌(如E.COll)、放线菌、酵母、昆虫细胞(如SF9)和哺乳动物细胞(如COS-l、CHO和骨髓瘤细胞)，并优选哺乳动物细胞。上述过程可以通过使用已知的物质和方法进行，其典型例描述在实施例中。根据本发明第一方面的蛋白质可以通过使用根据本发明第二方面的多核苷酸或根据本发明第三方面的载体进行体外翻译而制造，或通过在适当的条件(本发明的第五方面)下培养根据本发明第四方面的细胞而制造。制得的蛋白质可以通过组合适宜的已知纯化方法而分离。其优选例描述在实施例中。根据本发明第六方面的用于疾病的预防和/或治疗剂可应用于各种疾病或病状，或与该疾病或病状有关的特定症状或疗效指标。尽管这些疾病、病状和特定的疗效指标不限于任何特定类型，但其优选为与CD14的分布或功能、蛋白酶的分布或功能或细菌感染有关的疾病。因此，本发明的预防和/或治疗剂可用于败血症及其相关疾病、全身疾病或心血管疾病、传染病、炎性疾病、呼吸道疾病或呼吸衰竭、自身免疫性疾病、多器官功能障碍综合征(MODS)或单个器官的衰竭或功能障碍。更具体地，本发明的预防和/或治疗剂可用于败血症及其相关疾病，如严重败血病、败血性ARDS和败血病性^木克；SIRS相关疾病；休克如内毒素休克、外毒素休克、出血性休克和外科手术进行时或手术后休克；全身或心血管疾病如缺血再灌注器官衰竭、局部击夬血性脑病，急性缺血性发作、急性期脑血栓、急性冠状微脉管栓塞、由休克导致的血管栓塞、弥漫性血管内凝血(DIC)、心肌梗塞及其后效应和低血压；感染性疾病如牙周病急性细菌性脑膜炎、侵袭性葡萄球菌感染症、传染性心内膜炎、极性病毒性脑炎和AIDS;炎性疾病如牛皮癣、胃炎、消化性溃疡、胰腺炎、肾炎、心肌炎、肺炎、肝炎、肝硬化、脑炎、骨关节炎、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、过敏性鼻炎、反流性食管炎和强直性脊柱炎；呼吸疾患或呼吸衰竭如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、婴儿呼吸窘迫综合症(IRDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气胂和哮喘；自身免疫性疾病如慢性风湿性关节炎、难治疗性结肠炎、克罗恩氏病、肾小球肾炎、SLE、硬皮病、多发性硬化和Sjoegren氏综合症；多器官功能衰竭；器官移植后的器官衰竭或排异；和单器官的功能障碍如心力衰竭、不稳定心绞痛、瓣炎、肾衰竭、心肌病、肾弛緩、肝衰竭和暴发性肝衰竭。败血病、败血性ARDS或败血病性-f木克、SIRS、内毒素休克和ARDS等疾病。本发明的预防和/或治疗剂还可用于改善或预防与炎性细胞因子增加，尤其是血液TNF浓度增加有关的状况。此外，本发明的所述试剂预期将具有对其中涉及LPS的革兰氏阴性细菌感染、其中涉及LTA或肽聚糖的革兰氏阳性细菌感染和与支原体感染有关的败血症的治疗及预防效果，即，在与这些疾病有关的状况出现或发展后的治疗效果，以及对于显示出高血液LPS值、LTA值或支原体值的患者，对于显示出特定CD14分子种类的高血液浓度的患者(参见WO01/22085和WO2004/44005),和被预料将显示这些状况的患者的预防效果。可根据需要结合的示例性药学上可接受的添加剂包括载体、赋形剂、稳定剂、润滑剂、着色剂、崩解剂、杀菌剂、等渗剂、稳定剂、分散剂、抗氧化剂、緩冲剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、通常用于本领域的适宜溶剂(例如，无菌水和植物油)以及生理学上可接受的助溶本发明的药物组合物还可以包含抗生素、类固醇、各种细胞因子抗体或抗凝血剂。这些试剂将关于本发明的蛋白质显示相加效应或协同效应，且所述药物组合物将具有改善的效果。本发明的药物组合物作为试剂施用时的剂量不受特别限制，所述诸如败血症、严重剂量可以通过考虑患者的状况、体重、年龄、性别等而适当的确定。在施用作为有效成分的本发明的蛋白质的典型情况中，所述剂量优选至少微0.1mg/kg，更优选1mg/kg~10mg/kg。用于施用作为试剂的本发明的药物组合物的剂型不受特别限制，优选剂型包括片剂、注射剂、粉末、栓剂、吸入剂，更优选注射剂和吸入剂。尽管可以使用各种给药途径，不过优选肠胃外给药。肠胃外给药利用注射剂通常以下列给药方式进行静脉给药(大丸剂给药、连续灌输、间歇灌输)、动脉内给药、皮下施用和肌内给药，同样优选使用吸入。其他给药途径包括直肠内给药、经皮吸收、关节内给药、经鼻给药和穿粘膜给药。给药方法可包括预防性给药、单独给药和连续给药，同时给药实时和给药频率取决于患者的状况。此外还提供了使用包含本发明的药物组合物作为其主要成分的试剂用于可对其应用根据本发明第六方面的预防和/或治疗剂的疾病或病^E的治疗方法。实施例下面，将参考决非限制本发明的范围的实施例对本发明进行更详细的描述。(实施例l)嵌合抗体和抗体融合蛋白质的构建l-l)嵌合抗体和抗体融合蛋白质(F1024)的构建(l)材料使用的主要材料和装置如下所述。引物表1中所示的引物(由SigmaGenosysJapan,K.K.合成)，用于PCR的酶ExTaq(TAKARABIOINC.),限制酶EcoRI、BamHI、No仏Nhel、EcoRV、Stul、BglII及其他(TAKARABIOINC.),基因组DNA:HeLa基因组(lot.N34707画l，BDBiosciencesClontech),PCR装置DNAEngine(MJRESEARCH,INC.)，琼脂糖电泳〗疑月史SeaKemGTGAgarose(TAKARABIOINC.)，50xTAE(2mol/LTns-乙酸酯，0.05mol/LEDTA)(NIPPONGENECO.,LTD.),分子量标记(以Styl消化的XDNA片段)，用于由凝胶提取DNA片段的试剂盒(QIAEXII,QIAGENK.K.),用于哺乳动物细胞的表达载体pEF2cew(由改进的pEF-BOS制造的载体)，包含人类IgG4重链恒定区(CY4)基因的质粒pTK-2232,TA克隆载体pT7BlueT(NOVAGEN)和连接剂TaKaRaligationKitver.2(TAKARABIOINC.)，E.coli感受态细胞JM109(TAKARABIOINC.),质粒DNA和基因组DNA纯化试剂盒(QIAGENK.K.),测序试剂盒DYEnamicETTerminatorCycleSequencingPremixKitlot.1767(AmershamBiosciences)和分析仪ABI3100geneticanalyzer(AppliedBiosystems),总RNA分离试剂TRIzol(GIBCOBRL),5'RACEkit:用于快速扩增cDNA端的5'RACE系统，v.2.0(InvitrogenCorporation),D函ecco,sMEM(SIGMA)，转染试剂FuGENE6(RocheDiagnosticsK.K.)(2)实验方法采用的主要实验方法如下所述。-PCRPCR根据酶的说明书进行。-琼脂糖凝胶电泳制备浓度为0.8%的琼脂糖凝胶，并将该凝胶放入充满1xTAE的电泳槽中，在将5viL样品施用至槽孔后，电泳在135V进行15分钟。完成电泳后，所述凝胶用溴化乙锭染色，并用UV检测条带。-由凝胶提取DNA片段将所关心的条带用剃刀切割，DNA片段根据所附说明书使用QIAEXII试剂盒从凝胶中提取。由此提取的DNA片段溶解在20无菌水中。P)杂交瘤抗体基因可变区的克隆和序列的确定(F1024)将通过WO02/42333中描述的方法制造的杂交瘤F1024(lx107细胞)用PBS-(SIGMA)洗涤，总RNA通过使用TRIzol(GIBCOBRL)提取。然后，5pg的总RNA通过使用用于快速扩增cDNA端的5'RACE系统，v.2.0(InvitrogenCorporation)经历5'RACE,并分别扩增编码重4连及轻链可变区的基因片段。所述步骤根据试剂盒所附说明书中的描述进行，重链可变区使用rlgH-c引物经历反转录，使用末端脱氧核苷酸转移酶在末端上进行dC添加，并使用rlgH-c引物和AAP引物(附于试剂盒)进行第一PCR。轻链可变区类似的经历使用rlgK-b引物的反转录，和使用rlgK-b引物和AAP引物的第一PCR。随后，第二PCR通过使用用于重链可变区的rlgH-b引物和AUAP引物(附于试剂盒)，及用于轻链可变区的rlgH-a引物和AUAP引物(附于试剂盒)，利用用于模板的反应产物而进行，由此特别扩增的DNA片段中的每一个通过琼脂糖凝胶电泳进行确认。由所述凝胶提取DNA片段后，确定核苷酸序列，相应区域的氨基酸序列也被确定(图1和2)。根据Kabat的定义的CDR序列显示在表2中。表2中所示的序列在SEQIDNO:173~178中描述。