专利名称：：抗cd20单克隆抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及针对人CD20抗原的单克隆抗体。本发明进一步涉及通过基因重组产生的嵌合抗CD20单克隆抗体和人源化抗CD20单克隆抗体，以及包含这些抗体中的任一种作为活性成分的用于B细胞介导的肿瘤或免疫疾病的治疗剂。
背景技术：
：作为识别CD20抗原的单克隆抗体，已知Bl、2B8(嵌合抗体名为rituximab)、1F5、2H7等。首先，由美国IDECPharmaceuticalsCorporation开发的嵌合抗CD20单克隆抗体rituxknab已经被建立作为^f氐恶性非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin，slymphoma;NHL)的标准治疗剂，并且发现对于许多B细胞介导的免疫疾病具有治疗效果。例如，除了慢性淋巴性白血病等恶性肿瘤之外，据称其对于自身免疫溶血性贫血症、特发性血小板减少症紫癜等涉及病原性自身抗体的自身免疫疾病，和慢性风湿性关节炎或多发性硬化症等炎症性疾病是有效的(非专利文献14-17)。CD20是存在于B淋巴细胞表面的分子，发现它存在于外周血、脾脏、扁桃体、骨髓等的正常B细胞中，以及大多数恶性肿瘤的B细胞中。该分子包含297个氨基酸残基，穿透细胞膜四次，在细胞内同时具有C末端和N末端二者，并且在第三和第四跨膜域之间具有无糖链的由43个氨基酸残基组成的唯一曝露于细胞外的环(非专利文献1和9)。CD20分子被i人为通常作为四聚物存在，并且与其它小量成分一起进一步形成异源复合物(杂络物；heterocomplex)(非专利文献18)。由于CD20蛋白不分泌至细胞外并且不—皮切割，除此之外，其几乎不通过抗体结合被吸纳进入细胞，所以能够预见基于抗体而针对耙细胞的细胞毒性机制可有效地发挥作用(非专利文献1至3)。尽管CD20的分子尺寸小，其表现出多样化的表位，一部分原因来自它们作为细胞外复合物的表达形式产生的影响，以及与其结合的抗体介导多种不同的生物应答。例如，B细胞受体的负调节、MHC类II抗原和粘着分子表达的增加、在超交联(hyper-cross-linking)存在下Ca"释放的活化、与淋巴细胞功能相关的抗原1非依赖性同型粘着的抑制、凋亡的诱导或相反的对细胞增殖的促进等活性变化显著(非专利文献4至13)。代表性抗CD20抗体rituximab、Bl、1F5和2H7也具有不同的特性和生物学功能，仅提及"结合于CD20的单克隆抗体"无法指定其生物学性质。构成CD20胞外域的分子是不溶性的。尽管能够通过使用表面活性剂或强碱将源自细胞溶解物或作为基因重组蛋白的CD20分子溶解，在这种处理条件下保持天然的三维结构却是困难的。因此，将CD20阳性B细胞抹用作为了获得抗体的免疫原，然而，其免疫刺激性质弱，获得成熟抗体产生细胞的克隆并不容易。2005年至今，'j、鼠/人嵌合抗体rituximab是唯一经认可作为治疗剂的抗CD20单克隆抗体。由于与异源分子的嵌合分子具有抗原性，通常不优选它们作为治疗剂。然而，抗CD20抗体具有靶向和消除包括正常细胞在内的所有B细胞的性质，因此可以说它们基本上不具抗原性。然而，尽管仅占几个百分比，但已经报导了在处理期间中和抗体被诱导的实例，诱导将更有可能依赖于给药剂量和给药期间。因此，有望开发出具有与人相近的序列的人源化抗体或人抗体。嵌合抗体的另一缺点是血内半衰期短，并且p半衰期仅为3或4天。在美国的临床研究中，单独投予rituximab对于低恶性度NHL复发的有效率略低于50%，说明rituximab对50%以上的患者无效或效果差。对患有中恶性度NHL的患者的有效率更低，仅为大约30%(非专利文献14)。因此，有必要研究患者中不同反应的原因和背景，并且同时有望开发出具有优良效果的抗体。非专利文南史1:LeukocyteFactBook2ndEdition,AcademicPress非专利文献2:StashenkoPetal.,J.Immunol"1980,125:1678-85非专利文献3:AndersonKCetal.,Blood,1984,63:1424-33非专利文献4:ShanDetal.,Blood,1998,91:1644-52非专利文献5:FliegerDetal.，CellImmunol"2000，204:55-63非专利文献6:MathasSetal.,CancerRes.,2000,60:7170-6非专利文南夫7:CardarelliPMetal.,CancerImmunol.Immimother.,2002,51:15-24非专利文献8:PedersenIMetal.,Blood,2002,99:1314-9非专利文献9:DeansJPetal.,Imminol,,2002,107:176-82非专利文献10:GolayJTetal.,J.Immunol.,1992,149:300-8非专利文献11:BourgerIetal.,Eur.J.Immunol.,1993,23:768-71非专利文献12:WhiteMWetal.，J.Immunol.,1991,146:846-53一一专矛J文南大13:ShanDetal.,CancerImmunol.Immnother.,2000,48:673-83非专利文献14:Coi伍erBetal.,Blood,1998,92:1927-32非专利文献15:EdwardJCetal.,Rheumatology(Oxford),2001,40:205-11非专利文献16:ZajaFetaL,Heamatologica,2002,87:189-95非专利文献17:PerrottaSetal.，Br.J.Haematol.，2002,116:465-7非专利文献18:PolyakMJetal.,Blood,2002,99:3256-6
