专利名称：：用于酶促降低食物制品中丙烯酰胺的新方法用于酶促降低食物制品中丙烯酰胺的新方法
技术领域：
：本发明涉及新颖的酶组合物，其适用于食物制备工艺，以减少食物制品中的丙烯酰胺水平。新的酶组合物尤其适用于烘焙工业。近来，丙烯酰胺在多种食物和烤箱制备的食物中的存在被公开(Tarekeetal.Chem.Res.Toxicol.13,517-522.(2000))。鉴于丙烯酰胺被认为可能对动物和人类致癌，该发现引起了世界范围内的关注。迸一步的研究揭示，在多种不同的烘焙、煎炸和烤箱制备的大众食物中都可检测到丙烯酰胺，并且表明食物中丙烯酰胺的存在是烘焙过程的结果。英国对于食物制品中丙烯酰胺污染的官方限制被设定为10ppb(每千克10微克)，对很多制品来说，丙烯酰胺的值大大超过了这个设定值，尤其是谷物、面包制品和基于马铃薯或基于玉米的制品。Mottrametal.Nature419:448(2002)已提出了作为Maillard反应结果的从氨基酸和还原性糖来形成丙烯酰胺的途径。根据此假设，丙烯酰胺可以在Maillard反应期间形成。烘焙和焙烧(roasting)期间，Maillard反应主要用于产生颜色、气味和味道。与Mamard反应相关的是氨基酸的Strecker降解，并且到丙烯酰胺的途径也被提出了。当温度超过120°C时，丙烯酰胺的形成就可以检测到了，在大约170°C时观察到最高的形成速率。当天冬酰胺和葡萄糖存在时，可以观察到最高的丙烯酰胺水平，而谷氨酰胺和天冬氨酸仅导致痕量的丙烯酰胺。丙烯酰胺主要来自天冬酰胺(结合还原糖)这个事实可以解释烤箱烹制的或焙烤的植物类制品中丙烯酰胺的高水平。人们已知很多植物原材料都含有相当高水平的天冬酰胺。马铃薯中，天冬酰胺是占据优势的游离氨基酸(940mg/kg，相当于氨基酸总含量的40%)，在小麦面粉中，天冬酰胺以大约167mg天冬酰胺/kg面粉的水平存在，相当于游离氨基酸总量的14%(BelitzandGroschinFoodChemistry-SpringerNewYork,1999)。因此，就公众健康方面而言，人们急需具有更低的丙烯酰胺水平或者优选完全没有丙烯酰胺的食物制品。已提出了多种解决方案用于减少丙烯酰胺含量，这些方案或者通过改变加工变量，例如温度或加热步骤的持续时间，或者通过化学或酶促方式来预防丙烯酰胺形成，或者通过去除形成的丙烯酰胺来实现。本发明涉及对丙烯酰胺形成的酶促减少。用于减少丙烯酰胺形成的酶促途径包括用天冬酰胺酶来减少食物制品中的天冬酰胺含量，因为天冬酰胺被看作是丙烯酰胺的重要前体。但是，对于一些应用而言，单独使用天冬酰胺酶并不足以将食物制品的丙烯酰胺含量减少至理想水平。因此，本发明的一个目的是提供一种酶组合物，使得通过使用本发明的组合物制备的食物中丙烯酰胺水平减少更多。本发明的目的通过提供包含天冬酰胺酶和至少一种水解酶的酶组合物来达成。我们吃惊地发现，在减少食物(用下述酶组合物制备的)中丙烯酰胺水平的方面，将至少一种水解酶与天冬酰胺酶一起加入导致了协同效应。包含天冬酰胺酶和能氧化还原糖的酶的酶组合物公开于wo2004/032648中，其还教导了丙烯酰胺是通过天冬酰胺和还原糖之间的反应形成的。但是，根据本发明的酶组合物增加了还原糖的量，却仍然达到了食物制品丙烯酰胺水平戏剧性减少的效果，甚至要低于仅添加天冬酰胺酶的情况。可获得的任何天冬酰胺酶(EC3.5丄1)可用于本发明。合适的天冬酰胺酶(EC3.5丄1)可从多种来源获得，例如来自植物、动物和微生物。合适的微生物的例子是^EscAen.fl、￡Vvw>2/a、iSYre/,om_yc￡5、尸w"(iom。"(XS、A戸rgz7/w5禾CI万ac"7/M的物种。合适的天冬酰胺酶可在WO03/083043和WO2004/030468中找到。优选的天冬酰胺酶是如WO04/030468所述(该文献通过引用并入本文)具有SEQIDNO:3或其功能等同物的天冬酰胺酶。