用于酶漂白食品的新颖酶的制作方法

专利名称：用于酶漂白食品的新颖酶的制作方法
专利说明用于酶漂白食品的新颖酶 本发明涉及适用于食品(其具有提高的白度)制备方法的新颖酶、该酶提高食品的至少一部分的白度的用途、用于制备食品的方法(其中使用所述酶)和获得的食品。
在一些类型的食品中，食品至少一部分为白色是人们期望的，例如在乳制品(例如乳酪、乳清、黄油和乳粉)中和在基于面粉的产物(例如面包和面条)中。
然而，这类食品的原料或中间体可能包含色素，这可引起食品为米色到黄色。这类色素的实例是类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)和黄酮。
例如在白面包中，人们期望看到白色的碎屑。更白的碎屑可通过使用酶(例如过氧化氢酶、过氧化物酶、酯酶和/或脂肪氧化酶)获得，参阅例如′Oxido-reductases and Lipases as Dough-Bleaching Agent′by P.Gelinas et al，Cereal Chem，75(6)，810-814(1998)。提到的所有酶都对碎屑具有漂白效应。目前，烘焙工业主要使用酶活性的大豆粉，其含有脂肪氧化酶。大豆粉中的脂肪氧化酶由于自由基和其他活性氧的作用，能够漂白小麦面粉色素，所述自由基和其他活性氧在脂肪氧化酶氧化脂肪酸时形成。该反应称作共氧化(co-oxidation)。在大豆粉中存在三种脂肪氧化酶L1、L2和L3，其中L2和L3具有最佳的漂白活性(W.Grosch，G.Laskawy and F.Weber，J.Agric.Food Chem 24(1976)，456)。大豆粉不仅含有脂肪氧化酶，还含有漂白效应所必需的脂肪酸，导致改善的漂白效应。
使用大豆作为脂肪氧化酶来源的缺点在于目前大部分大豆是被遗传修饰的(GMO)。因为全世界的消费者偏好于使用非GMO来源的面包改良添加剂，所以非常需要大豆脂肪氧化酶的替代方案。除了来自大豆的脂肪氧化酶L2和L3之外的其它已知酶具有下述缺点它们的表现不如来自大豆的脂肪氧化酶好。在实践中，为了获得期望的白度，将这些酶与辅助因子或其他酶组合以达到期望的碎屑白度水平。过氧化物酶通过分子氧非酶地催化不饱和化合物(例如不饱和脂肪酸)的氧化(CE.Eriksson et.al.JAOS48(1971)442)。这些被氧化的脂肪酸产生自由基，所述自由基可能与面粉色素反应，以与脂肪氧化酶反应产物相似的方式产生颜色更浅的产物。
本发明的目的是提供适用于制备食品的新颖酶，所述食品的至少一部分的白度被提高。
令人惊奇地发现根据本发明的漂白酶能够将色素直接转化为导致白度提高的形式。这些酶可以以多种形式显示它们对色素的直接漂白效应。例如，它们可通过例如氢化将色素中的不饱合键饱和来直接转化色素，或它们可直接切割色素形成降解产物。术语直接是指酶作用于色素，色素自身作为底物。不明确排除使用辅助因子来达成转化。
另外发现根据本发明的漂白多肽能够直接切割色素(所谓的切割酶)。根据本发明的合适切割酶是能够切割类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)和黄酮的酶。类胡萝卜素可以以两种不同方式被切割，中心的和偏心的。类胡萝卜素中心切割导致形成类视黄醇(C20-化合物)。偏心切割可产生更多样性的化合物，例如脱落酸。能够中心切割类胡萝卜素的酶为例如EP-A-1031623和J.Lintig and K.Vogt(2000)J.Biol.Chem.275，11915中描述的例如β-胡萝卜素15，15′-单加氧酶(EC 1.14.99.36)。该酶先前已知为β-胡萝卜素15，15′-双加氧酶＝EC 1.13.11.21。
使用能够中心切割的酶的另一好处在于形成类视黄醇。这些是视觉的关键成分，β-胡萝卜素被切割为两分子的视黄醛。该视黄醛可以被修饰为视黄醇，也称作维生素A。能够偏心切割类胡萝卜素的酶为9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(例如X.Qin and J.A.D.Zeevaart(1999)，Proc.Nat.Acad.Science，96，15354)和β-胡萝卜素9′，10′-双加氧酶(例如Kiefer et al.(2001)，J.Biol.Chem.287，14110)。
该目的通过本发明中公开的新颖酶达成。
在第一方面，本发明涉及经分离的多肽，其具有漂白活性和一种或多种选自以下的特征 1)根据SEQ ID NO08-12任一的经分离的多肽或其任一的功能等价物； 2)经分离的多肽，其可通过在适当的宿主细胞例如Aspergillus niger中表达下述物质获得根据SEQ ID NO01-07任一的多核苷酸，或其任一的功能等价物，或包含所述多核苷酸或其任一功能等价物的载体，和 3)多肽，其至少包含SEQ ID NO13-17之一。
术语“具有漂白活性的多肽”在此处和下文中定义为能够降解β-胡萝卜素的多肽或能够漂白食品的多肽。β-胡萝卜素降解可以通过例如本专利申请的“材料和方法”章节中公开的至少一种方法测量，例如根据Zorn的方法或根据Aziz的方法。优选地，根据本发明的多肽在Aziz和Zorn测定法中均显示漂白活性。漂白食品的能力可以通过将产物A(其中被研究的多肽用于其制备中)的白度与产物B(其与产物A的区别仅在于所研究的多肽未用于其产物中)的白度视觉地或通过已知的反射测定法比较来测定，其中在被研究的多肽具有漂白活性时，产物A的b因子会比产物B的b因子更接近0。
更优选地，根据本发明的多肽能够降解β-胡萝卜素(如根据Zorn所测定的)并且能够漂白食品(如通过反射测量法测量b因子所测定的)。最优选地，在被漂白的食品具有不规则的表面结构(例如面包屑)的情况下，根据本发明的多肽能够降解β-胡萝卜素(如根据Zorn所测定的)，因为此时反射测量方法不那么可靠。
在优选的实施方案中，本发明提供经纯化的多肽。根据本发明的多肽包括由根据本发明的多核苷酸编码的多肽。特别优选的是根据SEQ ID NO08-12的多肽活其任一的功能等价物。
包含根据本发明的多肽的融合蛋白也属于本发明的范围内。本发明还提供根据本发明的多肽的制造方法。
为了避免疑惑；SEQ ID NO01-07是指包含SEQ ID NO01、SEQ IDNO02、SEQ ID NO03、SEQ ID NO04、SEQ ID NO05、SEQ ID NO06和SEQ ID NO07的DNA组；SEQ ID NO08-12是指包含SEQ ID NO08、SEQ ID NO09、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的蛋白质序列组；SEQ ID NO13-18是指包含SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16和SEQ ID NO17的蛋白质序列组。另外，术语caroase-01、caroase-02、caroase-03、caroase-04、caroase-05(整组被称作“caroase-01-05”)用于表示分别具有SEQ ID NO08-12的多肽。
第二方面，本发明提供具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列在高严格度条件下优选地与根据SEQ ID NO01-07之任一的序列杂交。因此，本发明提供核酸，所述核酸与根据SEQ ID NO01-07的序列约55％、优选地65％、更优选地70％、进一步更优选地75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
在更优选的实施方案中，本发明提供这类经分离的多核苷酸，其可得自真菌，优选地得自丝状真菌，特别是优选Marasmius，例如M.scorodonius。
在一个实施方案中，本发明提供经分离的多核苷酸，其包含编码多肽的核酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO08-12中所示的氨基酸序列或其任一的功能等价物。
在另一优选的实施方案中，本发明提供经分离的多核苷酸，其编码根据SEQ ID NO08-12的多肽或其任一的功能等价物的至少一个功能结构域。
在优选的实施方案中，本发明提供根据SEQ ID NO01-07的漂白酶基因。在另一优选的实施方案中，本发明提供编码漂白酶的多核苷酸或这些多肽中任一的变体或片段，所述漂白酶的氨基酸序列显示于SEQ ID NO08-12中。
在另一优选的实施方案中，本发明提供包含编码序列的多核苷酸(优选SEQ ID NO01-07的多核苷酸序列)，所述编码序列编码根据本发明的多肽。
第三方面，本发明还涉及包含根据本发明的多核苷酸序列的载体，和可用于扩增或检测本发明DNA的引物、探针和片段。
在优选的实施方案中，提供一种载体，其中根据本发明的多核苷酸序列与调节序列功能性连接，所述调节序列适用于在合适的宿主细胞(如细菌或丝状真菌，优选Marasmius例如M.scorodonius、Aspergillus例如A.niger或A.oryzae)中表达所编码的氨基酸序列。本发明还提供用于制备本发明多核苷酸和载体的方法。
第四方面，本发明还涉及重组产生的宿主细胞，其含有本发明的异源或同源多核苷酸。
在另一实施方案中，本发明提供重组的宿主细胞，其中本发明过氧化物酶的表达被显著提高，或其中过氧化物酶的活性被提高。
在另一实施方案中，本发明提供重组产生的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的异源或同源DNA，其中所述细胞能够生产本发明的功能性过氧化物酶，优选能够过表达(overexpress)本发明过氧化物酶的细胞，例如包含提高的本发明基因拷贝数的Aspergillus菌株。
第五方面，本发明还涉及本发明的漂白多肽在任何工业方法中的用途，优选如本文所述的用途。
根据本发明的多肽 本发明提供经分离的多肽，其具有根据SEQ ID NO08-12中任一的氨基酸序列，以及可通过在适当的宿主中表达SEQ ID NO01-07多核苷酸获得的氨基酸序列。另外，包含上述多肽功能等价物的肽或多肽也包含在本发明中。上述肽共同包含在术语“根据本发明的多肽”中。
术语“肽”和“寡肽”在此处和下文中被认为是同义的(如通常所认为的)，每个术语可以按照上下文的需要互换使用表示通过肽键偶联的至少两个氨基酸链。词语“多肽”在本文中用于含有多于七个氨基酸残基的链。本文的所有寡肽和多肽式从左到右、从氨基端到羧基端书写。本文使用的氨基酸单字母代码为本领域公知并可见于Sambrook，et al.(MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd，ed.Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
“经分离的”多肽或蛋白质表示从其天然环境中取出的多肽或蛋白质。例如，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，其为通过任何合适的技术被实质纯化的天然或重组多肽，所述技术如例如Smith and Johnson，Gene 6731-40(1988)中公开的单步纯化方法。
根据本发明的caroase-01-05漂白酶或其功能等价物可通过公知的方法从重组细胞中回收和纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。最优选地，使用高效液相色谱(″HPLC″)用于纯化。