发明内容本发明的课题是提供具有优于常规抗CD20单克隆抗体治疗剂的生物学功能的单克隆抗体。本发明人通过以任意组合使用两种或两种以上的CD20抗原阳性B细胞抹、通过基因工程制造的在其细胞膜上表达人CD20抗原的哺乳动物细胞、以及与谷胱甘肽S转移酶(glutathioneS-transferase;GST)蛋白融合的人CD20蛋白作为免疫原，来获得特异性结合至人CD20抗原的鼠源抗CD20单克隆抗体。其中某些在无效应细胞的体外CD20表达细胞培养中，具有包括凋亡等直接的细胞增殖抑制活性。此外，与凋亡等细胞增殖抑制活性的存在与否无关，包括其它选择的鼠源抗CD20单克隆抗体，通过嵌合化将这些抗体赋理想生物学活性的抗体的氨基酸序列人源化，制备出能够用作治疗剂的抗CD20单克隆抗体。由此完成本发明。本发明提供以下内容。(1)一种鼠源抗CD20单克隆抗体，其在不存在效应细胞的CD20抗原表达细胞培养中，对人CD20抗原表达细胞具有包括凋亡的细胞增殖抑制活性。(2)根据(1)的抗CI)20单克隆抗体，其中所述H链可变区的氨基酸序列和L链可变区的氨基酸序列是SEQIDNOS:1和7、SEQIDNOS:2和8或SEQIDNOS:15和17。(3)—种杂交瘤，其产生根据(1)或(2)的抗CD20单克隆抗体。(4)一种嵌合抗CDM单克隆抗体，其中将根据(2)的抗CD20单克隆抗体可变区的氨基酸序列和人免疫球蛋白恒定区的氨基酸序列融合。(5)—种抗CD20单克隆抗体，其通过使用根据(2)的抗CD20单克隆抗体可变区的互补性决定区域(CDR)的氨基酸序列和人免疫球蛋白的氨基酸序列人源化。(6)根据(5)的人源化抗CD20单克隆抗体，其中所述H链可变区的氨基酸序列和L链可变区的氨基酸序列的组合是SEQIDNOS:19和23、SEQIDNOS:19和24、SEQIDNOS:19和25、SEQIDNOS:19和26、SEQIDNOS:20和23、SEQIDNOS:20和24、SEQIDNOS:20和25、SEQIDNOS:20和26、SEQIDNOS:21和23、SEQIDNOS:21和24、SEQIDNOS:21和25、SEQIDNOS:21和26、SEQIDNOS:22和23、SEQIDNOS:22和24、SEQIDNOS:22和25或SEQIDNOS:22和26的组合。(7)根据(4)-(6)任一项的抗CD20单克隆抗体，在人补体存在下，所述抗CD20单克隆抗体对CD20抗原表达细胞具有细胞毒性。(8)—种哺乳动物细胞，其并入编码根据(4)至(7)任一项的抗CD20单克隆抗体氨基酸序列的碱基序列。(9)根据(8)的哺乳动物细胞，其为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。(10)—种鼠源抗CD20单克隆抗体，其中所述H链可变区的氨基酸序列和L链可变区的氨基酸序列的组合是SEQIDNOS:3和9、SEQIDNOS:4和10、SEQIDNOS:5和11、SEQIDNOS:6和12或SEQIDNOS:16和18的组合。(11)一种杂交瘤，其产生根据(10)的抗CD20单克隆抗体。(12)—种嵌合抗CD20单克隆抗体，其中将根据(10)的抗CD20单克隆抗体可变区的氨基酸序列和人免疫球蛋白恒定区的氨基酉M列融合。(13)—种抗CD20单克隆抗体，其通过使用根据(10)的抗CD20单克隆抗体可变区CDR的氨基酸序列和人免疫球蛋白的氨基S吏序列来进行人源化。(i勺根据(12)或(13)的抗CDM单克隆抗体，在人#卜体存在下，所述抗CD20单克隆抗体对CD20抗原表达细胞具有细胞毒性。(15)—种哺乳动物细胞，其并入编码根据(12)至(14)任一项的抗CD20单克隆抗体氨基酸序列的碱基序列。(16)根据(15)的哺乳动物细胞，其为CHO细胞。(n)—种诊断剂，其包含根据(2)、(4)至(7)、(10)和(12)至(14)任一项的抗CD20单克隆抗体作为有效成分。(18)—种治疗剂，其包含根据(4)至(7)和(12)至(14)任一项的抗CD20单克隆抗体作为有效成分。如上定义的单克隆抗体氨基酸序列中的氨基酸可以用其它氨基酸置换，只要其二级结构和生物学性质没有显著改变，并且这些如上所述将氨基酸序列改变的单克隆抗体同样在本发明的范围之内。附图简述重组抗体表达用载体pNOW-Ab的结构。[图2]蛋白表达用载体pNOW-Ag的结构。