表2:抗体F1024的CDR氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>PCR通过使用用作模板的pTK-2232和引物对(IgG4-m和IgG4-s)及(IgG4-r和IgG4-v)进行，由此扩增各基因片段。这些基因片段被混合以用作模板，PCR通过使用另一引物对(IgG4-m和IgG4-v)而再次进行以扩增下述基因片段该基因片段具有由甘氨酸残基取代的重链二聚所需的2个半胱氨酸残基，并具有5'端的限制酶Nhel的识别序列以及取代终止密码子的3'端的限制酶BamHI识别序列。该片段用限制酶Nhel和BamHI切割以制备基因片段D。PCR通过使用包含人类UTI结构域1和结构域2(D1D2)的用于模板的质粒pM1213及引物对(UTI-a和UTI-c)进行，以扩增具有D1D25，端用于限制酶BamHI的识别序列，和3，端终止密码子直接相邻的下游用于限制酶Notl的识别序列的基因片段。该片段用限制酶BamHI和NotI切割以制备基因片段F。PCR通过使用用于模板的pM1213和引物对(UTI-h和UTI-c)进行以扩增具有在D1D2的5，端加入的包含4个甘氨酸残基的连接物和具有所述连接物直接相邻的上游的用于限制酶EcoRV的识别序列，以及具有在3'端的终止密码子的直^妄相邻的下游的用于限制酶Notl的识别序列的基因片段。该片段用限制酶EcoRV和Notl切割以制备基因片段K。PCR通过使用用于模板的pM1213和引物对(UTI-h和UTI-g)进行以扩增具有包含在D1D2的5'端加入的4个甘氨酸残基的连接物和所述连4^物直接相邻的前方的用于限制酶EcoRV的识别序列，并具有在除去3'端的终止密码子之后加入的包含4个甘氨酸残基的连接物以pT7BlueT载体中克隆该片l殳后，所述载体用EcoRV和BamHI切割，并连接基因片段I以构建包含D1D2D1D2序列的中间质粒。该质粒用BamHI和Stul切割以制备基因片段M。PCR通过使用用于模板的pM1213和引物对(UTI-i和UTI-g)进行以扩增具有在D2的5，端加入的包含4个甘氨酸残基的连接物和具有所述连接物直接相邻的上游的用于限制酶EcoRV的识别序列，并具有包含在除去3'端的终止密码子后加入的4个甘氨酸残基的连接物以及所述连接物直接相邻的下游的用于限制酶Stul的识别序列的基因片段。在pT7BlueT载体中克隆该片段后，所述载体用EcoRV和BamHI切割，并连接基因片段J以构建包含D2D2序列的中间质粒。该质粒用BamHI和Stul切割以制备基因片段N。表3:嵌合抗体-重链融合蛋白质和表达嵌合抗体轻链的质粒<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>(5)各融合蛋白质的小规模表达和被表达的融合蛋白质的纯化COS-l细胞在补充有10%胎牛血清的Dulbecco，sMEM中进行传代培养，并在转染的前一天，将所述细胞在培养容器中以1.5x105细胞/mL的密度进行接种。在第二天，将轻链表达质粒(pTK-2344)与各重链表达质粒以1:1的重量比混合，然后再与足够量的转染剂(FuGENE6，RoschDiagnostics)混合。将该混合物逐滴加入无血清的Dulbecco'sMEM中，通过用培养介质代替该介质进行细胞转染。所述细胞在5%C02的存在下在37。C培养23天，并收集上清液。纯化使用Prosep-A柱子(MILLIPORE)进行，以PBS(pH7.4)渗析后由280nm处的吸光率计算浓度。对照物通过将20pL因子Xa溶液与60^L稀释液混合，混合物在37。C培养5分钟，加入20^iLS-2222溶液，混合物在37。C培养30分钟，加入50iuL20。/()的乙酸溶液。图22中显示的结果证实保留了FXa抑制活性。F1031-13S-D2(3)的抑制活性通过使用类似的分析系统评价。(2)对于因子XIa的抑制活性F1024S-D2(3)和F1024D-D2(3)用稀释液(如上所述)连续稀释以制备用于测定抑制活性的样品。同时，人因子XIa(AmencanDiagnosticaInc.)用所述稀释稀释至750ng/mL，该溶液用作因子XIa溶液。人工合成底物S-2366(DaiichiPureChemicalsCo.,Ltd.)也用水稀释至5mM,该溶液用作S-2366溶液。制备各试剂后，将10用于测定抑制活性的样品、60^iL稀释液和10|uL因子XIa溶液放入96孔微量滴定板(Nunc)的孔中。在37。C培养5分钟后，将20pLS-2366溶液加入孔中，培养在37。C继续进行另外30分钟。然后通过将100)liL20。/。的乙酸溶液加入孔中而终止反应，测定波长为405nm的反应液的吸光率。使用的对照物通过以下来制备将70pL稀释液与10jaL因子XIa溶液混合，混合物在37。C培养5分钟，将20|LiLS-2366溶液加入混合物中，在37。C培养30分钟，加入100iuL20Q/q的乙酸溶液。图23中显示的结果展示了D2(3)的FXIa抑制活性。F1031-13S-D2(3)的抑制活性通过使用类似的分析系统评价。(3)对于弹性蛋白酶的抑制活性F1024S-D2(3)和F1024D-D2(3)用稀释液(如上所述)连续稀释以制备用于测定抑制活性的样品。同时，已经溶解在500mM氯化钠/50mM乙酸钠(pH5.5)中并被冷藏的Elastase,HumanNeutrophil(AthensResearch&Technology)用所述稀释液稀释至20|ug/mL,该溶液用作弹性蛋白酶溶液。人工合成底物S-2484(DaiichiPureChemicalsCo.,Ltd.)用二曱亚s风稀释并在低温下保存，在用作S-2484溶液之前立即用水稀释至2mM。制备各试剂后，将10用于测定抑制活性的样品、70pL稀释液和10弹性蛋白酶溶液放入96孔微量滴定板(Nunc)的孔中。在37。C培养3分钟后，将10S-2484溶液加入孔中，培养在37。C准确进行10分钟。然后通过将5020%的乙酸溶液加入孔中而终止反应，测定波长为405nm的反应液的吸光率。对照物通过以下制备将10iuL弹性蛋白酶溶液与80iuL稀释液混合而制备，混合物在37。C培养3分钟，加入10S-2484溶液，培养在37。C精确进行10分钟，加入5020%的乙酸溶液。图24中显示的结果证实保留了弹性蛋白酶的抑制活性。融合蛋白质F103卜13S画D2(3)和F1024D-SLPI(D1D2)、F1024D-SLPI(D2)、F1024S-SLPI(D1D2)或F024S-SLPI(D2)的抑制活性通过使用类似的分析系统评价。(4)血浆激肽释放酶F1024S-D2(3)和F1024D-D2(3)用稀释液(如上所述)连续稀释以制备用于测定抑制活性的样品。同时，来自人血浆的Kalliklein(Sigma-AldnchCo.)用所述稀释液稀释至20mU/mL,该溶液用作血浆激肽释放酶溶液。人工合成底物S-2302(DaiichiPureChemicalsCo.,Ltd.)用水也稀寿奪至4mM，该溶液用作S-2302溶液。制备各试剂后，将10用于测定抑制活性的样品、70nL稀释液和10血浆激肽释放酶溶液放入96孔微量滴定板(Nunc)的孔中。在37。C培养3分钟后，将10pLS-2302溶液加入孔中，培养在37°C继续进行另外30分钟。然后通过将50^L20。/o的乙酸溶液加入孔中而终止反应，测定波长为405nm的反应液的吸光率。对照物通过以下制备将10|uL血浆激肽释放酶溶液与80iaL稀释液混合，混合物在37。C培养3分钟，加入10|LiLS-2302溶液，在37。C培养30分钟，加入50iuL20o/()的乙酸溶液。结果显示在图25中。F1031-13S-D2(3)的抑制活性通过使用类似的分析系统评价。3-3)对于凝固的抑制活性的确认(1)活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)在人和兔中的延长的确认使用的正常人血浆是DadeCi-TrolLevell(DADEBEHRINGINC.)。兔血浆如下获得使用含有1/10体积3.8%柠檬酸钠(用于测定红细胞沉降率的柠檬酸钠，IwakiSeiyakuCo.,Ltd.)的注射器由雄兔(NewZealandwhite,2.6~2.7kg,KitayamaLabesCo.,Ltd.)的耳动脉采集血液，并在4。C和3000rpm(05PR-22,Hitachi)下离心分离10分钟。向113^L人血浆或兔血浆中，加入20pLF1024S-D2(3))溶液至最终浓度为0|ug/mL、1.56fig/mL、3.13|ug/mL、6.25|ug/mL、12.5)ug/mL、25|ug/mL、50(ig/mL和100jig/mL，将血浆放入血液凝固时间计(AMAXCS190，MCMedical,Inc.)