本发明的多肽包括天然纯化的产物、化学合成过程的产物和通过重组技术从原核或真核宿主(包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中生产的产物。根据重组生产过程中所使用的宿主，本发明的多肽可以被糖基化或未糖基化。另外，本发明的多肽也可包括原始的改良甲硫氨酸残基，在一些情况下是宿主介导过程的结果。
功能等价物 术语“功能等价物”和“功能变体”在本文中可交换使用。caroase01-05DNA的功能等价物是编码多肽的经分离DNA，所述多肽显示与本文定义的caroase 01-05 Marasmius scorodonius漂白酶中至少一个至少相同或更好的漂白活性。本发明caroase 01-05多肽的功能等价物是下述多肽，所述多肽显示与本文定义的caroase 01-05 Marasmius scorodonius漂白酶中至少一个至少相同或更好的漂白活性。
功能性蛋白质多肽等价物可仅含有SEQ ID NO08-12中任一个的一种或多种氨基酸的保守性取代，或这些中任一个的非必需氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非必需氨基酸是SEQ ID NO08-12任一个中可被改变而不显著改变生物学功能的残基。例如，在本发明caroase 01-05蛋白质中保守的氨基酸残基被预测为特别不适合改变。另外，根据本发明的caroase01-05蛋白质和其他过氧化物酶中保守的氨基酸不太可能适合改变。
术语“保守取代”旨在表示一种取代，其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基取代。这些家族是本领域公知的，并包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、带有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、带β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
功能性核酸等价物可典型地含有沉默突变或不改变所编码多肽生物功能的突变。因此，本发明提供编码caroase 01-05蛋白质的核酸分子，它的对特定生物学活性不必需的氨基酸残基有所改变。这类caroase 01-05蛋白质与SEQ ID NO08-12任一的氨基酸序列不同，但仍保持至少一种生物学活性。在一个实施方案中，经分离的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质包含与SEQ ID NO08-12任一种已知的氨基酸序列至少约55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源或更同源的基本同源的氨基酸序列。
例如，涉及如何制造表型沉默氨基酸取代的指导在Bowie，J.U.et al.，Science 2471306-1310(1990)中提供，其中作者指出存在两种主要的途径用于研究氨基酸序列对改变的耐受。第一种方法依赖于进化的过程，其中突变被自然选择接受或拒绝。第二种方法使用基因工程在被克隆基因的特定位点引入氨基酸改变，选择或筛选以鉴定维持功能性的序列。如作者所述，这些研究显示蛋白质对氨基酸取代惊人地耐受。作者还指出改变很可能在蛋白质的某些位置被允许。例如，大部分内陷的氨基酸残基需要非极性的侧链，而通常很少保留表面侧链的特征。其他这类表型沉默突变描述于上文Bowie et al和其中所引的参考文献中。
编码与SEQ ID NO08-12任一蛋白质同源的caroase 01-05蛋白质的经分离核酸分子可以如下产生向根据SEQ ID NO01-07的编码核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，使得一个或多个氨基酸取代、缺失或插入被引入所编码的蛋白质中。这类突变可通过标准技术被引入，例如定向诱变和PCR介导的诱变。
术语“功能等价物”也包括M.scorodonius caroase 01-05蛋白质的直向同源物。M.scorodonius caroase 01-05蛋白质的直向同源物是可从其他菌株或物种中分离并具有相似或相同生物活性的蛋白质。这类直向同源物可容易地被鉴定，因为包含与SEQ ID NO08-12任一个基本同源的氨基酸序列。
如本文所定义的，术语“基本同源”是指第一氨基酸或核苷酸序列含有足够数量或最小数量的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或等价(例如具有类似的侧链)的氨基酸或核苷酸，从而所述第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构域。例如，含有下述共同结构域的氨基酸或核苷酸序列在本文被定义为足够相同，所述共同结构域具有约55％，优选65％，更优选70％，进一步更优选75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性或更多。
编码其他caroase 01-05家族成员的核酸(其因此具有与SEQ ID NO01-07不同的核苷酸序列)也属于本发明的范围。另外，编码来自不同物种caroase 01-05的核酸(其因此具有与SEQ ID NO01-07不同的核苷酸序列)属于本发明的范围。
对应于本发明caroase 01-05 DNA变体(例如天然等位变体)和同源物的核酸分子可根据它们与本文公开的caroase 01-05核酸分子的同源性，使用本文公开的DNA或其合适片段作为杂交探针，根据标准杂交技术优选地在高严格度杂交条件下分离。
除了天然存在的caroase 01-05序列的等位变体外，本领域技术人员会了解可通过突变技术将改变引入SEQ ID NO01-07的核苷酸序列中，从而导致caroase 01-05蛋白质的氨基酸序列中的改变而不显著改变caroase 01-05蛋白质的功能。
在本发明的另一方面，提供经改进的caroase 01-05蛋白质。经改进的caroase 01-05蛋白质是其中至少一种生物学活性被改进的蛋白质。这类蛋白质可通过向caroase 01-05编码序列的全部或部分随机引入突变(例如通过饱和诱变)来获得，得到的突变体可被重组表达并筛选其生物活性。例如，本领域提供用于测量过氧化物酶酶活性的标准测定法，从而改良的蛋白质可容易地被选择。
在优选的实施方案中，caroase 01-05蛋白质分别具有根据SEQ ID NO08-12任一的氨基酸序列。在另一实施方案中，caroase 01-05多肽与根据SEQ ID NO08-12的氨基酸序列基本上分别同源，并分别保持根据SEQ IDNO08-12的多肽的至少一种生物活性，但是因为天然突变或如上所述的诱变而在氨基酸序列上有所不同。
在另一优选的实施方案中，caroase 01-05蛋白质具有由经分离的核酸片段编码的氨基酸序列，所述核酸片段能够与根据SEQ ID NO01-07的核酸杂交，优选在高严格度杂交条件下杂交。
因此，caroase 01-05蛋白质是下述蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ IDNO08-12任一所示的氨基酸序列至少约55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源或更多同源的氨基酸序列，并保持根据SEQ ID NO08-12任一的多肽的至少一种功能活性。
在本发明的另一方面。多肽包含至少一个SEQ ID NO13-17中所示的序列。优选地，根据本发明的多肽包含至少两个SEQ ID NO13-17中所示的序列。最优选地，多肽包含SEQ ID NO13-17中所示的全部序列。
也可例如通过筛选本发明蛋白质突变体(例如截短突变体)的组合文库的过氧化物酶活性来鉴定本发明蛋白质的功能等价物。在一个实施方案中，通过在核酸水平组合诱变产生变体的多样化文库。变体多样化文库可如下产生例如将合成的寡核苷酸酶连接为基因序列从而可能的蛋白质序列的简并集合可作为个体多肽被表达，或者作为更大的融合蛋白质组(例如噬菌体展示)被表达。存在多种方法可被用于从简并寡核苷酸序列产生本发明多肽的可能变体文库。用于合成简并寡核苷酸的方法为本领域已知(参阅例如Narang(1983)Tetrahedron 393；ltakura et al.(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；ltakura et al.(1984)Science 1981056；Ike et al.(1983)Nucleic Acid Res.11477)。
另外，本发明多肽编码序列的片段文库可被用于产生多肽的多样化群体，用于筛选随后的变体选择。例如，编码序列片段的文库可如下产生用核酸酶在每个分子仅发生一次切割的条件下处理感兴趣的编码序列的双链PCR片段、将双链DNA变性、将DNA变性形成双链DNA(其可包括来自不同切割产物的正义/反义对)、通过用S1核酸酶处理从重新形成的双链体去除单链部分，和将得到的片段文库连接为表达载体。通过该方法可产生表达文库，所述文库编码感兴趣的蛋白质不同尺寸的N-末端和中间片段。
本领域已知若干技术用于筛选通过截短点突变产生的组合文库中的基因产物，和筛选cDNA文库中具有选定特性的基因产物。用于筛选大基因文库的最广泛使用的技术(其适合高通量分析)典型地包括将基因文库克隆进可复制的表达载体中、用得到的载体文库转化适当的细胞，和在下述条件下表达组合基因，所述条件下所期望的活性的检测有利于载体的分离，所述载体编码其产物被检测的基因。回归总体诱变(REM)——一种增强文库中功能突变体频率的技术——可与鉴定本发明蛋白质变体的筛选测定法组合使用(Arkin and Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897811-7815；Delgrave et al.(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。
除了所示的caroase 01-05基因序列(其中，caroase-01是SEQ ID NO01或02；caroase-02是SEQ ID NO03或4；caroase-03是SEQ ID NO05；caroase-04是SEQ ID NO06和caroase-05是SEQ ID NO07)外，本领域技术人员应当明白可能导致caroase蛋白质氨基酸序列改变的DNA序列多态性可存在于给定的种群中。这类遗传多态性可存在于来自不同群体或同一群体(由于天然等位突变)的细胞中。等位突变体也可包括功能等价物。
根据本发明的多核苷酸的片段也可包括不编码功能多肽的多核苷酸。这类多核苷酸可作为用于PCR反应的探针或引物作用。
根据本发明的核酸无论它们是否编码功能或非功能的多肽，均可用作杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)引物。不编码具有caroase 01-05活性的多肽的本发明核酸分子的用途包括，但不限于(1)从cDNA文库(例如来自除M.scorodonius之外的其他生物)分离编码caroase 01-05蛋白质的基因或其等位变体；(2)与分裂中期染色体图片原位杂交(例如FISH)，提供caroase 01-05基因的精确染色体定位，如Verma et al.，HumanChromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)所述；(3)Northern印迹分析，检测特定组织和/或细胞中caroase 01-05 mRNA的表达，和(4)探针和引物，其可用作诊断工具来分析给定生物学(例如组织)样品中核酸的存在，所述核酸能够与caroase 01-05探针杂交。