[图3]人CD20基因克隆用引物的序列。鼠源抗CD^单克隆抗体H链和L链可变区的氨基酸序列。使用鼠源抗CD20单克隆抗体的凋亡试验的结果。使用鼠源抗CD20单克隆抗体的细胞增殖抑制试验的结果。人源化抗CD20单克隆抗体H链和L链可变区的氨基酸序列及其相应的^咸基序列。人源化抗CD20单克隆抗体H链和L链可变区的氨基酸序列及其相应的^咸基序列。使用人源化抗CD20单克隆抗体的细胞增殖抑制试验的结果。实施本发明的最佳方式在本发明中，所用术语"抗体"的意思包含通常意义上的抗体、构成它的H链和L链，及其片段。本发明涉及结合至细胞膜上人CD20抗原的、具有有望诱导出治疗效果的生物学活性的抗CD20单克隆抗体。根据本发明的第一实施方式的抗体是特异性结合至细胞膜上人CD20抗原的单克隆抗体，并且在无效应细胞辅助的CD20抗原表达细胞培养中，所述单克隆抗体对人CD20抗原表达细胞具有包括凋亡的细胞增殖抑制活性。所述单克隆抗体原为鼠源抗CD20单克隆抗体，并且进一步包括通过嵌合化或人源化该抗体而获得的抗CD20单克隆抗体。在无效应细胞辅助的CD20抗原表达细胞体外培养中，这些抗体对人CD20抗原表达细胞具有包括凋亡的直接的细胞增殖抑制活性。这些嵌合化或人源化的抗CD20单克隆抗体具有#卜体依赖性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。对于细胞膜上CD20抗原的结合性，能够通过CellELISA进行调查，其中将SB细胞和Raji细胞等CD20表达细胞附着于平板上，并且与待试验的单克隆抗体反应。然而，由于这些细胞的CD20抗原表达水平不充分，所以反应性不敏感。因此，在本发明中开发的CellELISA方法，将通过基因重组大量表达CD2。的CII()细胞(CD20/CHO细胞)附着于平板上，并且与待试—验的单克隆抗体反应。在本发朋的预备试验中，确认在单克隆抗体反应性试验中，使用CD20/CHO细胞的CellELISA显示出类似于使用SB细胞或Raji细胞的CellELISA中的相同图式(pattem),并且显示高敏感性(参见实施例CD20/CHOCellELISA筛选方法的确立，表1)。在无效应细胞的人CD20抗原表达细胞体外培养中的直接的细胞增殖抑制活性能够通过常规方法测定(MiyamotoTetal.,AvianDis.,Vol.46(1),10-16)。此外，凋亡诱导能力能够通过使用流式细胞术(膜联蛋白V/碘化丙锭(propidiumiodide;PI)染色)的试验来测定。根据第一实施方式的抗体的实例包括具有H链可变区氨基酸序列和L链可变区氨基酸序列SEQIDNOS:1和7、SEQIDNOS:2和8或SEQIDNOS:15和17所规定氨基酸序列的组合的小鼠抗CD20单克隆抗体，以及通过嵌合化或人源化这些抗体获得的抗CD20单克隆抗体。在无效应细胞辅助的CD20抗原表达细胞体外培养中，这些抗体对人CD20抗原表达细胞呈现包括凋亡的直接的细胞增殖抑制活性。这些抗体还具有补体依赖性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。本发明还包括产生鼠源抗体的杂交瘤，和并入相应于任一嵌合抗体或人源化抗体氨基酸序列的碱基序列的哺乳动物细胞(实施例中的CHO细胞)。嵌合化通过将鼠源单克隆抗体H链可变区的氨基酸序列和人免疫球蛋白H链恒定区的氨基酸序列、L链可变区的氨基酸序列和人免疫球蛋白L链恒定区的氨基酸序列融合来进行(IshidaTetal.,NipponRinsho,Vol.60,No3,439-444)。将人源化抗体设计成通过使用鼠源单克隆抗体可变区CDR的氨基酸序列和人免疫球蛋白的氨基酸序列。优选作为治疗剂的人源化抗CD20单克隆抗体通过比较各种设计的抗体的特性来选4奪(PadlanEA,Mol.Immunol.,Vol.28,No4/5，489-498;WuTTandKabatEA,Mol.Immunol.,Vol.29，No9,1141-1146;PadlanEAetal.,FASEBJ.，Vol.9,133-139)。嵌合化或人源化抗CD20单克隆抗体还具有补体依赖性细胞毒性(complement-dependentcytotoxicity;CDC),以及在安文应细月包存在下具有4元体依赖寸生细月包介导的纟田月包毒寸生(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity;ADCC)。对于有关这些CDC和ADCC的试验方法，可参照通常使用的方法(ManchesOetal"Blood，2003，101(3)，949-54;IdusogieEEetal.,J.Immunol"2000,164,4178-4184)。人源化抗CD20单克隆抗体的具体实例包括，具有H链可变区氨基酸序列和L链可变区氨基酸序列SEQIDNOS:19和23、SEQIDNOS:19和24、SEQIDNOS:19和25、SEQIDNOS:19和26、SEQIDNOS:20和23、SEQIDNOS:20和24、SEQIDNOS:20和25、SEQIDNOS:20和26、SEQIDNOS:21和23、SEQIDNOS:21和24、SEQIDNOS:21和25、SEQIDNOS:21和26、SEQIDNOS:22和23、SEQIDNOS:22和24、SEQIDNOS:22和25或SEQIDNOS:22和26所示氨基酸序列的组合的那些抗体。