任何水解酶(EC3.x.x.x)可适用于本发明。对于EC分类而言，本文引用并使用RecommendedEnzymeNomenclature(1992)oftheIUBMBpublishedbyAcademicPressInc.(ISBN0-12-227165-3)。X在本文中表示整数。但是，优选使用属于羧酸酯水解酶(EC3丄l.x)的水解酶或者来自水解o-糖基化合物的糖苷酶的组(EC3.2丄x)的水解酶。合适的羧酸酯水解酶的例子是脂肪酶(EC3丄1.3)、果胶酯酶(EC3丄1.U)、半乳糖脂酶(EC3丄1.26)、磷脂酶A1(EC3丄1.32)、磷脂酶A2(EC3丄1.4)、溶血磷脂酶(EC3丄1.5)。优选的合适的水解0-糖基化合物的例子是a-淀粉酶(EC3.2丄1)、/3淀粉酶(EC3.2丄2)、果胶酶(EC3.2丄15)、纤维素酶(EC3.2丄4)、木聚糖酶(EC3.2丄32)、阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2丄55)和葡聚糖酶(EC3.2.1.6)。水解酶的混合物也可用于根据本发明的组合物中，包括羧酸酯水解酶与水解o-糖基化合物的水解酶的混合物。本领域技术人员知道如何获得适用于本发明的水解酶。在一种优选的实施方式中，天冬酰胺酶与选自淀粉酶、木聚糖酶和脂肪酶构成的组的酶组合。这些组合物尤其适用于烘焙工业，并且可能成为预混料的一部分。在另一种优选的实施方式中，天冬酰胺酶与允许天冬酰胺酶固定或者允许天冬酰胺酶穿透(penetration)的酶组合。这些组合物尤其适用于存在整个植物来源细胞并且必须水解植物基质的内源聚合物的情况。在本发明的第二方面，本发明涉及降低食物制品中丙烯酰胺含量的新方法。在一种优选的实施方式中，食物制品是烘焙制品。在另一种优选的实施方式中，食物制品是深度煎炸制品。在又一种优选的实施方式中，食物制品是烘烤(roastmg)或焙烧制品，特别是烘烤或焙烧的面团或面包。涉及至少一个加热步骤的食物制品制造方法包括在所述制造方法中，将a.天冬酰胺酶和b.至少一种水解酶加入所述食物制品的中间产物形式，其中，所述天冬酰胺酶和所述至少-一种水解酶在加热步骤之前加入，加入的量能有效使得食物制品的丙烯酰胺水平较之没有加入天冬酰胺酶和水解酶的食物制品而言有所降低。天冬酰胺酶和至少一种水解酶可分开加入或者以组合物形式加入，优选地，以根据本发明的组合物的形式加入。优选地，该组合物以下述量加入，所述量使得存在根据本发明的酶组合物时生产的食物制品的丙烯酰胺含量相对于根据本发明的组合物中任何一种组分不存在时生产的食物制品而言有所降低。更优选地，在食物制造方法中，食物组合物以这样的量加入，所述量使得存在该酶时生产的食物制品中丙烯酰胺的含量较之存在天冬酰胺酶但不存在水解酶时生产的食物而言降低至少10%、15%、20%、25%或30%，优选至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%，更优选至少80%、85%或90%，最优选至少95%、97%、98%或99%。对于将用于根据本发明的方法的天冬酰胺酶和水解酶而言，同样考虑上文所述的优选顺序。食物制品的中间产物形式在本文中被定义为所述制造方法中，获得该食物制品的最终形式之前的所产生的任何形式，这包括植物的部分以及植物的部分的切片或切块。所述中间产物形式还包括所用的各原材料和/或其经过加工的形式。在此举两个例子对食物制品面包而言，所述中间产物形式包括小麦、小麦面粉、它们与面包的其它成分的初始混合物，所述其它成分例如是水、盐、酵母和面包改良组合物、经混合的面团、经揉捏的面团、经冷冻的面团、经发酵(leavened)的面团和部分经烘焙的面团。对于成型薯片食物制品而言，中间产物形式可包括煮熟的马铃薯、经捣碎的马铃薯泥、经干燥的捣碎马铃薯泥以及马铃薯面团。