本发明还包括获得caroase 01-05基因功能等价物的方法。这类方法包括获得包括经分离核酸的被标记探针，所述核酸编码根据SEQ ID NO08-12任一序列的全部或部分或其任一的变体；用被标记的探针在允许所述探针与文库中核酸片段杂交的条件下筛选核酸片段文库，从而形成核酸双链体；和从任何标记的双链体中的核酸片段制备全长基因序列，获得与caroase 01-05基因相关的基因。
在一个实施方案中，本发明的caroase 01-05核酸与示出的核酸序列(分别是caroase-01为SEQ ID NO01或02；caroase-02为SEQ ID NO03或04；caroase-03为SEQ ID NO5；caroase-04为SEQ ID NO06和caroase-05为SEQ ID NO07)或其任一的补体为至少55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源或更同源。
在另一优选的实施方案中，本发明的caroase 01-05多肽与SEQ ID NO08-12任一分别所示的氨基酸序列为至少55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源或更同源。
多核苷酸 本发明提供编码漂白酶(过氧化物酶)的多核苷酸，所述漂白酶暂时被称作caroase 01-05，其具有SEQ ID NO08-12的氨基酸序列或其任一的功能等价物。编码caroase 01-05的基因的序列通过扩增得自Marasmiusscorodonius的cDNA获得。具有分别编码caroase-01和caroase-02的SEQID NO02和SEQ ID NO04的序列是被挑出来的基因的最优化版本，其中已发生密码子最优化。密码子最优化可根据本领域技术人员已知的方法使用，并特别适用于促进基因在宿主细胞中的表达。本发明提供包含caroase01-05过氧化物酶编码基因的多核苷酸序列。因此，本发明涉及经分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO01-07的核苷酸序列或其任一的功能等价物。Marasmius scorodonius中SEQ ID NO01-07具有漂白活性的发现非常惊人，特别是由于该序列与已知的漂白酶具有非常低的同源性。
更具体地，本发明涉及经分离的多核苷酸，其可在严格条件下(优选地在高严格度条件下)与SEQ ID NO01-07的多核苷酸杂交。有利地，这类多核苷酸可得自真菌，优选地得自丝状真菌，特别是得自Marasmiusscorodonius。更具体地，本发明涉及具有SEQ ID NO01-07核苷酸序列的经分离的多核苷酸。
此处和下文中使用术语“基因”和“重组基因”是指可从染色体DNA中分离的核酸分子，其包括编码蛋白质(例如M.scorodonius漂白酶)的开放读码框。基因可包括编码序列、非编码序列、内含子和调节序列。此外，基因是指本文定义的经分离的核酸分子。
本发明的核酸分子(如具有SEQ ID NO01-07核苷酸序列或其功能等价物的核酸分子)可使用标准的分子生物学技术和本文提供的序列信息被分离。例如。使用SEQ ID NO01-07核酸序列的全部或部分作为杂交探针，可使用标准杂交和克隆技术(例如如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，andManiatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY 1989中所述)分离本发明的核酸分子。
另外，可使用合成的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应(PCR)分离包括SEQ ID NO01-07全部或部分的核酸分子，所述引物根据SEQ ID NO01-07中包含的序列信息被设计。
可使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板，使用适当的引物根据标准PCR扩增技术扩增本发明的核酸。这样扩增的核酸可被克隆进适当的载体并通过DNA序列分析表征。
另外，对应于本发明核苷酸序列或与之杂交的寡核苷酸可通过标准合成技术(例如使用自动DNA合成仪)制备。
在优选的实施方案中，本发明的经分离核酸分子包含SEQ ID NO01-07中显示的核苷酸序列。该DNA包含分别编码根据SEQ ID NO08-12的M.scorodonius caroase 01-05多肽的序列。
在另一优选的实施方案中，本发明的经分离核酸分子包含下述核酸分子，所述核酸分子是SEQ ID NO01-07所示核酸序列的补体或这些核苷酸序列的功能等价物。
与另一核苷酸序列互补的核酸分子是与另一核苷酸序列充分互补使得其能够与另一核苷酸序列杂交形成稳定双链体的核酸分子。
本发明的一个方面涉及经分离的核酸分子(其编码本发明的多肽或其功能等价物，如生物活性片段或结构域)以及足够用作用于鉴定编码本发明多肽的核酸分子的杂交探针的核酸分子，和这类核酸分子的片段，所述片段适合用作PCR引物用于扩增或突变核酸分子。
“经分离的多核苷酸”或“经分离的核酸”是与两个编码序列均不紧邻的DNA或RNA，而在所述DNA或RNA来源的生物的天然存在基因组中，所述编码序列与所述DNA或RNA紧邻(一个位于5’端，一个位于3’端)。因此，在一个实施方案中，经分离的核酸包括与编码序列紧邻的一些或所有5’非编码(例如启动子)序列。该术语因此包括例如被整合进载体中、自主复制质粒或病毒中、或原核生物或真核生物基因组DNA中、或作为不依赖于其他序列的独立分子(例如通过PCR产生的或经限制性内切核酸酶处理的cDNA或基因组DNA)存在的重组DNA。其还包括是杂合基因部分的重组DNA，所述杂合基因编码额外的多肽，所述多肽基本不含细胞材料、病毒材料、或培养基(当通过重组DNA技术生产时)、或化学前体或其他化学品(当化学合成时)。另外，“经分离的核酸片段”是天然不作为片段存在的和在天然状态下不会发现的核酸片段。
本文使用术语“多核苷酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选是双链DNA。核酸可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸核苷酸)合成。这类寡核苷酸可用于例如制备核酸，所述核酸具有改变的碱基配对能力或提高的核酸酶抗性。
本发明的另一实施方案提供了经分离的核酸分子，所述核酸分子对caroase 01-05核酸分子(例如caroase 01-05核酸分子各自的编码链)是反义的。本文所述核酸分子的互补链也包括在本发明范围内。
序列错误 本文提供的序列信息不应当狭义地理解为要求包括错误鉴定的碱基。本文公开的特定序列可容易地用于从真菌(特别是M.scorodonius)中分离完整基因，所述完整基因随后可容易地被进行进一步的序列分析，从而鉴定序列错误。
除非另有说明，本文通过测序DNA分子测定的所有核苷酸序列都使用自动DNA测序仪测定，本文测定的由DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列都通过将如上测定的DNA序列翻译来预测。因此，如本领域针对通过该自动化途径测定的任何DNA序列所已知的，本文测定的任何核苷酸序列可含有一些错误。通过自动化测定的核苷酸序列与所测序的DNA分子的实际核苷酸序列典型地至少约90％相同，更典型地至少约95％到至少约99.9％相同。可通过其他途径(包括本领域公知的手动DNA测序法)更精确地测定实际地序列。如本领域还已知的，被测定的核苷酸序列中与实际序列相比的单个插入或缺失会在核苷酸序列翻译中引起读码框位移，从而从该插入或缺失开始，由所测定的核苷酸序列编码的预测氨基酸序列会与所测序DNA分子编码的实际氨基酸序列完全不同。
本领域技术人员能够鉴定这类错误鉴定的碱基并知道如何改正这类错误。
核酸片段、探针和引物 根据本发明的核酸分子可仅包含SEQ ID NO01-07中所示核酸序列的部分或片段，例如可用作探针或引物的片段，或编码caroase 01-05蛋白质部分的片段。从克隆caroase 01-05基因和cDNA测定的核苷酸序列允许产生探针和引物，所述探针和引物被设计为用于鉴定和/或克隆其他caroase01-05家族成员，以及来自其他物种的caroase 01-05同源物。探针/引物典型地包含基本上纯净的寡核苷酸，所述寡核苷酸典型地包含核苷酸序列的区域，所述区域在高严格度条件下优选地与SEQ ID NO01-07中所示核苷酸序列或其任一的功能等价物的至少约12或15个，优选地约18或20个，优选地约22或25个，更优选地约30、35、40、45、50、55、60、65或75个或更多的连续核苷酸杂交。
基于caroase 01-05核苷酸序列的探针可被用于检测例如在其他生物中编码相同或同源蛋白质的转录物或基因组caroase 01-05序列。在优选的实施方案中，探针还包含与其结合的标签基团，例如所述标签基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子。这类探针也可被用作诊断测试试剂盒的部分，用于鉴定表达caroase 01-05蛋白质的细胞。
同一性&同源性 术语“同源性”或“同一性百分比”在本文可互换使用。就本发明的目的而言，其在本文定义为为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，就最佳比较的目的将序列进行比对(例如可向第一氨基酸或核酸序列中引入缺口用于与第二氨基酸或核酸序列最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是两序列分享的相同位置数的函数(即同一性％＝相同位置/位置总数(即重叠位置)×100)。优选地，两个序列长度相同。
技术人员应当知道下述事实可获得若干种不同的计算机程序来测定两个序列之间的同源性。例如，可通过使用数学算法完成两个序列之间序列比较和同一性百分比的测定。在优选的实施方案中，用Needleman andWunsch(J.MoI.Biol.(48)444-453(1970))算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，所述算法已被整合进GCG软件包(可得自http://www.accelrys.com/solutions/bioinformatician/)的GAP程序中。技术人员会理解所有这些不同的参数会产生稍微不同的结果，但是使用不同的算法时两个序列之间的总体同一性百分比不会显著改变。
还在另一实施方案中，用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重测定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。在另一实施方案中，用E.Meyers and W.Miller(CABIOS，411-17(1989)的算法，使用PAM120重量残基表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比，所述算法已被整合进ALIGN程序(2.0版)中(可得自http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)。