根据本发明的第二实施方式的抗体是特异性结合至细胞膜上人CD20抗原的鼠源单克隆抗体，并且不呈现包括凋亡的细胞增殖抑制活性，或以不高的水平呈现这些活性。然而，这些鼠源抗体能够通过嵌合化或人源化获得CDC或ADCC活性。这些细胞毒性活性也是重要的生物学活性，并且因此第二实施方案的抗CD20单克隆抗体也能够作为治疗剂的良好候选。根据第二实施方式的抗体的实例包括具有H链可变区氨基酸序列和L链可变区氨基酸序歹'JSEQIDNOS:3和9、SEQIDNOS:4和10、SEQIDNOS:5和11、SEQIDNOS:6和12或SEQIDNOS:16和18的组合的鼠源抗CD20单克隆抗体，以及通过嵌合化或人源化这些抗体获得的抗CD20单克隆抗体。本发明还包括产生鼠源抗体的杂交瘤，和并入相应于任一嵌合抗体或人源化抗体氨基酸序列的碱基序列的哺乳动物细胞(实施例中的CHO细胞)。用于测定对于细胞膜上CD20抗原的结合性的方法，用于测定细胞增殖抑制、凋亡、ADCC、CDC等的各种试验方法，和嵌合抗体或人源化抗体的制备方法，与用于第一实施方式的抗体时提及的方法类似。能够预期如第一实施方式和第二实施方式的抗体所描述的嵌合抗CD20单克隆抗体和人源化抗CD20单克隆抗体二者均呈现作为治疗剂的优良效果，用于B细胞介导的恶性肝瘤和涉及B细胞或涉及由B细胞产生的抗体的免疫性疾病，并且本发明的目的是将它们使用在治疗剂的开发中，所述治疗剂包含嵌合抗CD20单克隆抗体或人源化CD20单克隆抗体中的任一、优选人源化抗CD20单克隆抗体作为有效成分。目标疾病的实例包括非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴性白血病、急性淋巴性白血病、慢性风湿性关节炎、自身免疫溶血性贫血症、特发性血小板减少症紫癜、系统性红斑狼疮、抗磷脂抗体综合征、舍格伦综合征(Sjogren，ssyndrome)、克罗恩氏病(Crohn'sdisease)、石更皮病(scleroderma)、多发性石更化症、I型jf唐尿病等。本发明的鼠源单克隆抗体能够通过以下方法制备。作为用于致敏的免疫原，可组合使用作为表达人CD20抗原的细胞才朱的SB细胞、Raji细胞和表达人CD20抗原的CHO细胞。此外，可将与GST融合的人CD20蛋白(GST-CD20)用作补充性敏化抗原。产生单克隆抗体的杂交瘤能够通过一系列步骤制备，其包括(l)待免疫动物(小鼠)的免疫，(2)从免疫动物制备淋巴细胞，(3)制备亲本细胞，(4)淋巴细月包和亲本纟田月包的细月包融合，(5)筛选和(6)克隆(BiochemistryExperimentMethod:单克隆抗体,writtenbyAilsaM.Campbell,translatedbyToshiakiOsawa,TokyoKagakuDozinCo.,Ltd.,1989)。特异结合至细胞表面CD20抗原的抗CD20单克隆抗体能够通过将待试验的单克隆抗体与CellELISA体系反应来克隆，所述CellELISA体系中将CI)20/CHO细胞固定化在平板上。同样能够使用商业上可以获得的表达载体。然而，因为CD20抗原需要在CHO细胞上高密度表达，可以使用哺乳动物细胞高表达载体pNOW(日本专利号3582965)。单克隆抗体的选择标准是呈现出相当于或高于阳性对照的反应性。嵌合化或人源化抗体可根据常规基因重组方法制备。例如，包含串联的2套多克隆位点的用于产生抗体的pNOW-Ab可用作表达载体，并且事先将编码人H链和L链恒定区的基因并入该载体(图1)。实施例实施例1针对CD20抗原的单克隆抗体的制备、嵌合化和人源化以及所得抗体特性的试验将参考实施例在下面进一步说明。ci)敏化小鼠用免疫抗原的制备通过使用SEQIDN():13的5'引物和SEQIDNO:14的3'引物，从cDNA文库获得人CD20基因，所述引物对于编码人CD20完整分子的基因是特异性的(MultipleChoicecDNAhumanspleen,OrigeneTechnologies,Inc.,6TaftCourt,Suite100,Rocl(ville,MD20850)。具体而言，使用图3所示引物。将CD20基因并入作为哺乳动物细胞用高表达载体的pNOW-Ag(图2),并且转染至作为宿主细胞的CHO细胞中。通过FACS分析确立在细胞表面高水平表达CD20分子的重组CHO细胞(CD20/CHO细胞)。在使用FITC标记的抗CD20单克隆抗体的染色中，将与SB细胞相比显示出5倍或更高荧光密度的细胞定义为显示高表达的细胞。通过使用pGEX-4T2载体(Getal.AM,Electrophoresis,Vol.20(2):344-348)将GST融合至CD20胞外域43氨基酸残基的N末端来制备补充性免疫原GST-CD20。