所述食物制品可制自至少一种植物来源的原材料，例如，马铃薯，烟草，咖啡，可可，水稻，谷物，水果。谷物的例子是小麦、黑麦、玉米、苞谷、大麦、去壳麦粒、荞麦和燕麦。此处和下文中的小麦都意欲包括7W"cw7M属的所有已知物禾中，例如，fle幼'vwm、c/wn"w禾口/或印e/to。从超过一种的原材料制得的食物制品也被包括在本发明的范围内，例如，包含小麦(面粉)和马铃薯的食物制品。根据本发明的方法可适用的食物制品的例子是任何以面粉为基础的制品一一例如面包、油酥制品、蛋糕、椒盐脆饼干、面包圈、荷兰式蜜蛋糕、曲奇饼、姜汁面包、姜汁蛋糕和薄脆饼干，以及任何以马铃薯为基础的制品一一例如法式薯条、炸薯条、薯片、炸薯饼，以及任何以玉米为基础的制品——例如玉米面包、脆玉米片(corncrisp)和粟米片(comflake)。优选的制造方法是对面包和来自小麦面粉和/或其它谷物来源的面粉的其它烘焙制品的烘焙。另一优选的制造方法是对来自马铃薯切片的薯片的深度煎炸。还一优选的制造方式是对来自挤出的基于玉米的面团的脆玉米片的深度煎炸。优选的加热步骤是如下这些其中，中间食物制品的至少一部分，例如，该食物制品的表面被暴露于促进丙烯酰胺形成的温度下，例如，110。C或更高，120°C或更高的温度。根据本发明的方法中的加热步骤可在烤箱中进行，例如，在180-220°C之间的温度，例如，用于对面包和其它烘焙制品的烘焙，或者，可在油中进行，例如对马铃薯片的煎炸，例如，在在160-190。C之间。下面将通过下述非限制性实施例来阐述本发明。附图简述图1多种酶组合中的50ppm天冬酰胺酶对用发酵盐制备的迷你batard面包的外壳中丙烯酰胺水平的影响(以％表示)。不含天冬酰胺酶的酶组合的情况下的丙烯酰胺水平被设为00%。图2多种酶组合中的50ppmA^ger天冬酰胺酶对用MogulBrandChapatti黑面粉和面包酵母制备的迷你batard面包的外壳中丙烯酰胺水平的影响(以％表示)。不含天冬酰胺酶的酶组合的情况下的丙烯酰胺水平被设为100%。图3多种酶组合中的Am'gw天冬酰胺酶对用kolibri面粉和面包酵母制备的迷你batard面包的外壳中丙烯酰胺水平的影响(以％表示)。用天冬酰胺酶作为唯一烘焙用酶的面包的丙烯酰胺水平被设为100%。材料表1.在实施例中使用的烘焙用酶<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>样品预处理用5mlmUliQ水对600mg干燥均质的样品进行提取。将1呢处于溶液(CIL)中的内标物1303丙烯酰胺加入到提取物中。离心(6000rpm)10分钟后，将3ml上清层上到Extreluut-3BT柱(Merck)中。用15ml乙酸乙酯从所述的柱中洗脱出丙烯酰胺。乙酸乙酯在缓和的氮气流下蒸发，至大约0.5ml。色谱条件用气相色谱来分析该乙酸乙酯溶液。用5.4ml/分钟的持续氦气流作为载气，用CP-Wax57(Varian)柱(长度为25m，内径0.32mm，薄膜1.2/mi)来实现分离。不分流(split-less)注射3^。炉温在50°C保持1分钟，之后以30。CZ分钟上升至220°C。220°C的温度持续l2分钟之后，在下一次注射之前对炉进行冷却和稳定。用甲烷作为电离气体，使用在线化学电离质谱仪，阳离子模式来进行检测。监测特征离子m/z72(丙烯酰胺)和m/z75(]303丙烯酰胺)，以进行定量。使用的设备GC:HP6890(HewletPackard)MSD(质量选择检测器)HP5973(HewletPackard)如无特别指明，以ppm或ppb表示的量基于面粉的量。