中。由血液凝固时间计收集50pL,并在加入50APTT测定用试齐'J(DADEBEHRINGINC.)且培养2分钟后，加入5025mMCaCl2以测定凝固时间。结果发现F1024S-D2(3)浓度依赖性地延长了人和兔的APTT,并分别在浓度为9.06fig/mL和40.96|ug/mL时将人和兔的APTT延长了1.5倍。F1031-13S-D2(3)对于APTT的延长通过使用类似的分析系统进行评价。(实施例4)体内功效的评价4-l)融合蛋白质对于改善LPS诱导的家兔败血症模型的存活率的效果准备LPS诱导的家兔败血症致死模型，并检验通过融合蛋白质的后施用对存活率的改善。LPS诱导的家兔败血症模型根据Schimke等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:13875,1998)，通过以15吗/kg的剂量在0、5和24小时对家兔(NewZealandwhite,1.8~2.6kg,KitayamaLabesCo.，Ltd.)的耳静脉施用LPS(SalmondlaMinnesotaRe595，SIGMA)而准备。F1024S-D2(3)以1mg/kg的剂量在2、8和23小时施用于耳静脉。对照组被施用人免疫球蛋白而不是融合蛋白质。在施用后的48小时内监测存活率，绘制Kaplan-Meier存活曲线。结果发现相较于对照组施用F1024S-D2(3)改善了存活率。在同一分析系统中，施用F1024D-SLPI(D1D2)、F1024D-SLPI(D2)、F1024S-SLPI(D1D2)和F1024S-SLPI(D2)也具有改善存活率的作用。4-2)融合蛋白质对于改善LPS诱导的家兔败血症模型的炎症及凝固参数的效果准备LPS诱导的家兔败血症模型，并检验融合蛋白质的后施用对于炎症及凝固参数的效果。LPS诱导的家兔败血症模型#4居Schimke等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:13875，1998),通过以10貼/kg的剂量在0、5和24小时对家兔(NewZealandwhite,1.8~2.6kg,KitayamaLabesCo.，Ltd.)的耳静脉施用LPS(SalmonellaMinnesotaRe595，SIGMA)而准备。F1024S-D2(3)以0.1mg/kg、1mg/kg和3mg/kg的剂量在2、8和23小时施用于耳静脉。对照组被施用3mg/kg的人免疫球蛋白而不是融合蛋白质。在施用LPS之前和施用后1.5、25、26、28小时由耳动脉采集血液(添加柠檬酸)以测定炎症及凝固参数。使用的炎症参数是白细胞计数和血浆TNF浓度，使用的凝固参数是血小板计数和血浆抗凝血酶III的活性。白细胞计lt通过SysmexF-820(SysmexCorporation)测定。TNF-a浓度通过夹心ELISA使用纯化的山羊抗兔TNF多克隆抗体(BDBiosciences)和生物素化的小鼠抗兔TNF-a单克隆抗体(BDBiosciences)测定。抗凝血酶III的活性通过TESTZYMATIII2试剂盒(DaiichiPureChemicalsCo.,Ltd.)测定。当测定的浓度等于或高于0.4ng/mL(夹心ELISA的检测限)时血浆中的TNF-a浓度评价为"阳性"，当测定值小于0.4ng/mL时为"阴性"。结果发现与对照组相比，被施用F1024S-D2(3)的组显示出对于白细胞计数降低(图27)、血浆中的TNF-a浓度增大(表4)、血小板计数降低(图28)和抗凝血酶m的活性降低(图29)的剂量依赖性的改善。这些结果证明通过F1024S-D2(3)改善了炎症及凝固参数。在同一分析系统中，与对照组相比，施用F1031-13S-D2(3)的组显示对于白细胞计数降低、血浆中的TNF-a浓度增大、血小板计数降低和抗凝血酶III的活性降低的改善效果。表4:首次施用LPS后25小时在LPS诱导的家兔败血症模型的血浆中的TNF-a浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>4-3)融合蛋白质对于改善LPS诱导的家兔败血症模型的血压降低的效果准备LPS诱导的家兔败血症模型，并检验融合蛋白质的后施用对于改善血压降低的效果。LPS诱导的家兔败血症模型根据Schimke等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:13875,1998)，通过以5)ug/kg的剂量在0和5小时对家兔(NewZealandwhite,1.8-2.6kg,KitayamaLabesCo.,Ltd.)的耳静脉施用LPS(SalmonellaMinnesotaRe595,SIGMA)而准备。F1024S-D2(3)以1mg/kg的剂量在LPS的首次施用后2小时施用至耳静脉。对照组被施用1mg/kg的人免疫球蛋白而不是融合蛋白质。在施用LPS之前和施用后4、6和8小时，插入颈动月永的导管与血压传感器(DT-XX,JapanBDMedicalSystems)连接以测定平均动脉血压。结果发现，与对照组相比，施用F1024S-D2(3)的组显示出对血压降低的改善。在同一分析系统中，与对照组相比，施用F1031-13S-D2(3)的组显示出对于血压降低的改善效果。(实施例5)稳定制造抗体融合蛋白质的菌林的建立5-l)表达用于制造F1024S-D2(3)或F1024D-D2(3)的菌林的质粒的构建用于建立能够稳定制造F1024S-D2(3)或F1024D-D2(3)的菌林的表达质粒通过下述步骤构建。实施例1中构建的表达F1024S-D2(3)的重链的质粒pTK-2370和表达F1024D-D2(3)的重链的质粒pTK-2368用EcoRI和Kpnl分别消化以回收约为1.7kb的片段。具有小鼠DHFR表达单位和EFlot启动子的表达质粒pM103(参见W097/42319)也用EcoRI和Kpnl消化以回收具有约7.9kb的片段。将通过消化表达重链的质粒获得的片段与通过消化pMll(B荻得的片段连接，用于制造生产菌的表达F1024S-D^3)的重链的质粒pEFD"70和表达F1024D-D2(3)的重链的质粒pEFD2368通过本领域中常用的方法转化JM109感受态细胞而制造。同时，轻链表达质粒对F1024S-D2(3)和F1024D-D2(3)是相同的，该质粒通过下述步骤构建。用于短暂表达的质粒pTK-2344被BamHI消化，变为平末端，并用EcoRI进一步消化以回收0.7kb的片4爻。pM1103用Kpnl消化，并在末端变平后用EcoRI消化以回收约7.9kb的片段。将通过消化pTK-2344获得的片段与通过消化pM1103获得的片段连接，用于制造生产菌的表达轻链的质粒pEFD2344通过本领域中常用的方法转化JM109感受态细胞而制造。5-2)制造F1024S-D2(3)和F1024D-D2(3)的转化林的建立实施例5-l)中构建的表达重链和轻链的质粒在DHFR基因缺失型CHO细胞中共转染以建立用于合成嵌合抗体融合蛋白质的CHO转化体。更具体地，来自包含HT培养基补充物(50x)Hybri-Max(SIGMA,在最终浓度为lx下使用)和200mML-Glutamine(SIGMA,在最终浓度为4mM下使用)的EX-CELL325PFCHO(JRHBioscience)的条件培养基的CHODXB11在转染当天进行离心分离，并在培养瓶中以8x106细胞/150Roux的浓度接种。12.5iug表达重链的质粒和12.5iug表达轻链的质粒(即，pEFD2370+pEFD2344，或pEFD2368+pEFD2344)根据FuGENE6所附方案通过4吏用125FuGENE6(RocheDiagnosticsK.K.)制备，并且它们如上所述在CHODXB11中共转染。在37。C和5%C〇2的存在下培养2天后，收集细胞，并用包含4mML-Glutamine的无HT的EX画CELL325PFCHO培养基(以下称为EX-CELL(HT隱))洗涤所述细胞一次，然后用PBS-洗涤一次，并再次悬浮在EX-CELL(HT-)中。接着，所述细胞以3,000细胞/孔~48，000细胞/孔重新接种在96孔板中，在37。C和5%C〇2的存在下培养所述细胞，培养基的一半用新的EX-CELL(HT-)以3天或4天的间隔置换。培养约1个月后，其中已经形成菌落的孔的细胞被移至新板，培养物上清液中嵌合抗体的量通过实施例2中描述的EIA步骤测定。获得上清液中嵌合抗体的表达已被确认的细胞作为制造嵌合抗体融合蛋白质的转化林。5-3)使用氨曱喋呤的基因扩增通过在包含氨曱喋呤(以下称为MTX)的EX-CELL(HT-)培养基上选择性地培养实施例5-2)中制造的表达嵌合抗体融合蛋白质的CHO转化抹来进行基因扩增从而选择以高产率制造所关心的嵌合抗体融合蛋白质的克隆。