(2)免疫原的制备将SB细胞或Raji细胞培养在添加了10%FCS的RPMI1640培养基中。将CD20/CHO细胞培养在添加了800吗/mlG418的CHO-S-SFMII培养基中(GIBCO,Cat.No.12052-098)。将这些培养物离心(IIOOrpm,5分钟)，随后向细胞添加Dulbecco'sPBS(-)并且将细胞悬浮，将悬液再次离心。将此洗涤步骤重复一次，将通过向细胞添加生理盐水制备的悬液(细胞计数(cellcount):1至3x1()7/ml)用于免疫。将并入pGEX-4T2的GST-CD20引入大肠杆菌感受态细胞。在培养后溶解(lyse)所述感受态细胞，并且从溶解的细胞粗制纯化GST-CD20,随后通过添加0.1N氢氧化钠溶解(solubilized)。(3)免疫和细月包融合使用7周龄至1]周龄Balb/c雌性小鼠作为待免疫动物。将SB细胞、Raji细胞或CD20/CHO细胞以不同天数间隔重复施用两次或三次，随后选4奪不同的细胞抗原(SB细胞、Raji细胞或CD20/CHO细胞)并且用于最终免疫。所施用的细胞数与细胞类型无关，为每只小鼠1至3x107。进一步通过对部分小鼠使用GST-CD20进行补充性免疫。在最终免疫的三天之后，从小鼠提取脾脏细胞，在RPMI培养基中悬浮，并且在PEG-1500存在下进行与小鼠骨髓瘤(NS-l)的融合反应(Oi,VTet.Herzenberg,1980,in:SelectedMethodsinCellularImmunology;MishellBetal.(FreemanandCo.,SanFrancisco,CA)p.351)。(4)CD20/CHOCellELISA筛选方法的确立通过使用SB纟田胞、Raji细胞、CD20/CHO细胞和CD20的CHO亲本细胞系附着于其上的96孔平板，使几种鼠源抗CD20单克隆抗体和2B8与之反应。在这些CellELISA试验中确认，对于抗体浓度观察到相似的趋势，并可知抗体之间的相对比较以及与对照的比较也是可能的。由于在CD20/CHOCellELISA中附着于平板表面细胞抗原的高密度，观察到的吸光率水平足以使得相对低浓度的试验抗体样品也能被检出，并且将其认为是一种灵敏测量体系。具体测量结果示于表l。表1SBCellELISA、RajiCellELISA和CD20/CHOCellELISA的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(5M吏用CellELISA的筛选通过使用CD20/CHO细胞或CHO细胞(CD20亲本细月包系)附着于其上的96孔平板进行Cell-EL1SA，并且选纟奪其中产生与CD20特异性反应的抗体的孔。将2B8用作阳性对照，并且将针对人CD3抗原的小鼠单克隆抗体(BDPharMingen)用作阴性对照。具体而言，将附着于聚L-赖氨酸涂覆的96孔平板(AsahiTechnoGlassCorporation,目录号11-023-018)的CD20/CHO细胞或CHO纟田胞(亲本细胞系)用于Ceil-ELISA。向每个孔添加150体积的封闭溶液(0.2%明胶和0.5%BSA的PBS溶液)并且在37。C放置1小时。然后，将所述平板用150mMNaCI和0.05%Tween20水溶液洗涤5次，并且将100(il的各样品(培养物上清液的稀释溶液)添加至每个孔中以在37。C进行1小时的1次反应。洗涤之后，将100)^标记的抗体[HRP标记的抗小鼠IgG(H+L)兔抗体(Jacl(sonLab.，CodeNo.315-035-003)或HRP标记的抗小鼠IgG(Fq)兔抗体(JacksonLab.,CodeNo.315-035-008)1的稀释溶液添加至每个孔以在37。C进行1小时的2次反应。对于制备1次和2次反应的反应混合物，卩吏用与封闭溶液相同的溶液。洗涤之后，将100^显色溶液(OPD)添加至各孔，30分钟后，添加50pi的4NI-L—SO,以终止反应，并且测量492nm的吸光率(A492)。随后，选择显示的反应性相当于或显著高于2B8的反应性的孔。(6)克隆通过有限稀释方法(limiteddilutionmethod)来进行克隆。将细胞接种至96孔平板并培养，随后对包含1个集落的孔的培养物上清液进行用于CD20/CHO细胞的CellELISA，以选择产生特异性抗体的克隆。(7)纯化抗体的制备将产生特异性抗体的克隆培养在添加了10%FCS的RPMI1640培养基中。当细胞密度变成大约5x105/ml时，将所述培养基用无血清培养基ASF-104N(AjinoniotoCo.Inc.)取代，继续培养。然后在2至4天之后，将培养基离心，收集培养物上清液并^吏用G蛋白柱(proteinGcolumn)对其进行纯化。将洗提的(eluled)单克隆抗体溶液相对于150mMNaCl进行透析。对所述溶液使用具有0.2孔大小的滤器进行过滤除菌并且用作试验抗体(抗人CD20小鼠单克隆抗体)。通过CD20/CHOCellELISA选择显示出相当于阳性对照的结合亲和性(bindinga伍nity)的单克隆抗体克隆。测定这些抗体可变区的基因序列，并且由此确定他们的氨基酸序列。