实施例2烘焙用酶和^邓erg///^m'ger天冬酰胺酶对用发酵盐制备的迷你batard面包中丙烯酰胺形成的影响通过混合200g全麦面粉(MogulBrandChapatti黑面粉，MogulLasuB.V.TheHague,Holland)、4g盐、68ppm抗坏血酸、2gDKS(NaHC03)(ChemProha，ChemiepartnersB.V.Dordrecht,Holland)、2.7gSap40(酸式焦磷酸钠，E450)(ChemischeFabrikBudenheimKG，Budenheim,Germany)、1gSSL(硬月旨酰乳酸钠)(Danisco,Denmark)、1gGMS(单硬脂酸甘油酉旨(Admul),Guest,Naarden,Holland)来用发酵盐制备迷你batard。待测试的烘焙用酶的量示于表1(LipopanF和Novamyl可从Novo获得，其它酶可从DSM-Gist获得)。加入226ml水。在螺旋混合机中混合8分45秒。面团温度为27°C。混合后直接将面团分为150g的两块，弄圆，于32°C在醒发腔(proofingcabinet)中醒发25分钟。之后对面团进行成型，在32°C进行100分钟的最终醒发。面团块在225°C被烘焙20分钟。按照实施例1所述测定外壳中的丙烯酰胺。留在用天冬酰胺酶处理过的面包中的丙烯酰胺百分比按照如下公式来计算丙烯酰胺含量(烘焙用酶组合X+天冬酰胺酶)——~-x100%丙烯酰胺含量(烘焙用酶组合x，无天冬酰胺酶)关于多种酶组合的上述值示于表2和图1中。例如，通过用来自第4号测试的结果除以来自第3号测试的结果再乘以100%，计算出在用BakezymeP500和天冬酰胺酶处理过的面包中残留的丙烯酰胺百分比。表2.用实施例中示出的多种烘焙用酶和发酵盐制备的迷你batard面包外壳中的丙烯酰胺，以及^印ergf//^m'ger天冬酰胺酶对丙烯酰胺水平的影响。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>从表2和图1可以推出，烘焙用酶BakezymeHSP6000、LipopanF、BakezymeA10000、BakezymeW、BakezymeXE及其组合的加入将导致外壳中丙烯酰胺水平较之没有烘焙用酶的参考面包有所提高。但是，向面团中加入合适的量的天冬酰胺酶将导致丙烯酰胺水平较之没有加入天冬酰胺酶的参考值有所降低，甚至低于没有使用任何烘焙用酶的参考值。实施例3烘焙用酶和Amgw天冬酰胺酶对用面包酵母和全麦面粉制备的迷你batard面包中丙烯酰胺形成的影响通过混合200g全麦面粉(MogulBrandChapatti黑面粉)、4.6gKoningsgis顿酵母、4g盐、68ppm抗坏血酸和表2示出的若千种酶和酶组合物，以标准烘焙工艺制备迷你batard面包。加入132g水，在螺旋混合机中混合8分45秒。面团温度为27°C。混合后直接将面团分为150g的两块，弄圆，于32。C在醒发腔中醒发25分钟。之后对面团进行成型，在32°C进行100分钟的最终醒发，面团块在225°C被烘焙20分钟。按照实施例1所述测定外壳中的丙烯酰胺。留在用天冬酰胺酶处理过的面包中的丙烯酰胺百分比按照实施例2所述来计算。在表3和图2中展示了多种酶组合中天冬酰胺酶的作用。表3.用全麦面粉、酵母和多种烘焙用酶制备的迷你batard面包外壳中的丙烯酰胺，以及^印e^///^m'g^天冬酰胺酶对丙烯酰胺水平的影响。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>低，在某些情况下，甚至比没有使用烘焙用酶但是存在天冬酰胺酶时的参考更低。实施例4烘焙用酶和Am'ger天冬酰胺酶对用面包酵母和kolibri面粉制备的迷你batard面包中丙烯酰胺形成的影响通过混合200gkolibri面粉(Meneba)、4.6gKoningsgist⑧酵母、4g盐、68ppm抗坏血酸和表2示出的若干种酶和酶组合物，以标准烘焙工艺制备迷你batard面包。