(1)CHO-F1024SC93t3Ll的建立在上述5-2)中制造的用于合成F1024S-D2(3)的转化抹悬浮在包含100nMMTX的EX-CELL(HT-)培养基中，并接种在96孔板中，培养基的一半用包含100nMMTX的新鲜的EX-CELL(HT-)每3天或4天更换。培养在37。C和5%C02的存在下持续进行直至形成菌落。所得菌落通过EIA评价其表达，并选择不断合成的克隆。选定的克隆随后悬浮在包含300nMMTX的EX-CELL(HT-)培养基中，并植入96孔板以用于选择性培养。进行与使用100nMMTX的选择性培养类似的过程以由此获得具有约20倍高的生产率的转化抹。通过使用具有3~10倍高的MTX浓度的培养物以重复进行选择性培养过程也可以获得具有更高生产率的克隆。(2)CHO-F1024DC78ul的建立上述5-2)中制造的用于合成F1024D-D2(3)的转化抹以与实施例5-2)的步骤类似的步骤进行处理以制造具有更高生产率的菌抹。使用MTX的选择性培养首先在MTX的浓度为100nM下进行，然后在浓度为1000nM下进行以由此获得制造F1024D-D2(3)的克隆，其浓度以EIA测定为约60|ug/mL。(实施例6)与F1024抗体结合所需的序列的分析6-l)表达氨基酸取代型可溶性人类CD14的质粒的构建为分析由F1024抗体识別的区域，制备表5中显示的31种氨基酸取代型可溶性人类CD14。应当注意具有的由可溶性CD14分子的N端计算的263rdAsn被Gln取代的1氨基酸取代型CD14被指定为"N263Q",其他的1氨基酸取代型CD14以相同的方式指定。同时，294thPro和296thPro均被Ala取代的2氨基酸取代型CD14被指定为"P294/2%A"。表达这些取代型CD14的质粒通过下述步骤构建。首先，表达具有氨基酸取代型修饰sCD14(1307)的质粒通过与在WO02/42333或US2004/0092712中描述的用于构建表达氨基酸取代型多肽的质粒时的方法类似的方法构建。例如，表达具有引入其中的P294H、P294/296A、Q295A或P296H的氨基酸取代型修饰sCD14(1~307)如下构建设计表6中显示且编码氨基酸替代序列的引物组，并将该引物组用于PCR。编码氨基酸取代部位的密码子以粗体(下划线)显示(表6)。然后，其中引入有氨基酸取代的DNA片段通过使用重组PCR而制造以构建表达可溶性人类氨基酸取代型CD14的质粒。更具体地，P294H、P294/296A、Q295A和P296H表达质粒通过下述步骤构建。合成正向引物S1(5，-GCGGCAGTATGCTGACACGG-3，)、正向引物S2(5，-GATAACCTGACACTGGACGGGAATCCCTTC画3，)和正向引物S3(5，-GCCATCCAGAATCTAGCGCT-3，)；以及反向引物A1(5，-GAAGGGATTCCCGTCCAGTGTCAGGTTATC-3，)，反向引物A2(5，-ATTAGCCAGAAGTCAGATGCTC-3，)和反向引物A3(5，-GGGCATTGGCCACACCAGC-3')。PCR通过<吏用用于才莫一反的上述表达氨基酸取代型修饰sCD14(1~307)的质粒中的每一种并使用正向引物Sl和Al进行。扩增产物通过电泳分离并纯化(PCR产物A)。PCR也可以通过使用用于模板的pCAG356，并使用正向引物S2和A2进行，扩增产物通过电泳分离并纯化(PCR产物B)。PCR还可以通过使用用于模板的PCR产物A与PCR产物B的混合物并使用正向引物S3和A3进行，PCR产物通过电泳分离并纯化(PCR产物C)。接着，PCR产物C用PvuII和Kpnl消化，约为0.2kb的片段通过电泳分离并收集。同时，pCAG356用PvuII和Kpnl被类似地消化，约为5.8kb的片段通过电泳收集，该片段与上述约为0.2kb的片段连接。E.coliXLl-Blue(STRATGENE)通过本领域中的普通方法转化，以制造所需的表达质粒。应当注意pCAG356是通过将来自在WO02/42333中描述的sCD14表达质粒pM1656的CD14基因(具有在GRI锚定部位引入的突变)插入pCAGGS中而制造的质粒(GENE,第15巻(1989)，第269-277页)。[表5]表5:氨基酸取代的可溶性人类CD14<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>[表6]表6:引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>6_2)氨基酸取代型可溶性人类CD14的表达将上面7-l)中制备的表达质粒通过下述步骤引入COS-l细胞。50luLFuGENE6(RocheDiagnosticsK.K.)与12.5jag各种质粒DNA才艮据所附方案混合，将混合物加入在150cm2培养瓶中生长至semiconfluency的COS-l细胞中。所述细胞在37。C和5。/。002的存在下培养3~4天，以用于表达上清液中的人类氨基酸取代型CD14。所述表达通过EIA使用WO02/42333中描述的CD14抗体确认。然后对表5中描述的除了N263Q、L276A、L283A、N288A和L290A之外的全部取代产物的表达进行确认。6-3)氨基酸取代型可溶性人类CD14的纯化可溶性人类氨基酸取代型CD14通过下述步骤纯化。上面6-2)中制造的培养物上清液流经固定有用于选择性吸附的抗人CD14抗体(3C10)的亲合性纯化柱(NHS-activatedSepharose4FastFlow;AmershamBiosciences),所述柱用10mMHC1洗脱。洗脱部分通过加入10xPBS—(SIGMA)而立即中和至高于最终浓度两倍的浓度。所述溶液随后用生理盐水进行渗析，渗析液用作纯化样本。6-4)用于F1024抗体的对比试验对比试验通过下述步骤进行以确认各种可溶性人类氨基酸取代型CD14与F1024抗体的反应性。首先，可溶性CD14分子(356(CHO);制造方法描述在下面的6-5)中)用PBS—稀释至4ng/mL，并以50iuL/孑L放入％孔板(F8MaxiSorp;NUNC)中。在允许其在4。C静置一夜并用包含0.05%Tween20的PBS-洗涤三次后，将包含2%StabilGuard的PBS(SurModics,Inc.)以200^L/孔加入孔中，溶液在37。C培养30分钟并在4。C储藏。同时，已在实施例6-3)中纯化的氨基酸取代型可溶性人类CD14用包含0.1%BSA的PBS-稀释至2jug/mL~0.02pg/mL,HRP标记的F1024抗体用包含0.1%BSA的PBS-稀释至2^ig/mL，将稀释的HRP标记的F1024抗体与等量的人类氨基酸取代型CD14混合(25+25pL)。然后，将溶液由固定有可溶性CD14的板的各孔中排出，加入50^L/孔的氨基酸取代型CD14与HRP标记的F1024的混合溶液。在37。C培养2小时后，所述板用包含0.05%Tween20的PBS-洗涤5次，并将50)LiL/孔的TMB溶液(BioFX)加入孔中作为发色底物。使反应在室温下进4于5分钟，并通过添加50iliL/孔的1M盐酸溶'液而终止反应。用平板分光光度计测定450nm处的吸光率。结果显示在图31中，其中涉及不添加氨基酸取代型CD-14的吸光率(]00%)。在图31中，356(CHO)显示加入固定用可溶性CD14分子时的吸光率。吸光率在氨基酸取代型CD14的许多情况中浓度依赖地下降，这证实它们与F1024抗体的结合可与356(CHO)竟争。然而，在P294H、P294/296A、Q295A和P2%H的情况中，吸光率的下降并未被证实与其浓度无关，可以确定与F1024抗体的结合没有发生(图31)。这些结果证明CD14中的29他、295th和296th的Pro、Gin及Pro是与F1024抗体结合时的关键区域。6-5)可溶性人类CD14分子(356(CHO))的制备可溶性人类CD14分子(356(CHO))通过使用CHO细胞由下述步骤制备。(1)表达质粒的构建WO02/42333中描述的pM1656用HindIII消化，所述片段通过DNABluntingKit(TAKARABIOINC.)使末端变平。然后用Xbal消化，约为1.4kb的片段通过电泳分离并回收。具有小鼠DHFR表达单位和EF]a启动子的表达质粒用Notl消化，所述片段通过DNABluntingKit(TAKARABIOINC.)使末端变平。该片段随后用Xbal消化，约为8.0kb的片段通过电泳分离并回收。将来自pM1656的约为1.4kb的片段插入约为8.0kb的片段以用于连接，该片段然后用于转化E.cohJM109以由此制造表达质粒356(CHO)。