典型抗体H链可变区和L链可变区的序列示于SEQIDNOS:1和7、SEQIDNOS:2和8、SEQIDNOS:3和9、SEQIDNOS:4和10、SEQIDNOS:5和11、SEQIDNOS:6和12、SEQIDNOS:15和17，和SEQIDNOS:16和18(图4)。进一步研究了这些克隆的生物学特性。试验抗体的凋亡诱导能力通过流式细胞术(膜il关蛋白V/PI染色)来测定。将2B8用作阳性对照，并且将4十对人CD3的小鼠单克隆抗体(BDPharMingen)用作阴性对照。方法如下。使用MEBCYTOApoplosisKit(MBL,Cat.No.4700，Lot.20)。将Raji细胞离心，随后在包含10%FCS(失活的)的新鲜RPMI1640培养基(ICN,Cat.No.2916754,Lot8005C)中悬浮，将1ml密度为5x105细胞/ml的悬液添加至12孔平板的各个孔中。对于每个抗体使用12个孔，并且将各个抗体以2吗/ml或4fig/ml的终浓度添加(3个孔x2种不同的浓度x2个时间点，总共12个孔)。在培养开始后的第一天和第二天，收集包含大约2x105细胞的培养基，并将其离心，随后将细胞用PBS洗涤一次。接下来，将85pl的结合緩沖液添加至细胞以将细胞悬浮在该緩沖液中。此外，向悬液添加10|al膜联蛋白V-FITC和5piPI,充分混合，并且使其在室温避光反应15分钟。测量通过流式细胞术(FACSCalibur,BectonDickinson)进行，并且使用CellQuest(BectonDickinson)分析结果。8种典型鼠源抗CE20单克隆抗体、阳性对照(2B8)和阴性对照(抗CD3抗体)的测量结果示于图5。通常而言，认为2B8的凋亡诱导能力是高的。即使与此相比，H链可变区和L链可变区的氨基酸序列是SEQIDNOS:2和8的克隆(1K1791)仍显示出显著较高的凋亡诱导活性。还在H链可变区和L链可变区的氨基酸是SEQIDNOS:1和7的克隆(1K1422)以及是SEQIDNOS:15和17的克隆(1K0924)中，观察到明显归因于凋亡的细胞死亡。生物学特性试验(2):细胞增殖抑制试验使用添加了10%FCS的RPMI1640培养基来制备5x104细胞/ml的Raji细胞悬液，以100pl/孔的体积添加至96孔平板，并进行培养。24小时之后，以0.01pg/ml、0.1fig/ml或1吗/ml的抗体浓度添加50jJ/孑L的各抗体溶液，继续培养。抗体添加的72小时之后，添加101^1/孔的显色溶液Ce11CountingKit-8(DojindoLaboratories,目录号343-07623,LotSG076),再将细胞培养进行4小时，随后测量492nm的吸光率。典型的8种鼠源抗CD20单克隆抗体和阳性对照(2B8)的活细胞计数作为基于阴性对照(100%)的百分数示于图6。基于与阴性对照比较所减少的活细胞计数的比率，能够估计出细胞增殖抑制效果。在1K0924、1K1422、1K1791和作为阳性对照的2B8中观察到明显的细胞增殖抑制，并且所述抑制在1K1791中尤其显著。这种趋势与凋亡诱导试验的结果一致。嵌合抗体的制备将编码各鼠源抗体的H链和L链可变区的基因并入用于CHO细胞的高表达载体pNOW-Ab,所述载体已经将编码人免疫球蛋白H链和L链(K)恒定区的基因作为盒(cassette)包含在内。使各表达载体转染入CHO细月包，并且对于各抗体选择出显示高生产率(productivity)的克隆。对嵌合抗体的CD20抗原的结合性试验通过CD20/CHOCeilr:LISA检验制备的8种嵌合抗CD20单克隆抗体对人CD20抗原的反应性。将Rituximab(c2B8)用作阳性对照。试验结果示于表2。CellELISA中的测量值(A492)反映结合性的强度。这些抗体显示出基本上相当于或高于对照的亲和性，除了clK0924和clK1422倾向于显示出稍4氐于对照的亲和性。表2抗CD20嵌合抗体的CD20/CHOCellELISA试验<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>嵌合抗体的CDC试-睑检验制备的8种嵌合抗CD20单克隆抗体的CDC活性。将Rituximab(c2B8)用作阳性对照。将RC-K8(从KochiMedicalSchool获得)用作耙细胞。制备并且使用RHB(基础培养基RPMI-1640，添加剂0.1%BSA、20mMHEPES(pH7.2)、2mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素G、100吗/ml链霉素)作为所使用的培养基。使用RHB洗涤靶细胞并且以106细胞/1111重悬。将体积为50pil的不同浓度的各试-验嵌合抗体和rituximab溶液、50pi商业上可以获得的人补体(Quidel，SanDiego,CA，Cat.A113)的4倍稀释溶液和50含有106纟田胞/ml的细胞悬液添加至平底96孔组织培养平板(黑色)的各孔中。将150(al/孔的混合物中的抗体浓度设为0.1、1和10路/ml。