本发明的核酸和蛋白质序列可进一步被用作“查询序列”针对公开数据库进行搜索，来例如鉴定其他的家族成员或相关序列。这类搜索可使用例如Altschul，et al.(1990)J.MoI.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序进行(分值＝100，字长＝12)来获得与本发明caroase 01-05核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用XBLAST程序进行(分值＝50，字长＝3)来获得与本发明caroase 01-05蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了就比较的目的获得有缺口的比对，可使用如Altschul et al.，(1997)NucleicAcids Res.25(17)3389-3402中所述的Gapped BLAST。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参阅http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
杂交 本文使用术语“杂交”旨在描述用于杂交和洗涤的条件，在所述条件下彼此至少约55％，至少约40％，至少约70％，更优选地至少约80％，进一步更优选地至少约85％到90％，更优选地至少95％同源的核苷酸序列典型地保持与彼此杂交。
这类杂交条件的优选的、非限制性实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃下杂交，然后在1X SSC，0.1％SDS中50℃下(优选地在55℃下，优选地在60℃下，进一步更优选地在65℃下)洗涤一次或多次。
高严格度条件包括例如在68℃下5x SSC/5x Denhardfs溶液/1.0％SDS中杂交和在0.2x SSC/0.1％SDS中室温下洗涤。或者洗涤可在42℃进行。
技术人员会知道应用于严格和高严格度杂交条件的条件。涉及这类条件的额外指导在本领域是容易获得的，例如见Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；andAusubel et al.(eds.)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley& Sons，N.Y.)。
当然，仅与Poly A序列(例如mRNA的3’端Poly(A)尾)或T(或U)残基的互补串杂交的多核苷酸不包括在用于与本发明核酸的一部分特异杂交的多核苷酸中，因为这类多核苷酸会与含有Poly(A)串或其补体的任何核酸分子(例如实际上任何双链的cDNA克隆)杂交。
从其他生物获得全长DNA 在典型的途径中，可筛选从其他生物(例如丝状真菌，特别是来自于Marasmius种)构建的cDNA文库。
例如，可通过Northern印迹分析筛选Marasmius菌株中同源的caroase01-05多核苷酸。通过检测与本发明多核苷酸同源的转录物，可使用本领域技术人员熟知的标准技术从分离自适当菌株的RNA构建cDNA文库。或者可使用能够与本发明caroase 01-05多核苷酸杂交的探针筛选全基因组DNA文库。
可例如通过进行PCR(其使用以本文所述核苷酸序列为基础设计的两个简并寡核苷酸引物池)分离同源的基因序列。
反应模板可以是通过反转录mRNA获得的cDNA，所述mRNA从已知能表达或被预测能表达本发明多核苷酸的菌株中制备。PCR产物可以被亚克隆并测序，以确保扩增的序列代表了新的caroase 01-05核酸序列或其功能等价物的序列。
可使用PCR片段通过多种已知方法分离全长cDNA克隆。例如，被扩增的片段可以被标记并用于筛选噬菌体或粘粒cDNA文库。或者被标记的片段可被用于筛选基因组文库。
也可使用PCR技术从其他生物分离全长cDNA序列。例如可按照标准方法从适当的细胞或组织来源分离RNA。可使用寡核苷酸引物对RNA进行反转录反应用于起始第一链合成，所述寡核苷酸引物对被扩增片段的5’端是特异的。
然后可使用标准的末端转移酶反应对得到的RNA/DNA杂交体“加尾)”(例如用鸟嘌呤)，所述杂交体可以用Rnase H消化，然后开始第二链合成(例如用Poly-C引物)。因此，可容易地分离被扩增片段上游的cDNA序列。关于有用的克隆策略的总数，参阅例如Sambrook et al.，上文；和Ausubel et al.，上文。
载体 本发明的另一方面涉及载体，优选地涉及表达载体，所述载体含有编码caroase 01-05蛋白质或其功能等价物的核酸。本文使用术语“载体”是指能够转运其所连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可连接额外的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可被连接进病毒基因组中。某些载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加体哺乳动物载体)通过引入宿主细胞被整合进宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起被复制。另外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。这类载体在本文中称作“表达载体”。通常，重组DNA技术中使用的表达载体常常是质粒的形式。术语“质粒”和“载体”在本文可互换使用，因为质粒是载体最常应用的形式。然而，本发明旨在包括具有等价功能的其它形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
本发明的重组表达载体以适合核酸在宿主细胞中表达的形式包含本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括以要用于表达的宿主细胞为基础所选择的一个或多个调节序列，所述调节序列与待表达的核酸序列可操作地连接。在重组表达载体中“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式连接(例如当载体被引入宿主细胞中时，在体外转录/翻译体系中或在宿主细胞中)。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达调控元件(例如多腺苷酸化信号)。这类调节序列描述于例如Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的序列，和仅在某一宿主细胞中指导核苷酸序列表达的序列(例如组织特异调节序列)。本领域技术人员应当明白表达载体的设计可取决于如下因素待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等。本发明的表达载体可被引入宿主细胞中，从而生产由本文所述的核酸编码的蛋白质或多肽(例如caroase 01-05蛋白质，caroase 01-05蛋白质的突变体形式，其片段、变体或功能等价物，融合蛋白等)。
本发明的重组表达载体可以被设计为用于在原核或真核细胞中表达caroase 01-05蛋白质。例如，caroase 01-05蛋白质可以在真菌细胞、细菌细胞如E.coli、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中进一步被讨论。或者重组表达载体可以被体外转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
本发明中有用的表达载体包括来自染色体、附加体和病毒的载体，例如来自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒(如杆状病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒)的载体和来自其组合的载体(如来自质粒和噬菌体遗传元件的载体，如粘粒和噬菌粒)。
DNA插入物可与合适的启动子(如噬菌体λPL启动子，E.coli lac、trp和tac启动子，SV40早期和晚期启动子和逆转录病毒LTR的启动子，仅列出一些)可操作地连接。其他合适的启动子应是技术人员已知的。在特定的实施方案中，优选使用能够在原核生物或丝状真菌中指导过氧化物酶高表达水平的启动子。这类启动子是本领域已知的。表达构建体可含有用于转录起始、终止的位点和(在被转录的区域中)用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分应包含位于待翻译多肽起点的转录起始AUG和适当地位于末端的终止密码子。
载体DNA可通过常规的转化或转染技术被引入原核或真核细胞中。本文使用术语“转化”和“转染”旨在表示用于将外源核酸(例如DNA)引入宿主细胞的多种本领域认可的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、转导、侵染、脂质转染、阳离子脂质介导的转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook，et al.(Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology(1986)和其他实验室手册。
对稳定的转染哺乳动物细胞而言，已知取决于所使用的表达载体和转染技术，只有一小部分细胞可以将外源DNA整合进它们的基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，通常将编码可选择标记(例如抗生素抗性)的基因与感兴趣的基因一起引入宿主细胞。优选的可选择标记包括赋予药物(如G418、潮霉素和甲氨喋呤(methatrexate))抗性的标记。编码可选择标记的核酸可在编码caroase 01-05蛋白质的相同载体上被引入宿主细胞，或可在单独的载体上被引入。可通过药物选择来鉴定被引入的核酸稳定地转染的细胞(例如引入了可选择标记基因的细胞会存活，而其他细胞会死亡)。
原核生物中蛋白质的表达通常在E.coli中使用含有组成型或诱导型启动子的载体完成，所述启动子指导融合或非融合蛋白质的表达。融合载体对其中被编码的蛋白质添加大量氨基酸(例如添加至重组蛋白质的氨基端)。这类融合载体典型地为三个目的服务1)提高重组蛋白质的表达；2)提高重组蛋白质的溶解度；和3)通过在亲和纯化中作为配体来帮助重组蛋白质的纯化。通常在融合表达载体中，在融合部分的接点和重组蛋白中引入蛋白水解切割位点，使得能够从融合部分分离重组蛋白，随后纯化融合蛋白。这类酶及其同源的识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。
如所指出的，表达载体应优选地含有可选择标记。这类标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，和用于在E.coli和其他细菌中培养的四环素或氨苄青霉素抗性。适当宿主的代表性实例包括细菌细胞如E.coli、Streptomyces和Salmonella typhimurium；真菌细胞如酵母；昆虫细胞如Drosophila S2和Spodoptera Sf9；动物细胞如CHO、COS和Bowes黑色素瘤；和植物细胞。用于上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域已知的。