(2)表达3兄(CHO)的转化抹的建立该表达质粒被引入DHFR基因缺失型CHO细胞中以建立表达356(CHO)的转化林。更具体地，将50FuGENE6(RocheDiagnosticsK.K.)与12.5pg质粒DNA根据FuGENE6所附方案混合，并将混合物添加至在150cn^培养瓶中已通过使用包含10%失活的FBS的Ham'sF-12i咅养基(InvitrogenCorpomtion)而生长至semiconfluency的CHODXB11细胞。在37。C和5%C02的存在下培养一夜后，所述细胞在第二天通过使用胰蛋白酶进行分离和回收，并通过使用包含10%失活的渗析FBS的a-MEM(不包含核糖核苷或脱氧核糖核苷)(InvitrogenCorporation)(以下称为选择性培养基)将所述细胞再次植入96孔板中。培养。在37。C和5%C02的存在下持续进行，培养基的一半用新鲜的选择性培养基每3天或4天更换。连续培养3~4周后，将观察到菌落发育的孔中的细胞移至新板中，培养物上清液中制造的可溶性CD14的量通过使用WO02/42333中描述的CD14抗体的EIA分析。显示大量表达的编号为P3的克隆被建立为表达可溶性CD14的菌抹。(3)使用氨甲喋呤(MTX)的基因扩增为增强356(CHO)的表达，在包含MTX的选择性培养基中进行P3克隆的选择性培养，由此通过基因扩增以增大其产量。更具体地，在实施例6-5)(2)中制造的P3克隆悬浮在包含15nMMTX的选择性培养基中，并将所述细胞植入10cm的培养皿中。所述培养基的一半每3天或4天用包含15nMMTX的新鲜的选择性培养基替换，培养在37。C和5%C02的存在下进行直至观察到菌落形成。所得菌落在板中进行传代培养，上清液中的356(CHO)的量通过EIA确认从而获得表达量增大的克隆P3-54。(4)356(CHO)的制造和纯化在上面的6-5)(3)中制造的P3-54克隆在选择性培养基中进行培养，上清液中表达的356(CHO)通过重复实施例6-3)的步骤被纯化。(实施例7)抗体融合蛋白质(F1024S-D2)的UTI结构域2的修饰7-l)F1024S-D2的UTI结构域2的修饰型的制备例如，在用丙氨酸取代UTI结构域中15th精氨酸(表示为R15A)的情况中，设计并合成用于编码将引入突变的部位及其近旁的部位的约10个氨基酸的引物。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>然后，通过使用用于模板的pTK-2355并使用每种引物对[IgG4-w和D2-R15A-s]及[pEF2ce-27和D2-R15A-a]再次进行PCR。将所得扩增产物混合并通过使用引物对[IgG4-w和pEF2ce-27](表8)再次进行PCR。扩增产物用限制酶BamHI和Notl切割，并进行琼脂糖凝胶电泳。提取各片4爻后，通过T4DNA连接酶将它们与已由BamHI和Notl进行类似切割的pTK-2355的载体部分连接，以由此构建能够表达其中引入R15A突变的修饰F1024S-D2的重链的质粒(pTK-2730)。该质粒与轻链表达质粒(pTK-2344)在C0S-1细胞中进行共转染以用于表达培养物上清液中的F1024S-D2(R15A)。确认上清液中的表达之后，表达产物用Prosep-A柱纯化。通过使用类似的步骤，制备表9中显示的80个F1024S-D2的UTI结构域2的修饰型，并确认它们保留了与CD14抗原的结合能力。表9中显示的修饰UTI结构域2的氨基酸序列显示在图32~35中。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表9<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>7-2)经修饰的F1024S-D2的弹性蛋白酶抑制活性通过重复实施例3-2)(3)中的步骤对如上制备的F1024S隱D2的80个修饰型和F1024-D2(3)评价其弹性蛋白酶抑制活性，不同之处在于在加入S-2484溶液后在37。C培养5分钟。结果确认来自下列表达质粒的融合蛋白质(经修饰的F1024S-D2)显示出与F1024S-D2(3)的弹性蛋白酶抑制活性相同的弹性蛋白酶抑制活性。pTK-2730(R15A),pTK-2737(R151)、pTK画2739(R15L)、pTK-2740(R15M)、pTK-2745(R15T)、pTK-2746(R15V)、pTK画2866(R11S/R15T/Q19A/Y46D)、pTK-2867(Rl1S/R15T/Q19C/Y46D)、pTK-2868(RllS/R15T/Q19D/Y46D)、pTK-2869(R11S/R15T/Q19E/Y46D)、pTK-2870(Rl1S/R15T/Q19F/Y46D)、pTK-2871(RllS/R15T/Q19G/Y46D)、pTK國2872(R11S/R15T/Q19H/Y46D)、pTK-2873(Rl1S/R15T/Q19I/Y46D)、pTK-2874(RllS/R15T/Q19L/Y46D)、pTK-2875(R11S/R15T/Q19M/Y46D)、pTK-2876(Rl1S/R15T/Q19N/Y46D)、pTK-2877(RllS/R15T/Q19P/Y46D)、pTK-2878(Rl1S/R15T/Y46D)、pTK画2879(Rl1S/R15T7Q19R/Y46D)、pTK-2880(R11S/R15T/Q19S/Y46D)、pTK画2881(Rl1S/R15T/Q19T/Y46D)、pTK-2882(RllS/R15T/Q19V/Y46D)、pTK-2883(R11S/R15T/Q19W/Y46D)、pTK-2884(Rl1S/R15T/Q19Y/Y46D)、pTK-2889(RllS/R15T/F17A/Y46D;)、pTK-2890(R11S/R15T/F17C/Y46D)、pTK-2891(Rl1S/R15T/F17D/Y46D)、pTK-2892(RllS/R15T/F17E/Y46D;)、pTK陽2932(Rl1A/R15T/Y46D)、pTK-2893(RllS/R15T7F17G/Y46D)、pTK-2933(Rl1C/R15T/Y46D)、pTK-2895(RllS/R15T/F17H/Y46D)、pTK陽2934(Rl1D/R15T/Y46D)、pTK-2896(R]lS/R15T/F17I/Y46D)、pTK-2935(Rl1E/R15T/Y46D)、pTK-2897(RllS/R15T/F17L/Y46D)、pTK-2936(Rl1F/R15T/Y46D)、pTK-2898(RllS/R15T/F17M/Y46D)、pTK-2937(Rl1G/R15T/Y46D)、pTK画2899(RllS/R15T/F17N/Y46D)、pTK画2938(Rl1H/R15T/Y46D)、pTK画2900(RllS/R15T/F17P/Y46D)、pTK-2939(Rl1I/R15T/Y46D)、pTK-2901(RllS/R15T/F17Q/Y46D)、pTK陽2940(Rl1K/R15T/Y46D)、pTK-2902(RllS/R15T/F17R/Y46D)、pTK-2941(Rl1L/R15T/Y46D)、pTK-2903(RllS/R15T/F17S/Y46D)、pTK陽2942(Rl1M/R15T/Y46D)、pTK-2904(RllS/R15T/F17T/Y46D)、pTK-2943(Rl1N/R15T/Y46D)、pTK-2905(RllS/R15T/F17V/Y46D)、pTK-2944(Rl1P/R15T/Y46D)、pTK-2906(RllS/R15T/F17W/Y46D)、pTK-2945(Rl1Q/R15T/Y46D)、pTK-2907(RllS/R15T/F17Y/Y46D)、pTK陽2946(R15T/Y46D)、pTK陽2947(R11T/R15T/Y46D)、pTK-2948(Rl1V/R15T/Y46D)、pTK陽2949(R11W/R15T/Y46D)、pTK画2950(Rl1Y/R15T/Y46D)、pTK-2824(R11S/R15I/Q19K/Y46D)、pTK-2825(Rl1S/R15L/Q19K/Y46D)、pTK画2826(RllS/R15T/Q19K/Y46D)、pTK-2827(R11S/R15V/Q19K/Y46D)特别是，来自表达质粒pTK-2826(RllS/R15T/Q19K/Y46D)的融合蛋白质显示的50%抑制浓度为4.43|ug/mL，与F1024S-D2(3)的50%抑制浓度8.卯ng/mL形成对比，证明通过用苏氨酸取代D2(3)蛋白质的15th精氨酸可提供增强的蛋白酶抑制活性。