加入114g水，在螺旋混合机中混合6分15秒。面团温度为27。C。混合后直接将面团分为150g的两块，弄圆，于32。C在醒发腔中醒发25分钟。之后对面团进行成型，在32。C进行IOO分钟的最终醒发，面团块在225°C被烘焙20分钟。按照实施例1所述测定外壳中的丙烯酰胺。留在用天冬酰胺酶处理过的面包中的丙烯酰胺百分比按照实施例2所述来计算。在表4和图3中展示了多种酶组合中天冬酰胺酶的作用。表4.用kolibri面粉、酵母和多种烘焙用酶制备的迷你batard面包外壳中的丙烯酰胺，以及J^erg///^天冬酰胺酶对丙烯酰胺水平的影响。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*:Pectinex从NOVO获得。在图3中展示了存在酶(组合)时的Am'gw天冬酰胺酶的作用。较之用提到的酶或酶组合制备的面包外壳中的丙烯酰胺水平而言，当在存在酶(组合)的情况下使用天冬酰胺酶时，绝对丙烯酰胺水平更低。在一些情况下，残留的丙烯酰胺相对水平更高，这是不存在天冬酰胺酶的情况下较低丙烯酰胺含量的结果。但是，存在酶组合加天冬酰胺酶的情况下，绝对丙烯酰胺水平低于参考。从表4和图3可以推出，当酶或酶组合与合适的量的天冬酰胺酶组合时，向基于kolibri面粉的面团中加入烘焙用酶BakezymeGOX10,000、BakezymeMA10,000、BakezymeBXP501和Pectinex将导致外壳中丙烯酰胺水平低于参考面包(仅用天冬酰胺酶作为唯一的烘焙用酶)。权利要求1.酶组合物，包含a.天冬酰胺酶，和；b.至少一种水解酶。2.如权利要求l所述的组合物，其中，所述水解酶是羧酸酯水解酶。3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述水解酶是水解o-糖基化合物的糖苷酵。4.如权利要求1-3中任意一项组合物在制造食物制品中的用途，用于降低所述食物制品的丙烯酰胺水平。5.用于制造食物制品的方法，所述方法涉及至少一个加热步骤，所述方法包括在所述制造方法中向所述食物制品的中间产物形式加入a.天冬酰胺酶，和b.至少一种水解酶其中，所述天冬酰胺酶和所述至少一种水解酶在所述加热步骤之前加入，加入的量能有效使得所述食物制品的丙烯酰胺水平较之没有加入天冬酰胺酶和水解酶的食物制品而言有所降低。6.如权利要求5所述的方法，其中，组分a和b以单种组合物的形式加入，优选地，以权利要求1-3中任意一项所述的组合物的形式加入。7.如权利要求5或6任意一项所述的方法，其中，所述食物制品是烘fe制品。8.如权利要求5或6任意一项所述的方法，其中，所述食物制品是煎炸、烘烤或焙烧制品。9.如权利要求5-8中任意一项所述的方法，其中，所述食物制品的所述中间产物形式是面团。10.如权利要求5-8中任意一项所述的方法，其中，所述食物制品是从至少一种植物来源的原材料制备的。11.可通过权利要求4的用途或者权利要求5-10中任意一项所述的方法获得的食物制品。全文摘要本发明涉及包含天冬酰胺酶和至少一种水解酶的新颖的酶组合物、此类组合物用于降低食物制品中丙烯酰胺水平的用途以及涉及至少一个加热步骤的食物制品制造方法，所述方法包括在所述制造方法中，将a.天冬酰胺酶和b.至少一种水解酶加入所述食物制品的中间产物形式，其中，所述天冬酰胺酶和所述至少一种水解酶在所述加热步骤之前加入，加入的量能有效使得所述食物制品丙烯酰胺水平较之没有加入天冬酰胺酶和水解酶的食物制品而言有所降低。文档编号C12N9/18GK101189330SQ200680019465公开日2008年5月28日申请日期2006年5月29日优先权日2005年5月31日发明者莱克斯·德布尔申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司