载体中，优选在细菌中使用的是可得自Qiagen的pQE70、pQE60和PQE-9；可得自Stratagene的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A和可得自Pharmacia的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。载体中优选的真核载体是可得自Stratagene的PWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pZT1和pSG；和可得自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。技术人员应当容易地知道其他合适的载体。
在已知的细菌启动子中，用于本发明的包括E.coli lacl和lacZ启动子，T3和T7启动子，gpt启动子，lambdaPR、PL启动子和trp启动子，HSV胸苷激酶启动子，早期和晚期SV40启动子，逆转录病毒LTR启动子如Rous肉瘤病毒(″RSV″)的启动子和金属硫蛋白启动子如小鼠金属硫蛋白-I启动子。
可通过向载体中插入增强子序列提高高等真核生物对编码本发明多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约从10到300bp，其作用于提高启动子在给定宿主细胞类型中的转录活性。增强子的实例包括SV40增强子(其位于复制起点后侧bp 100到270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子，和腺病毒增强子。
为了将经翻译的蛋白质分泌进内质网腔中、壁膜间隙中或细胞外环境中，可将适当的分泌信号整合进表达的多肽中。该信号对多肽可以是内源的，或它们可以是异源信号。
可以以修饰的形式(如融合蛋白)表达多肽，并可不仅包括分泌信号，还包括额外的异源功能区。因此例如可向多肽N端添加额外的氨基酸(特别是带电氨基酸)区以促进纯化时或随后的操作和储存时在宿主细胞中的稳定性和持久性。还可向多肽添加肽残基以便于纯化。
宿主细胞 在另一实施方案中，本发提供了一种细胞，所述细胞为例如含有本发明核酸的经转化宿主细胞或重组宿主细胞。“经转化细胞”或“重组细胞”是通过重组DNA技术将本发明核酸引入其中(或引入其祖先中)的细胞。原核和真核细胞例如细菌、真菌、酵母等均被包括。
合适宿主细胞的实例为Microcystis，Lepista例如L.irina，Cyathus例如C.pallidus，Ganoderma例如G.applanatum，Ischnoderma例如I.Benzoinum，Marasmius例如M.scorodonius，Trametes例如T.versicolor的T.suaveolens，Cryptococcus例如C.laurentii，Hypomyces例如H.odoratus或Phaffia例如P.rhodozyma，Phanerochaete例如P.chrysosporium，Lentinula例如L.edodes，Coprinus例如C.cinereus，Gloeophyllum例如G.trabeum，Ophiostoma例如O.piliferum，Aspergillus例如A.niger、A.oryzae、A.nidulans，Thermomyces例如T.lanuginosa，Sporotrichum例如S.thermophile，Aureobasidium例如A.pullulans，Amorphotheca例如A.resinae，Leucosporidium例如L.scottii，Cunninghamella例如C.elegans。
特别优选的是来自丝状真菌，特别是Aspergillus(例如Aspergillusoryzae或Aspergillus niger)和Marasmius(例如Marasmius scorodonius)的细胞，或来自酵母如Pichia(例如Pichia Pastoris)的细胞，或来自细菌的细胞。
可选择下述宿主细胞，所述宿主细胞调节被插入序列的表达，或以特异的、所期望的方式修饰和加工基因产物。蛋白质产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可促进蛋白质发挥最佳功能。
多种宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物翻译后加工和修饰的特征性和特异的机制。分子生物学和/或微生物学领域技术人员熟悉的适当细胞系或宿主体系可以被选择，以确保所表达的外源蛋白质的所期望的和正确的修饰和加工。为此，可使用具有下述细胞机制(cellular machinery)的真核宿主细胞，所述细胞机制用于适当地加工原始转录物、糖基化和磷酸化基因产物。这类宿主细胞是本领域公知的。
宿主细胞还包括，但不限于哺乳动物细胞如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38和脉络丛细胞系。如果需要，根据本发明的多肽可通过被稳定转染的细胞系生产。公众可获得大量适用于稳定转染哺乳动物细胞的载体，用于构建这类细胞系的方法也是公众已知的，例如在Ausubel et al.(上文)中。
根据本发明的多肽在工业方法中的用途 本发明的另一方面包括本发明的多肽或其功能等价物(下文称作漂白酶)在工业方法中的用途，例如用作去污剂、酶石洗涤方法或食物(例如烘焙产品或乳制品)生产。
本发明的多肽可被作为酶制剂使用，或由能够生产所述酶的微生物原位生产。酶制剂可来自多种来源，例如来自植物、动物和微生物。优选地，所述酶制剂来自微生物，因为微生物允许以受控的方式以工业规模获得所述酶。可通过选定的细菌菌株的经典发酵过程，或通过发酵过表达本发明多肽的微生物获得来自微生物的酶制剂。所述微生物可以是细菌、真菌或酵母。用作非经典发酵中宿主细胞的合适微生物的实例参见上面对宿主细胞的讨论。
酶制剂也可包含其他合适的酶，如例如氧化还原酶、淀粉酶、脂肪分解酶、水解酶。已经惊人地发现氧化还原酶(例如己糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、麦芽糖氧化酶或葡萄糖氧化酶)的组合特别地对本发明漂白酶的酶活性具有协同效应。氧化还原酶可得自不同的来源，包括微生物。优选地使用来自真菌来源的氧化还原酶，例如来自丝状真菌。合适的氧化还原酶是可得自例如Aspergillus种(如Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶。本发明因此还涉及本发明多肽与氧化还原酶的新颖酶组合。
如果应用中存在氧化还原酶对其有活性的底物，则使用本发明的酶制剂的应用中该效应被进一步增强。如果所述底物不存在，则其也可以被添加至方法中。这类底物的实例是在使用己糖氧化酶或葡萄糖氧化酶时添加葡萄糖。本发明因此也涉及新颖的组合物，所述组合物包含酶制剂(其含有本发明多肽的)和氧化还原酶以及所述氧化还原酶的底物。
本发明还涉及新颖的酶组合和新颖的组合物在下文所述的本发明食品生产方法中的用途。
令人惊奇的是，我们发现根据本发明的多肽或其功能等价物可被用于提高食品的至少一部分的白度。优选地，本发明的漂白多肽被用于以下的食物生产方法中。用于生产食品的方法(其中所述食品的中间体形式包含色素)包括以下述用量添加至少一种本发明的多肽，与其生产中未添加所述酶的食品比，所述用量有效提高了食品的至少一部分的白度。
食品的中间体形式在本文被定义为生产过程中获得食品最终形式之前产生的任何形式。中间体形式可包含所使用的个体原料和/或其混合物和/或与添加剂和/或操作助剂的混合物，或其随后被加工的形式。
本发明的多肽以有效用量被添加。技术人员可通过改变酶剂量并测量色素降解和/或最终食品的白度提高而容易地确定该有效用量。如果所述酶能够转化β-胡萝卜素，则酶的有效用量可以按照β-降解单位来表达(例如Aziz或Zorn单位，参阅“材料和方法”) 可以从至少一种原料制造食品，所述原料为植物来源，如小麦面粉。后者已知含有色素如类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)和黄酮，它们导致烘焙出的面包的碎屑颜色。或者，这些色素可来自除植物原料以外的其他来源，例如来自乳。类胡萝卜素的实例是带有胡萝卜素主链的其他物质，特别是带有β-胡萝卜素或辣椒红素主链，更特别地是α-和β-胡萝卜素、叶黄质、番茄红素、百合黄素、辣椒红素、玉米黄素、堇黄素(violaxanthin)、虾青素、角黄素(canthaxanthin)、黄黄素(luteoxanthin)、新黄素和各自的脱-类胡萝卜素。
本发明方法的优选食品是从小麦面粉和/或来自其他谷物来源面粉烘焙的面包和其他烘焙产品。例如，对于烘焙的食品面包而言，中间体形式包括例如小麦面粉，其与其他面包成分如水、盐、酵母和面包改良组合物的原始混合物，混合的生面团，揉过的生面团，发酵的生面团和部分烘焙的生面团。如果酶能够转化β-胡萝卜素，则将酶以下述用量加入小麦面粉和/或来自其他谷物来源的面粉或加入与其他面包成分的任何原始混合物中，所述用量给予每千克面粉1和5000之间Zorn单位，优选地每千克面粉5和1000之间Zorn单位，更优选地每千克面粉10和500之间Zorn单位，最优选地每千克面粉25和250之间Zorn单位。所述酶也可以与面包改良混合物一起或作为其中的部分被添加，所述混合物是与其他生面团和/或本领域已知的面包改良操作助剂的混合物，所述面包改良操作助剂例如是本领域已知的一种或多种酶，例如淀粉酶如α-淀粉酶、β-淀粉酶、淀粉葡萄糖酶、防腐麦芽糖α-淀粉酶，脂肪分解酶如脂肪酶、磷脂酶、半乳糖脂肪酶，氧化酶如葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、漆酶、吡喃糖氧化酶、碳水化合物氧化酶，半纤维素酶如木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶，纤维素分解酶如内葡聚糖酶(如纤维素酶)、纤维二糖水解酶，蛋白酶和/或本领域已知的化学操作助剂如还原和氧化剂(例如脱落酸、谷胱甘肽)、乳化剂(例如DATEM)等等。
在一些类型的面条中，白色产物是人们所期望的。例如对面粉而言，中间体形式包括例如小麦面粉，其与水、盐和其他面条成分的原始混合物，混合的生面团和最终面条产物，所述最终面条产物可以是新鲜的、干的、煮好的、蒸好的和/或油炸的。
食品也可以是乳制品。乳制品是指以干燥固体计含有至少10wt％，优选地至少30wt％，更优选地至少50wt％，进一步更优选地至少70wt％或最优选至少80wt％的来源于乳的成分，优选牛乳。来源于乳的成分为例如脂肪、蛋白质例如乳清干酪凝乳和酪蛋白等。乳(特别是牛乳)可天然地含有有色化合物，如类胡萝卜素，例如β胡萝卜素。
白度对例如乳酪、黄油、乳粉或乳清产物具有重要的作用。例如对于乳酪如Feta、Mozzarella、Ricotta和蓝乳酪(例如Danish Blue、Roquefort或Gorgonzola)而言，白度被认为是所期望的。在山羊或绵羊乳至少部分地被牛乳取代的乳酪中，乳酪的白度会成为问题，因为牛乳中存在β-胡萝卜素。