图36是描述融合蛋白质F1024-D2(4)(R11S/R15T/Q19K/Y46D)的全部氨基酸序列的浮见图。(实施例8)抗体融合蛋白质(F1024S-凝血调节蛋白(TM)功能结构域)8-l)F1024S-TM表达质粒的构建为制造具有TM的各种功能结构域的抗CD14抗体(F1024S)的融合蛋白质，PCR通过使用用于模板的HeLa基因组DNA和引物对(TM-b和TM-g)进行，以扩增全部基因长度的人凝血调节蛋白(以下称为TM)，扩增产物通过TA克隆法在pT7-Blue载体中进行克隆。确认所述序列后，该质粒被制定为pT7-TM。然后，PCR通过使用用于模板的pT7-TM和引物对(TMD123456和TM结构域2-NotlBgl2)进行，在用限制酶BamHI和BglII切割由此扩增的片ll并与预先制备的载体(通过用限制酶BamHI切割实施例1、表3中描述的pTK-2354,随后脱磷酸而制备)混合后，使用T4DNA连接酶连接所述片段以由此制造能够表达包含在其上添加的TM的氨基酸序列中具有227th半胱氨酸至462nd半胱氨酸的区域(Cys227~Cys④)的F1024S的融合蛋白质(指定为F1024S-TM123456M)的重链的质粒pTK-2754。该步骤通过使用引物对(TMD123456和TM结构域3-NotlBgl"进行重复以制备能够表达具有其上添加的氨基酸序列的227th半胱氨酸至497th丝氨酸的区域(Thr263~Ser柳)的融合蛋白质(指定为F1024S-TM1234567M)的重链的质粒pTK-2755;通过使用引物对(TMD23456和TM结构域2-NotlBgl2)以制备能够表达具有其上添加的氨基酸序列的263rd苏氨酸至462nd半胱氨酸的区域(Thr263~Cys462)的融合蛋白质(指定为F1024S-TM23456M)的重链的质粒pTK-2756;通过使用引物对(TMD23456和TM结构域3-NotlBgl2)以制备能够表达具有其上加入的263rd苏氨酸至497th丝氨酸的区域(Thr263~Ser497)的融合蛋白质(指定为F1024S-TM234567M)的重链的质粒pTK-2757;通过使用引物对(TMD3456和TM结构域2-NotlBgl2)以制备能够表达具有其上加入的306th谷氨酰胺462nd半胱氨酸(Glu3。6~Cys啦)的区域的融合蛋白质(指定为F1024S-TM3456M)的重链的质粒pTK-2758;通过使用引物对(TMD3456和TM结构域3-NotlBgl2)以制备能够表达具有其上添加的306th谷氨酰胺497th丝氨酸的区域(Glu3Q6~Ser497)的融合蛋白质(指定为F1024S-TM34567M)的重链的质粒pTK-2759;通过使用引物对(TMD456和TM结构域2-NotlBgl2)以制备能够表达具有其上添加的345th缬氨酸462nd半胱氨酸的区域(Val345~Cys462)的融合蛋白质(指定为F1024S-TM456M)的重链的质粒pTK-2760;以及通过使用引物对(TMD456和TM结构域3-NotlBgl2)以制备能够表达具有其上添加的345th缬氨酸497th丝氨酸的区域(Val345Ser497)的融合蛋白质(指定为F1024S-TM4567M)的重链的质粒pTK-2761。同时，为防止由于TM的氧化而导致的活性下降，其中氨基酸序列中的388th蛋氨酸(Met，)已经被亮氨酸(Leu)取代的突变体(M388L)也可通过下述步骤(Clarke，JH.etal.，J.Biol.Chem.268,6309-6315(1993))制造，即，使用用于模板的pT7-TM和各引物对[TMD123456和TM(M388L)-a]及[TM结构域2-NotlBgl2和TM(M388L)-s]进行PCR,将各扩增产物混合，并使用引物对(TMD123456和TM结构域2-NotlBgl2)再次进行PCR。编码包含M388L突变体的227th半胱氨酸~462nd半胱氨酸的区域(Cys227toCys^)的基因片段由此扩增。如上所述，该片段用限制酶BamHI和BglII切割，并使用连接酶与载体连接以构建能够表达包含抗体分子F1024S(具有其上添加的包含M388L突变体的由227th半胱氨酸至462nd半胱氨酸的TM的区域(Cys227~Cys啦))的融合蛋白质(指定为F1024S-TM123456L)的重链的质粒pTK-2762。最终构建的质粒是能够表达包含引入pTK-2755中的突变体M388的融合蛋白质的重链(F10MS-TM12345671^々pTK-2冗3;能够表达包含引入pTK-2756中的突变体M388L的融合蛋白质(指定为F1024S-TM23456L)的重链的pTK-2764;能够表达包含引入pTK-2757中的突变体M388L的融合蛋白质指定为F1024S-TM234567L)的重链(的pTK-2765;能够表达包含引入pTK-2758中的突变体M388L的融合蛋白质(指定为F1024S-TM3456L)的重链的pTK-2766;能够表达包含引入pTK-2759中的突变体M388L的融合蛋白质(指定为F1024S-TM34567L)的重链的pTK-2767;和能够表达包含引入pTK-2760中的突变体M388L的融合蛋白质(指定为F1024S-TM456L)的重链的pTK-2768;以及能够表达包含引入pTK-2761中的突变体M388L的融合蛋白质(指定为F1024S-TM4567L)的重链的pTK-2769。使用的引物序列显示在表10中，抗CD14抗体的融合蛋白质和表达质粒显示在表11中。抗CD14抗体(F1024S)的融合蛋白质的氨基酸序列显示在图37~44以及序列表中。图45是说明融合蛋白质F1024-TM23456L的全部氨基酸序列的视图。表10<table>complextableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>[表12]表11<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>这些质粒与轻链表达质粒(pTK-2344)在COS-l细胞中共转染以表达培养物上清液中的F1024S-TM。该上清液使用Prosep-A柱纯化以用于随后的分析。使用EIA进行的结合测试确认所述融合蛋白质具有对于CD14抗原的结合活性。8-2)凝血调节蛋白(TM)活性的测定利用凝血调节蛋白(TM)与血液中的凝血酶形成复合体以激活作为用于该活性指标的凝血抑制因子的蛋白质C的作用可测定TM活性。测定如下进^"。用于活性测定的反应在复式管中进行。所述融合蛋白质用包含0.14mol/L氯化钠、10mmol/L氯化钓和1mg/mL牛血清白蛋白(pH7.4)的25mmol/LTns-HCl緩冲液稀释。向40)uL样品中加入10|uL6U/mL人凝血酶(SIGMA)，并在37。C预培养10分钟。然后，加入10|liL24|ug/mL蛋白质C(AmericanDiagnosticaInc.)，所得混合物在37。C培养5分钟。加入40|uL0.15U/mL抗凝血酶III(GreenCrossCorporation)与15U/mL肝素(MochidaPharmaceuticalCo.，Ltd.)的混合物，并将该混合物在3"C培养10分钟。加入100|uL3.2mmol/L活化蛋白质C底物S-2366(DaiichiPureChemicalsCo.,Ltd.),将混合物在37。C培养10分钟后，所述反应通过添加20050%的乙酸而终止。将300pL反应溶液转移至96孔平板中，-使用平板读取器(MolecularDevicesCorporation)测定405nm处的吸光率。人凝血调节蛋白MR-33(MochidaPharmaceuticalCo.,Ltd.)用于正控制。结果发现所有的F1024S-TM融合蛋白质均具有促进蛋白质C活化的活性，而且F1024S-TM23456M、F1024S-TM234567M、F1024S-TM23456L和F1024S画TM234567L具有促进促进蛋白质C活化的高活性。M388L突变体也显示了相对高的活性(图46)。(实施例9)抗体融合蛋白质(F1024S-SLPI)中的连接蛋白质的变化9-l)表达质粒的构建将连接物SG-4-s(5'pGATCTGGAGGTGGAG3，，具有磷酸化的5，端)与连接物SG-4-a(5，pGATCCTCCACCTCCA3，，具有磷酸化的5'端)混合，并将混合物在96。C培养2分钟。温度逐渐降至室温以用于退火。将足够量的混合物与预先制备的载体片段(通过用限制酶BglII切割实施例1中描述的pT7-SLPI(D2),脱去磷酸，进行琼脂糖凝胶电泳并由凝胶中提取片段而制备)混合，并通过T4DNA连接酶连接所述片段。