为了促进S卜体介导的细胞溶解，将所述混合物在37。C和5。/。C02的条件下温育2小时。向所述混合物;恭力口50(jiAlamarblue(未牙希萍奪，AccuMedInternational的酉己方，Biosource，Cat.DAL1100),并且使反应在相同的条件下过夜。将平板置于室温10分钟以；令^卩，<吏用荧光《敬平;f反阅T^卖器(fluorescencemicroplatereader),在530nm;敫发，测量在590nm发射的荧光。结果以荧光强度(RFU)表示。CDC活性的比率根据以下方程式计算%CDC活性=100x{RFU(未添加抗体)-RFU(添加了抗体》/(RFU(未添加抗体]-RFU(添加了TritonX-100)}结果示于图7。除了clK1712，抗体显示出基本上相当于或高于作为阳性对照的C2B2的CDC活性。人源化抗体的制备将人源化抗体基于鼠源抗CD20单克隆抗体1K1791的可变区CDR来设计。通过进行基于氨基酸序列的结构分析并且进一步改变设计方法，对于每种H链和L链各制备4种人源化序列(PadlanEA,Mol.Immunol.，Vol.28,No4/5，489-498;WuTTandKabatEA,Mol.Immunol.,Vol.29,No9,1141-1146;PadlanEAetal.,FASEBJ.，Vol.9,133-139)。使用各种H链和L链的所有4种可能的组合来制备抗体。这些氨基酸序列示于SEQIDNOS:19和23、SEQIDNOS:19和24、SEQIDNOS:19和25、SEQIDNOS:19和26、SEQIDNOS:20和23、SEQIDNOS:20和24、SEQIDNOS:20和25、SEQIDNOS:20和26、SEQIDNOS:21和23、SEQIDNOS:21和24、SEQIDNOS:21和25、SEQIDNOS:2]和26、SEQIDNOS:22和23、SEQIDNOS:22和24、SEQIDNOS:22和25以及SEQIDNOS:22和26(图8A和8B)。将这4种H链可变区和4种L链可变区的氨基酸序列使用最频繁用于人基因序列中的密码子转化成DNA(碱基)序列，考虑到在宿主CHO细胞中的适应性，在不改变原始氨基酸残基的前提下，改变这些碱基中的某些(KimCHetal.,Gene,1997,15;199(1-2):293-301)。具体而言，作为相应于氨基酸序列使用的碱基序列是相应于SEQIDNO:19的SEQIDNO:27、相应于SEQIDNO:20的SEQIDNO:28、相应于SEQIDNO:21的SEQIDNO:29、相应于SEQIDNO:22的SEQIDNO:30、相应于SEQIDNO:23的SEQIDNO:31、相应于SEQIDNO:24的SKQIDNO:32、相应于SEQIDNO:25的SEQIDNO:33和相应于SEQIDNO:26的SEQIDNO:34(图8A和图8B)。在这些碱基序列中，只要不改变相应的氨基酸序列，所述碱基可用其它碱基取代。合成H链可变区的碱基序列(SEQIDNOS:27至30)和L链可变区的碱基序列(SEQIDNOS:31至34)总共8种(TakaraShuzoCo"Ltd.)之后，并入包含多克隆位点的用于哺乳动物细胞的表达载体pNOW-Ab。使并入了这些人源化抗体基因的表达载体转染入CHO细胞，并且对于各个抗体选择出显示高生产率的克隆。人源化抗体的生物特性和细胞增殖抑制试验用添加了10%FCS的RPMI1640培养基制备包含5xlOVmlRaji细胞的悬液，并且以100pi/孔的体积添加至96孔平板进行培养。24小时之后，以0.5|ag/ml的抗体浓度添加50pl/孔的各种抗体溶液，并继续培养。抗体添加的72小时后，添力。101^1/孔的显色;容液CellCountingKit-8(DojindoLaboratories,目录号343-07623,LotSG076),再将细胞培养进行4小时，随后测量492nm的吸光率。源自1K1791的16种人源化抗体中的15种(27个克隆)和作为阳性对照的c2B8(rituximab的别称)的活细胞计数作为基于阴性对照(100%)的百分数示于图9。基于与阴性对照比较所减少的活细胞计数的比率，能够估计出细胞增殖抑制效果，并且对本试验中所有克隆的增殖抑制效果进行了观察。本说明书和附图中描述的单克隆抗体的名称和序列编号总结如下<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>SEQIDNOS:SEQIDNOS:SEQIDNOS:SEQIDNOS:SEGIDNOS:SEQDNOS:SEQIDNOS:SEQ)IDNOS:SEGIDNOS:SEQIDNOS:SE(5IDNOS:SEQIDNOS:SEQIDNOS:SEQIDNOS:SEQIDNOS:SEQIDNOS:19和2319和2419和2519和2620和2320和2420和2520和2621和2321和2421和2521和2622和2322和2422和2522和261K1712SEQIDNO:3S￡QIDNO:9clK17121K1402SEQIDNO:4SEQIDNO:10clK14Q21K1736SEQIDNO:SEQIDNO11clK17361K1782SEQIDNO:6SEQIDNO12clK17821K0924SEGIDNO:]5SEQ)IDNO17C1K09241K1228SEQIDNO:16SEQ)IDNO:18clK1228将产生这些单克隆抗体的杂交瘤基于由其产生的抗体名称来命名，并且-达佩斯条约规定下，在2006年3月28日，国际化地保藏于独立4亍政法业才支术综合石开究所特许生物保藏中心(NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology,InternationalPatentOrganismDepositary;TsukubaCentral6，1-1，Higashil-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566，Japan),并且获得保藏号FERMBP-10587(1K1422)、FERMBP-10591(1K1791)、FERMBP-10588(1K1712)、FE固BP-10586(IKI術)、FERMBP-10589(1K1736)、FERMBP-10590(1K1782)、FERMBP-10584(1K0924)和FERMBP-10585(1K1228)。工业适用性本发明提供适合作为治疗剂使用的具有生物学活性的单克隆抗体=权利要求1.一种鼠源抗CD20单克隆抗体，其在无效应细胞的CD20抗原表达细胞培养中，对人CD20抗原表达细胞具有包括凋亡的细胞增殖抑制活性。2.根据权利要求1的抗CD20单克隆抗体，其中所述H链可变区的氨基酸序列和L链可变区的氨基酸序列是SEQIDNOS:1和7、SEQIDNOS:2和8或SEQIDNOS:15和17。3.—种杂交瘤，其产生根据权利要求1或2的抗CD20单克隆抗体。4.一种嵌合抗CD20单克隆抗体，其中将根据权利要求2的抗CD20单克隆抗体可变区的氨基酸序列和人免疫球蛋白恒定区的氨基酸序列融合。5.—种抗CD20单克隆抗体，其通过使用根据权利要求2的抗CD20单克隆抗体可变区CDR的氨基酸序列和人免疫球蛋白的氨基酸序列人源化。6.根据权利要求5的人源化抗CD20单克隆抗体，其中所述H链可变区的氨基酸序列和L链可变区的氨基酸序列的组合是SEQIDNOS:19和23、SEQIDNOS:19和24、SEQIDNOS:19和25、SEQIDNOS:19和26、SEQIDNOS:20和23、SEQIDNOS:20和24、SEQIDNOS:20和25、SEQIDNOS:20和26、SEQIDNOS:21和23、SEQIDNOS:21和24、SEQIDNOS:21和25、SEQIDNOS:21和26、SEQIDNOS:22和23、SEQIDNOS:22和24、SEQIDNOS:22和25或SEQIDNOS:22和26的组合。7.根据权利要求4-6任一项的抗CD20单克隆抗体，在人补体存在下，所述抗CD20单克隆抗体对CD20抗原表达细胞具有细胞毒性。8.—种哺乳动物细胞，其并入编码根据权利要求4至7任一项的抗CD20单克隆抗体氨基酸序列的碱基序列。9.根据权利要求8的哺乳动物细胞，其为CHO细胞。10.—种鼠源抗CD20单克隆抗体，其中所述H链可变区的氨基S臾序列和L链可变区的氨基酸序列的组合是SEQIDNOS:3和9、SEQIDNOS:4和10、SEQIDNOS:5和11、SEQIDNOS:6和12或SEQIDNOS:16和18的组合。11.一种杂交瘤，其产生根据权利要求10的抗CD20单克隆抗体。12.—种嵌合抗CD20单克隆抗体，其中将根据权利要求10的抗CD20单克隆抗体可变区的氨基酸序列和人免疫球蛋白恒定区的氨基酸序列融合。13.—种抗CD20单克隆抗体，其通过使用根据权利要求10的抗CD20单克隆抗体可变区CDR的氨基酸序列和人免疫球蛋白的氨基酸序列人源化。14.根据权利要求12或13的抗CD20单克隆抗体，在人补体存在下，所述抗CD20单克隆抗体对CD20抗原表达细胞具有细胞毒性。15.—种哺乳动物细胞，其并入编码根据权利要求12至14任一项的抗CD20单克隆抗体氨基酸序列的碱基序列。16.根据权利要求15的哺乳动物细胞，其为CHO细胞。17.—种诊断剂，其包含根据权利要求2、4至7、10和12至14任一项的抗CD20单克隆抗体作为有效成分。18.—种治疗剂，其包含根据权利要求4至7和12至14任一项的抗CD20单克隆抗体作为有效成分。全文摘要本发明公开的单克隆抗体能够通过将其结合至细胞表面的CD20抗原来诱导特异性生物反应。克隆了对CD20抗原的胞外表位具有高结合亲和性并且还具有包括细胞生长抑制活性的生物学活性的单克隆抗体。将所述单克隆抗体嵌合化或人源化以开发用于涉及B细胞的疾病的治疗剂。文档编号C12N15/09GK101203607SQ200680019218公开日2008年6月18日申请日期2006年3月31日优先权日2005年3月31日发明者中村彻雄,埃杜阿多·A·帕德兰,沼崎正德,臼田定和申请人:生物医药股份有限公司