对于一些乳酪而言，天然有色剂如胭脂树红或β-胡萝卜素被用作食物着色剂。然而，该着色剂也会存在于乳清中。当乳清被进一步加工为例如婴儿配方时，乳清产品的颜色是不期望的。对于食品软乳酪而言，中间体产物包括例如乳和乳酪凝乳。
可通过视觉或通过例如扫描的反射测定法来完成产物白度的测量。在反射测定法中，颜色用三个参数来定量L-因子(黑＝0到白＝100)、a-因子(绿＝-60到红＝+60)和b-因子(蓝＝-60到黄＝+60)。如果是类胡萝卜素，则所生产的产物的b-因子优选地尽可能接近0，优选地在10和0之间，更优选地在5和0之间，进一步更优选地低于1，最优选地低于0.5。另一方面，本发明提供可通过前文所述的本发明方法获得的食品。这些食品特征在于与通过下述生产方法获得的食品相比至少部分具有显著提高的白度，所述方法不包括添加一种或多种能够转化中间体产物中色素的酶。
另一方面，本发明提供能够转化色素的酶用于漂白食品(例如基于面粉或来自乳的产物)的用途。令人惊奇的是发现这些酶可有利地用作家居去污剂中的污渍去除剂。特别地，所述酶被证明对去除棉和合成(例如聚酯)织物上的有色污渍(例如草渍、咖啡和茶渍)非常有效。另外，所述酶还可用于酶石漂白方法中，例如将蓝色牛仔的锭蓝染料漂白至所期望的水平。
材料和方法 测量β-胡萝卜素的转化 根据Aziz测量β-胡萝卜素降解 可根据A.Ben Aziz(1971)，Phytochemistry 10，1445将酶活性测定为β-胡萝卜素转化活性。一个酶单位定义为每分钟转化1微克β-胡萝卜素的酶量(也称作Aziz单位)。
根据Zorn测量β-胡萝卜素降解 也可根据Zorn et al(2003)，Appl.Microbiol.Biotechnol.62331-336将酶活性测定为β-胡萝卜素转化活性。一个酶单位定义为每分钟转化1微摩尔β-胡萝卜素的酶量(也称作Zorn单位)。如下进行测定将1.5ml含酶样品在样品池中27℃下预孵育5分钟，然后加入100μl β-胡萝卜素储存溶液(参阅下文)。必要时，用柠檬酸/磷酸盐缓冲液pH 5.5(该缓冲液通过将43ml 0.1M柠檬酸与56ml 0.2M Na2PO4溶液混合制备)稀释浓缩的培养上清液。使用分光光度计在温度受控的试池架(cell holder)中在450nm和27℃下监控吸光度在15分钟内的降低。检查曲线的线性，用曲线的线性部分根据以下等式计算酶活性 酶活性[mU/ml]＝(ΔE×Vt)×106/(Vs×d×ε) 其中U＝上文定义的酶活性；ΔE＝450nm下每分钟吸光度的降低；Vt＝样品池中的总体积(ml)；Vs＝样品池中的样品体积(ml)；ε＝β-胡萝卜素的消光系数，其为95,000M-1cm-1；d＝样品池厚度(cm)] 可以通过将Aziz单位除以β-胡萝卜素的分子量(＝536.85)将Aziz酶单位转化为Zorn单位。
制备β-胡萝卜素储存溶液 如下制备β-胡萝卜素储存溶液将5mg β-胡萝卜素和500mgTween-80溶解于50ml二氯甲烷中。在旋转蒸发器中在40℃和800mbar下将二氯甲烷蒸发。当几乎所有二氯甲烷被蒸发时，加入30ml水，残余的二氯甲烷在旋转蒸发器中、最后在氮气流中排出。过滤得到的溶液并用水在有刻度的烧瓶中补充至50ml。溶液在冷藏(冰箱)中保存，仅稳定若干天。
漂白食品 如Gelinas，Cereal Chem.75，810-184(1998)所述从碎屑或生面团中抽提类胡萝卜素后测定漂白。如Gelinas(1998)所述通过从面包屑中抽提总脂质测定类胡萝卜素。
食品白度可通过视觉测定或通过反射测定法测定。视觉检查可通过将添加了漂白酶的食品与未添加漂白酶的对照比较来进行。反射测定法可通过在彩色扫描仪(Hewlett Packard ScanJet ADF)上扫描食品来进行。这些数据可使用LabSMART(LabSMART，LLC，Logan Utah，USA)程序分析。
实施例1 得自Marasmius scorodonius的β-胡萝卜素转化酶的培养及活性测定 如Zorn et al.(2003)所述培养得自Marasmius scorodonius的β-胡萝卜素转化酶caroase-1和caroase-2并测定其活性。为此，使用来自Marasmiusscorodonius培养物的菌丝体(得自Centraal Bureau voor Schimmelcultures-Utrecht，荷兰，保藏号CBS 137.83)接种补充有乳化的β-胡萝卜素的琼脂平板。将平板在24℃下孵育14天。用菌丝体接种含100ml标准营养溶液(SNL，含有30g/升葡萄糖·H2O；4.5g/升天冬酰胺·H2O；1.5g/升KH2PO4；0.5g/升MgSO4；3.0g/升酵母提取物；1ml/升灭菌的微量元素溶液，其含有5mg/l CuSO4*5aq、80mg/l FeCl3*6aq、90mg/l ZnSO4*7aq、30mg/l MnSO4*1aq和40mg/l EDTA；灭菌前用1N NaOH将pH调节至6.0)的300ml烧瓶，在150rpm的摇床中于24℃下孵育7天。检查预培养物不含细菌污染物，通过Ultra Turrax匀化并用于接种主要培养物(500ml Erlenmeyer烧瓶中250ml)。第二天起每天取出2ml样品，离心去除菌丝体，在分光光度计测定法中测量活性。培养4天后，每升无细胞上清液的β-降解活性大约为0.3Zorn单位。
实施例2 H2O2对得自M.scorodonius的β-胡萝卜素转化酶caroase-1和caroase-2活性的影响 如上所述在体外β-胡萝卜素降解试验中测定10微升20mM过氧化氢(H2O2)的影响。使用含有caroase-1和caroase-2的M.scorodonius浓缩培养上清液。存在H2O2时β-胡萝卜素降解活性从4.3提高至10.9mU。使用热灭活酶时，完全没有观察到β-胡萝卜素降解。这清楚地说明H2O2刺激β-胡萝卜素降解酶的β-胡萝卜素降解活性。
实施例3 Aspergillus niger葡萄糖氧化酶(GOX)对得自M.scorodonius的caroase-1和caroase-2活性的影响 将50微升浓缩的M.scorodonius培养上清液与1290微升50mM醋酸钠缓冲液(pH 5.5)混合。加入160微升500mM的葡萄糖溶液，将混合物在27℃调节5分钟。Aspergillus niger葡萄糖氧化酶得自Fluka。通过添加0-2微升的葡萄糖氧化酶储存液(100U/ml，对应于0-200mU GOX的活性)和100微升β-胡萝卜素溶液(如上文“材料和方法”中所述制备)起始反应。在27℃下记录10分钟450nm处吸光度降低(表1)。
表1在存在50mM葡萄糖和多种剂量GOX时使用浓缩的M.scorodonius培养上清液降解β-胡萝卜素 在第二组实验中，改变葡萄糖的浓度而保持葡萄糖氧化酶活性的量不变。因此，将50微升浓缩的M.scorodonius培养上清液与1434到1290微升50mM醋酸钠缓冲液(pH 5.5)混合，加入16-160微升的500mM葡萄糖溶液(表2)。将混合物在27℃保持5分钟，通过添加0-1微升GOX(对应于0到100mU的活性)和100微升β-胡萝卜素溶液起始反应。
表2在存在多种浓度的葡萄糖和100mU剂量的葡萄糖氧化酶时使用浓缩的M.scorodonius培养上清液降解β-胡萝卜素 空白样品(50mM葡萄糖，100mU GOX，不添加培养上清液)中未观察到β-胡萝卜素降解。
这些实验阐明存在葡萄糖时，GOX的存在强烈地刺激M.scorodonius浓缩上清液对β-胡萝卜素的降解。
实施例4和比较例A、B和C 小狗面包(Pup loaf)烘焙测试 在标准的烘焙方法中，小狗面包由200g小麦面粉(160g小麦面粉(

-Meneba，荷兰)和40克小麦面粉(

Meneba，荷兰)的混合物)、1.4g

干酵母(DSM Bakery Ingredients，Delft，荷兰)、4g盐、50ppm抗坏血酸、4ppm真菌α-淀粉酶

P500(DSM FoodSpecialties，Delft，荷兰)、60ppm真菌半纤维素酶

HS2000(DSM Food Specialties，Delft，荷兰)和表3所示数量的β-胡萝卜素降解酶和116ml水在多叶搅拌机(pin mixer)中搅拌6分15秒制成。生面团温度为28℃。混合后直接将生面团分为各150g的两块，弄圆，在30℃的醒发室中醒发45分钟，成形并装盘。在30℃最后醒发70分钟后，将面团在225℃烘焙20分钟。
在封闭盒中室温下储存24小时后，由烘焙师评价碎屑品质和烘焙的面包的颜色；如表4中所示在抽提面包屑后测定类胡萝卜素的量。
表3.酶剂量(表达为每200克面粉的Zorn单位) 表4.面包中类胡萝卜素含量和视觉鉴定 从表4可以得出结论通过向生面团中添加本发明的漂白酶，类胡萝卜素被降解，导致更白的碎屑。本发明方法的效率优于所使用的大豆酶脂肪氧化酶2，并至少等于或优于使用酶活性大豆粉。
实施例5 制备小乳酪 如Shakeel-Ur-Rehman et al.(Protocol for the manufacture of miniaturecheeses in Lait，78(1998)，607-620)所述生产小乳酪。通过在36℃加热30分钟对原料牛乳巴氏消毒。将经巴氏消毒的乳转移至广口塑料离心瓶(每瓶200ml)中并冷却至31℃。然后向离心瓶中每200ml经巴氏消毒的乳中加入0.72ml的起子培养物DS 5LT1(DSM Gist B.V.，Delft，荷兰)，使乳熟化20分钟。然后加入CaCl2(每200ml成熟的乳中加入132μL的1mol.L-1溶液)，随后加入促凝剂(每ml 0.04IMCU)。如果试验涉及使用caroase-01和caroase-02，则将该酶与促凝剂一起添加。
将乳溶液在31℃保持40-50分钟，直到形成凝块。用拉长钢丝的切刀将凝块手工切开，结构上间隔1cm。允许其愈合2分钟，然后温和搅拌10分钟。之后持续搅拌凝乳/乳清混合物下，在30分钟内将温度逐渐上升至39℃。达到pH 6.2后，在室温下以1,700g将凝乳/乳清混合物离心60分钟。将乳清的水分排干并在水浴中保持在36℃。每15分钟将乳清倒置，直到pH降至5.2-5.3，然后在1,700g室温下离心20分钟。进一步排干乳清水分后，通过扫描测定乳酪漂白。漂白酶caroase-01和caroase-02的使用产生了更白的乳酪。
序列表
<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司
<120>用于酶漂白食品的新颖酶
<130>24866WO
<160>17
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1536
<212>DNA
<213>Marasmius scorodonius
<400>1
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ggctcgatca cggagattca tcgtttacaa ggggaggctc gacccggtga ccagcaaggt660
cacgaacact ttggattcat ggatggaatc agtaacccgg ccgttgatgg atttacacct720
ccagcggaaa taagacctgg acaagcttta attccgcctg gtatcatgct tctcggagag780
gcaaacgaca cttttcagaa tgatcgtcct ccgtgggcca aagatggttc cttccttgtc840