通过该过程，构建包含具有其上添加的1个GGGGS连接物复本的SLPI(D2)的质粒pTK-2729。该pTK-2729用限制酶BglII切割，并通过重复上述过程，构建包含具有其上添加的2个GGGGS连接物复本的SLPI(D2)的pTK-2749和包含具有其上添加的3个GGGGS连接物复本的SLPI(D2)的pTK-2750。接着，pTK-2729、pTK-2749和pTK-2750用限制酶BglII和Notl切割以制备编码加上SLPI(D2)的所述连接物的一部分的基因片段(所得片段被分别指定为片段1、片段2和片段3)。正如在实施例1中构建pTK-2396的情况(表3),将基因片段A与D通过T4DNA连接酶进行片段连接以构建表达具有修饰连接物，在抗体分子与SLPI(D2)之间分另ll具有连4妻物GSGGGGS、GSGGGGSGGGGS矛口GSGGGGSGGGGSGGGGS的F1024S-SLPI(D2)的重链的质粒(分别指定为pTK-2751、pTK-2752和pTK-2753)。这些质粒与轻链表达质粒(pTK-2344)在COS-1细胞中共转染以表达培养物上清液中具有修饰连接物的F1024S-SLPI(D2),上清液通过Prosep-A柱纯化。全部纯化产物均被确认具有对CD14抗原的结合活性。表12和13显示引物对和连接物的SEQIDNOS。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>9-2)F1024S-SLPI的弹性蛋白酶抑制活性通过重复实施例3-2)(3)的步骤来评价1024D-SLPI(D1D2)、F1024D-SLPI(D2)、F1024S-SLPI(D1D2)和F1024S-SLPI(D2),以及具有其上添加的1、2或3个GGGGS连接物复本的SLPI(D"的融合蛋白质的弹性蛋白酶抑制活性，不同之处在于加入S-2484溶液后在37。C培养5分钟。对照组如下制备将10弹性蛋白酶溶液与80^L稀释液混合，在37。C培养3分钟，加入10S-2484溶液，在37。C精确培养5分钟，之后加入50juL20%乙酸溶液。F1024S-SLPI(D1D2)和F1024S-SLPI(D2)的50%抑制浓度分别为22.5|ug/mL和26.9ng/mL,具有其上添加的1、2和3个GGGGS连接物复本的SLPI(D2)的融合蛋白质的50%抑制浓度分别为11.6pg/mL、11.9vig/mL和11.6)dg/mL。(实施例10)人源化抗体(hF1024S-D2(!3))的制备在数据库中寻找大鼠抗体F1024-l-3的重链及轻链可变区的氨基酸序列，这些序列被分别确定与人抗体IGHV7-81(BC032733)和HUMIGRFFM(L48242)具有很高的同源性。因此，通过将抗体F1024的轻重链的3个互补决定区(CDR)植入(1)IGHV7-81和HUMIGRFFM(以下称为RF)或(2)已经通过晶体结构分析进行彻底分析的NEW、Eu和REI(参见图47)的各框架(FR)中可进行人源化。基于各氨基酸序列(图48)设计核苷酸序列，通过将核苷酸序列分为数个部分并对其进行分析而制备全部6个基因片段。各片段用重链pTK-2370和轻链pTK-2344的可变区替换以构建表达质粒(重链pTK-2887用于IGHV7-81-HA,pTK-2679用于NEW画HA,pTK-2685用于Eu-HA;轻链pTK-2955用于RF-KA,pTK-2680用于REI-KA，pTK-2681用于Eu-KA)。C0S-1细胞与该质粒和嵌合抗体表达质粒(pTK-2370用于重链，pTK-2344用于轻链)的各种组合体共转染，对于上清液中分泌的抗体比较其与GPVI抗原的结合活性。关于重链，在所有情况中均发现由于人源化而导致的表达量的明显下降。考虑到该状况，将各种突变体引入FR中，并对结果进行检测。同时，证实了对于轻《连的表达和结合活性。对于三种人源化重链表达质粒，通过构建大量突变体，其中FR中的人特异性序列的一部分恢复为来自大鼠的序列，并分析这样的构建体可以最终获得维持表达和结合活性的序列(pTK-2909用于IGHV7-81-HC,pTK-3007用于IGHV7-81-HX,pTK-2803用以NEW-HB,pTK-2811用于Eu-HB)(图49显示了所述氨基酸序列)。最后，检测人源化重链和人源化轻链的组合，显示了最高表达与结合活性的组合是IGHV7-81-HX与RF-KA或其他轻链的组合。其他抗体融合蛋白质的抗体部分通过类似的步骤人源化。(实施例U)能够以高产率稳定制造抗体融合蛋白质F1024S-D2(3)的菌抹的制造1-1能够以高产率稳定表达F1024S-D2(3)的质粒(pTK-2671)的制造通过使用用于模板的、表达F1024S-D2(3)的重链的短暂表达质粒(实施例1中描述的pTK-2370)并使用表14中所示的引物对(F1024H-kozak,IgG4-l)进行PCR。扩增产物用限制酶EcoRI和Nhel切割，并在琼脂糖凝胶电泳后提取包含抗体F1024的重链可变区的基因片段(片段U)。使用的引物对的SEQIDNOS显示在表14中。<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>pTK-2370用限制酶Nhel和Sse83871切割，并在琼脂糖凝胶电泳后提取包含F1024S-D2(3)的重链恒定区、编码D2(3)的基因序列和SV40polyA信号的基因片段(片段V)。表达F1024的轻链的质粒(实施例1中描述的pTK-2344)用限制酶BsiWI和Ncol切割，并在琼脂糖凝胶电泳后提取包含抗体F1024的轻链可变区的基因片段(片段W)。包含EF启动子、人轻链恒定区和小鼠DHFR表达单位(包含SV40启动子(不包括增强子区域)作为启动子，和来自SV40的polyA信号)的质粒(pTK-2577)用限制酶BsiWI和EcoRI切割，并在琼脂糖凝胶电泳后提取所关心的载体片段(片段X)。同时，该质粒也用Sse83871和Ncol切割，并在琼脂糖凝胶电泳后提取包含EF启动子区域的基因片段(片段Y)。基因片段U至Y使用T4DNA连接酶(TAKARABIOINC.)连接为一个片段以构建稳定表达质粒(pTK-2671),该质粒能够同时表达F1024S-D2(3)的重链和轻链，并且包含小鼠DHFR表达单位用作已将所述质粒引入其中的细胞中的标记。通过使用类似的步骤，也可以构建用于其他抗体融合蛋白质的能够以高产率进行稳定表达的质粒。(实施例12)功效(体外)的评价12-1)对于舒緩激肽合成的抑制作用的确认(l)对于由APTT试剂诱导的人及兔血浆中舒緩激肽的合成的抑制作用的确认使用的正常人血浆是DadeCi-TrolLevell(DADEBEHRINGINC.)。兔血浆如下制备使用含有1/10体积3.8%柠檬酸钠(用于测定红细胞沉降率的柠檬酸钠，IwakiSeiyakuCo.,Ltd.)的注射器由雄兔(NewZealandwhite,KitayamaLabesCo.,Ltd.)的耳动脉采集血液，并在4。C和3000rpm(05PR-22，Hitachi)下将血液离心分离10分钟。向80pL人或兔血浆中加入邻二氮杂菲溶液后，加入已经一皮稀f奪液连续稀释的F1024S-D2(3)溶液至最终浓度为0|ug/mL、1pg/mL、3lug/mL、10)ug/mL和30)Lig/mL，或者加入人免疫球蛋白(hlg)至最终浓度为30|ug/mL。搅拌后血浆在37。C培养10分钟。将80|uL用Milli-QWater稀释的APTT试剂加入，血浆进一步在37。C培养10分钟。收集100|uL血浆，并加入20pL舒緩激肽测定用试剂盒(Markit-Mbradykinin,DainipponPharmaceuticalCo.,Ltd.)所附的脱蛋白质剂，该血浆在4'C和10000rpm(MRX-150,TOMY)下离心分离10分钟。通过使用舒緩激肽测定用试剂盒测定所得上清液的舒緩激肽浓度。结果发现F1024S-D2(3)浓度依赖性地抑制了由APTT试剂诱导的人及兔血浆中的舒緩激肽的合成(图51和51)。12-2)对于凝固抑制作用的确认(1)对于由凝血调节蛋白诱导的人血浆中的凝血酶的合成的抑制作用(因子XI依赖地)的确认向包含人血小板为3x105~L的人血浆和包含兔血小板为3x10VfiL的兔血浆中，加入F1024S-D2(3)溶液至最终浓度为0|ug/mL、3]ug/mL、10fig/mL、30jag/mL、100)ug/mL和300)ug/mL,或者力口入人免疫球蛋白(hlg)至最终浓度为300pg/mL。血浆然后在37。C预培养10分钟。加入用25mmol/LCaCl2溶液稀释8000倍的凝血调节蛋白(SimplastinExel，BIOMERIEUX,INC.)的溶液后在37。