ttccgtcaaa tgcaacagcg cgtgcccgag ttcaacaagt tcctgcaaga tcacgctctt900
aacatgccga atatgacatc cgagcaaggc gctgatctcc ttggtgccag gattgtagga960
cgatggaaaa gtggtgctcc tattgacctc actccgttgg tcgatgaccc agtgttggct1020
gctgacaatc agcgaaataa caacttcgac ttttctgtcg ccacgaatca gacacgttgc1080
cctttctctg ctcatatccg caaggctaac ccgcgcggcg atcttggggg tattaataaa1140
ttcccaaacc aacacataat ccgagcggga attccgtatg gacccgaagt taccgacgct1200
gaaaaagcgt caaatagctc tagcactgac cctagtctgg agcgtggtct ggcgtttgtg1260
gcctatcagt ctaatatcca gaacggattc gtattccttc aaaagaattg ggttgataat1320
acgaatttct tccgacccgg cactggtgta gatcctctca tcggtacaaa ttctcgtaac1380
agtggcaccg atgcccccaa cacgcctcgt gtcgtcagcg gcttggatcc taataacgct1440
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<213>Marasmius scorodonius
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Arg Thr Asn Ser Leu Leu Ile Asn Pro Asp Ala Gln Pro Asp Leu Pro
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Thr Ala Lys Gln Ala Ser Thr Ala Ala Ala Ser Val Gly Leu Asn Leu
50 55 60
Thr Asp Ile Gln Gly Asp Ile Leu Ile Gly Met Lys Lys Asn Lys Glu
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Met Phe Phe Phe Phe Ser Ile Ala Asp Ala Ala Ala Phe Lys Ser His
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Leu Gly Ser Ala Ile Leu Pro Leu Ile Thr Ser Thr Gln Gln Leu Leu
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Ala Val Ala Ser Gln Pro Thr Thr Ala Val Asn Leu Ala Phe Ser Gln
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165 170 175
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Gly Phe Met Asp Gly Ile Ser Asn Pro Ala Ile Asp Gly Phe Ser Thr
225 230 235 240
Ala Leu Pro Gly Gln Ala Val Leu Ser Pro Gly Leu Phe Leu Leu Gly
245 250 255
Glu Asp Gly Asp Gly Ser Ser Ser Ser Arg Pro Ser Trp Ala Lys Asp
260 265 270
Gly Ser Phe Leu Ala Phe Arg Gln Leu Gln Gln Arg Val Pro Glu Phe
275 280 285
Asn Lys Phe Leu Ala Asp Asn Ala Ala Leu Thr Gln Gly Asn Ala Asp
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Leu Leu Gly Ala Arg Met Met Gly Arg Trp Lys Ser Gly Ala Pro Val
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325 330 335
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340 345 350
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Leu Phe Phe Phe Phe Ser Val Thr Asp Ala Ala Thr Phe Lys Ala Lys
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305 310 315 320
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325 330 335
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Asp Ala Thr Asn Gln Thr Arg Cys Pro Phe Ser Ala His Ile Arg Lys
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Ala Asn Pro Arg Gly Asp Leu Gly Gly Ile Asn Lys Phe Pro Asn Gln
370 375 380
His Ile Ile Arg Ala Gly Ile Pro Tyr Gly Pro Glu Val Thr Asp Ala
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Glu Arg Ala Ser Agn Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ser Leu Glu Arg Gly
405 410 415
Leu Ala Phe Val Ala Tyr Gln Ser Asn Ile Gln Asn Gly Phe Val Phe
420 425 430
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435 440 445
Gly Ala Asp Pro Leu Ile Gly Thr Asn Ser Arg Asn Ser Gly Thr Asp
450 455 460
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Val
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Arg Thr Asn Ser Leu Leu Ile Thr Pro Pro Gln Gln Pro Pro Leu Pro
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Ser Ala Gln Gln Ala Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ala Gly Leu Asn Leu
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Thr Asp Ile Gln Gly Asp Ile Leu Ile Gly Met Lys Lys Asn Lys Glu
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Leu Phe Phe Phe Phe Ser Ile Thr Asp Ala Ala Thr Phe Lys Ala Lys
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Leu Gly Ser Asp Ile Leu Glu Leu Ile Thr Ser Thr Asn Gln Leu Leu
100 105 110
Ala Val Ala Thr Gln Pro Ile Thr Ala Val Asn Leu Ala Phe Ser Ser
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Thr Gly Leu Lys Ala Leu Gly Val Lys Asp Asp Leu Asn Asp Thr Val
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Phe Asp Ala Gly Met Leu Ser Asn Ala Val Ser Asp Leu Ser Asp Pro
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Gly Thr Gly Asn Trp Val Pro Gly Phe Val Gly Thr Ala Val His Gly
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Phe Leu Val Phe Arg Gln Met Gln Gln Arg Val Pro Glu Phe Asp Lys
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Gly Ala Glu Leu Leu Gly Ser Arg Met Val Gly Arg Trp Lys Ser Gly
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Ala Pro Ile Asp Leu Thr Pro Leu Val Asp Asp Pro Glu Leu Ala Ala
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Thr Arg Cys Pro Phe Ser Ala His Ile Arg Lys Thr Asn Pro Arg Ala
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Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ser Leu Glu Arg Gly Leu Ala Phe Val Ala
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Ile Gly Thr Leu Ser Asn Lys Asn Gly Asn Leu Pro Asn Thr Pro Arg