C开始培养。在加入凝血调节蛋白溶液之前和加入凝血调节蛋白溶液之后收集5)uL培养液，并加至100)uLBufferB(50mmol/LTris-HCl緩冲液(pH7.9),包含0.5mg/mLBSA、0.1mol/LNaCl和20mmol/LEDTA)与252mmol/LS-2238的混合物中，所述混合物在37。C培养10分钟。加入100ViL50体积％乙酸后，将反应液以200)liL/孔添加至％孔々反，并通过平板读取器(Thermomaxmicroplatereader，MolecularDevicesCorporation)测定405nm处的吸光率。结果发现F1024S-D2(3)浓度依赖性地抑制了由凝血调节蛋白诱导的人及兔血浆中的凝血酶的合成(图52~53)。12-3)凝固抑制作用的确认(l)人ATPP延长作用的确认通过与实施例3-3)(l)的步骤类似的步骤，使用人类正常人血浆，分别评价最终浓度为2.00|ug/mL、2.00|iig/mL、1.95ing/mL和2.29|ug/mL的实施例8中制备的F1024S-TM23456M、F1024S-TM23456L、F1024S-TM234567M和F1024S-TM234567L的APTT延长作用。结果，APTT通过所述4个融合蛋白质被分别延长了26%、32%、42%和57%。(实施例13)体外测试的功效评价13-l)F1024S-D2(3)的抗炎作用的确认将10mg/kgF1024S-D2(3)由耳静脉施用于家兔(NewZealandwhite,1.8~2.6kg,KitayamaLabesCo.，Ltd.),并随着斗宁4蒙酉臾的力口入采集血液。将LPS(WE.coli055:B5，DIFCO)加入所采集的血液中至最终浓度为1ng/mL,血液在37。C培养4小时。在4。C和10000rpm(MRX-150,TOMY)下离心分离血液10分钟，所得血浆通过ELISA使用抗兔TNF-a抗体测定其TNF-a浓度。结果发现直到施用F1024S-D2(3)后24小时为止LPS刺激的血液中的TNF-a的合成被抑制(图54)。13-2)F1024S-D2(3)的抗凝血作用的确认通过在采集血液后立即进4亍离心分离而获得的实施例6-l)中的血浆用于活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的测定。APTT的测定通过重复实施例3-3)的步骤进行。结果发现直到施用F1024S-D2(3)后8小时为止APTT被延长(图55)。(实施例14)体内功效的评^介14-1)家兔CLP(盲肠结扎穿孔)样本制造家兔CLP(盲肠结扎穿孔)腹膜炎样本，确认施用F1024S-D2(3)后存活率和凝固参数的改善。盲肠结扎穿孔致家兔腹膜炎样本如下制取利用Keith,A等的方法(JournalofSurgicalResearch,29:189，1980),在麻醉下刺穿家兔(NewZealandwhite,1.8~2.6kg,KitayamaLabesCo.,Ltd.)的盲肠，并将盲肠内容物喷洒在腹腔中。2小时后，将10mg/kgF1024S-D2(3)施用至耳静脉，之后，F1024S-D2(3)施用3天，每天2次。对照组被施用人免疫球蛋白(hlg)以代替F1024S-D2(3)。检测存活率并记录72小时以绘制Kaplan-Meier存活曲线。盲肠结扎穿孔后8小时，采集添加有柠檬酸的血液，测定D二聚物作为血浆的凝固参数。结果发现相比于对照组，施用了F1024S-D2(3)的组的存活率(图56)和D二聚物(图57)均得到改善。图56和57的对照组的概要描述显示在表15中。[表16]表15<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>权利要求1.一种蛋白质，所述蛋白质包含(I)抗CD14抗体或其活性片段，或其衍生物和(II)蛋白酶的抑制剂，或其活性片段，或其衍生物。2.如权利要求1所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是蛋白质抑制剂。3.如权利要求1或2所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是多价酶抑制剂。4.如权利要求1~3中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是凝血因子(凝血蛋白酶)或炎性蛋白酶。5.如权利要求1~4中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是FXa和/或FXIa。6.如权利要求1~4中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是凝血酶。7.如权利要求1~6中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于UTI。8.如权利要求1~6中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于凝血调节蛋白。9.如权利要求1~6中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于UTI结构域2。10.如权利要求1~8中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于凝血调节蛋白的功能结构域，尤其是EGF样结构域。11.如权利要求1~4中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是弹性蛋白酶。12.如权利要求1~4中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是分泌性白细胞蛋白酶抑制剂。13.如权利要求1~11中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是具有1~4个氨基酸取代的UTI结构域2的突变体。14.如权利要求1~13中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是具有中和活性的抗体。15.如权利要求1~14中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是识别人类CD14的氨基酸号269-315的至少一部分的抗体。16.如权利要求1~15中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是嵌合抗体。17.如权利要求1~16中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是人源化抗体。18.如权利要求1~17中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是下述抗体该抗体包含表2中所描述的重链的CDR1、CDR2和CDR3作为所述重《连可变区中的CDR1、CDR2和CDR3,或表2中所描述的轻链的CDR1、CDR2和CDR3作为所述轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3。19.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求1~18中任一项所述的蛋白质的至少一部分。20.—种载体，所述载体包含如权利要求19所述的多核苦酸。21.—种细胞，所述细胞包含如权利要求19所述的多核苦酸或如权利要求20所述的载体。22.—种方法，所述方法用于制造如^L利要求1~18中任一项所述的蛋白质，该方法使用如权利要求19所述的多核苷酸、如权利要求20所述的载体和如^l利要求21所述的细胞中的至少一种。23.—种疾病的预防和/或治疗剂，所述疾病的^^贞防和/或治疗剂包含如权利要求1~18中任一项所述的蛋白质、如冲又利要求19所述的多核普酸、如权利要求20所述的载体和如权利要求21所述的细胞中的至少一种。24.如权利要求23所述的预防和/或治疗剂，其中，所述疾病是败血症、严重败血症或败血病性〗木克、SIRS相关疾病、内毒素^f木克或ARDS。全文摘要本发明公开了一种蛋白质，所述蛋白质包含(I)抗CD14抗体或其活性片段或所述抗体的衍生物或片段和(II)能够抑制蛋白酶的物质或其活性片段或所述物质的衍生物或片段。文档编号C12N15/09GK101189334SQ20068001920公开日2008年5月28日申请日期2006年6月5日优先权日2005年6月3日发明者中山和行,中村正树,保坂义隆,古迫正司,川原哲史,武内隆志申请人:持田制药株式会社