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Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Asn Pro Thr Gly Pro Pro Thr Glu
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Met Lys Leu Phe Ser Ala Ser Val Phe Ala Ala Ile Val Ala Ser His
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Tyr Ala Ser Ala Thr Ala His Ile Arg Ala Pro Asn Val Lys Pro Arg
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Arg Thr Asn Ser Leu Leu Ile Thr Pro Pro Gln Gln Pro Pro Leu Pro
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Ser Ala Gln Gln Ala Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ala Gly Leu Asn Leu
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Thr Asp Ile Gln Gly Asp Ile Leu Ile Gly Met Lys Lys Asn Lys Glu
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Leu Phe Phe Phe Phe Ser Val Thr Asp Ala Ala Thr Phe Lys Ala Lys
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Leu Gly Ser Asp Ile Leu Gly Leu Ile Thr Ser Thr Asp Gln Leu Leu
100 105 110
Ala Asn Asp Thr Gln Pro Val Thr Ala Val Asn Val Thr Phe Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Asp Asp Leu Lys Asp Pro Val
130 135 140
Phe Glu Ala Gly Met Leu Ser Asn Ala Val Ser Asp Leu Ser Asp Pro
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Gly Thr Gly Asn Trp Val Pro Gly Phe Val Gly Thr Ser Val His Gly
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Val Phe Leu Leu Ala Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Asn Thr Glu Leu
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Ala Asn Ile Gln Thr Ile Ser Asn Gly Ser Ile Thr Glu Ile His Arg
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Leu Gln Gly Glu Ala Arg Pro Gly Asp Gln Gln Gly His Glu His Phe
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Gly Phe Met Asp Gly Ile Ser Asn Pro Ala Val Asp Gly Phe Thr Pro
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Pro Ala Glu Ile Arg Pro Gly Gln Ala Leu Ile Pro Pro Gly Ile Met
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Leu Leu Gly Glu Ala Asn Asp Thr Phe Gln Asn Asp Arg Pro Pro Trp
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Ala Lys Asp Gly Ser Phe Leu Val Phe Arg Gln Met Gln Gln Arg Val
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Met Thr Ser Glu Gln Gly Ala Asp Leu Leu Gly Ala Arg Ile Val Gly
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Arg Trp Lys Ser Gly Ala Pro Ile Asp Leu Thr Pro Leu Val Asp Asp
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Pro Val Leu Ala Ala Asp Asn Gln Arg Asn Asn Asn Phe Asp Phe Ser
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Val Asp Asn Ala Asn Phe Phe Phe Gly Lys Thr Thr Pro Pro Gly Val
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Gly Pro Arg Pro Val Ser Gly Leu Asp Pro Thr Asp Ser Thr Lys Ile
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Gly Ile Ser Asn Pro Ala
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Glu
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Arg Gly Leu Ala Phe Val Ala Tyr Gln Ser Asn Ile
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<212>PRT
<213>Marasmius scorodonius
<400>17
Asp Phe Val Val Ser Arg Gly Gly Glu Tyr Phe Phe Ser Pro Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ile
权利要求
1.一种经分离的多肽，其具有漂白活性和选自以下的一种或多种特征
a.根据SEQ ID NO08-12任一的经分离的多肽或其任一的功能等价物；
b.经分离的多肽，其可通过在适当的宿主细胞例如Aspergillus niger中表达下述物质获得根据SEQ ID NO01-07任一的多核苷酸，或其任一的功能等价物，或包含所述多核苷酸或其任一功能等价物的载体，和
c.多肽，其至少包含SEQ ID NO13-17之一。
2.根据权利要求1的根据SEQ ID NO08-12的经分离多肽或其任一的功能等价物，所述功能等价物与SEQ ID NO08-12至少55％同源。
3.根据权利要求1的根据SEQ ID NO08-12的经分离多肽或其任一的功能等价物，所述功能等价物与SEQ ID NO08-12至少65％同源。
4.根据权利要求1-3中任一项的经分离多肽，所述多肽可得自Marasmius scorodonius。
5.一种经分离的多核苷酸，所述多核苷酸能够与根据SEQ ID NO01-07的多核苷酸或其功能等价物杂交。
6.根据权利要求5的经分离寡核苷酸，所述寡核苷酸在高严格度条件下能够与根据SEQ ID NO01-07的多核苷酸或其功能等价物杂交。
7.根据权利要求5或6的经分离多核苷酸，所述多核苷酸可得自真菌，优选地得自丝状真菌。
8.根据权利要求7的经分离多核苷酸，所述多核苷酸可得自Marasmius，优选地得自M.scorodonius。
9.一种经分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1的多肽。
10.一种经分离的多核苷酸，其编码根据SEQ ID NO08-12的多肽或其功能等价物的至少一个功能结构域。
11.一种经分离的多核苷酸，其包含根据SEQ ID NO01-07的核苷酸序列或其功能等价物。
12.根据SEQ ID NO01-07的经分离的多核苷酸。
13.一种载体，其包含根据权利要求5到12中任一项的多核苷酸序列。
14.根据权利要求13的载体，其中根据权利要求5到12中任一项的所述多核苷酸序列与调节序列可操作地连接，所述调节序列适用于所述多核苷酸序列在合适的宿主细胞中的表达。
15.根据权利要求14的载体，其中所述合适的宿主细胞是丝状真菌或细菌。
16.一种用于制造根据权利要求5到12任一项的多核苷酸或根据权利要求13到15任一项的载体的方法，包括步骤培养用所述多核苷酸或所述载体转化的宿主细胞，从所述宿主细胞分离所述多核苷酸或所述载体。
17.一种经分离的多肽，所述多肽能够通过在适当的宿主细胞中表达根据权利要求5-12中任一项的多核苷酸或根据权利要求13-15中任一项的载体来获得。
18.一种重组的漂白酶，其包含caroase 01-05多肽的功能结构域。
19.一种用于制造根据权利要求1到4或17任一项的多肽的方法，包括步骤用根据权利要求5到12任一项的经分离多核苷酸或根据权利要求13到15任一项的载体转化合适的宿主细胞，在允许所述多核苷酸表达的条件下培养所述细胞，和可选地从所述细胞或培养基中纯化所编码的多肽。
20.一种重组的宿主细胞，其包含根据权利要求5到12中任一项的多核苷酸或根据权利要求13到15中任一项的载体。
21.一种重组的宿主细胞，其表达根据权利要求1到4或17中任一项的多核苷酸。
22.根据权利要求1到4或17中任一项的多肽的用途，用于与未使用多肽的食品相比提高食品的至少一部分的白度。
23.一种用于生产食品的方法，其中所述食品的中间体形式包含色素，所述方法包括以下述用量添加根据权利要求1到4或17中任一项的至少一种多肽，所述用量有效地将所述色素直接转化为下述形式，所述形式导致与其生产时未添加所述多肽的食品相比，食品的至少一部分的白度提高。
24.根据权利要求23的方法，其中所述食品由面粉制成，优选地由小麦面粉制成。
25.根据权利要求23的方法，其中食品是乳制品。
26.根据权利要求23到25中任一项的方法，其中色素是类胡萝卜素。
27.根据权利要求23到26中任一项的方法，其中添加酶，所述酶是来自微生物的酶制剂或由能够生产所述酶的微生物原位生产的酶制剂。
28.根据权利要求27的方法，其中添加酶，所述酶是来自细菌、真菌或酵母或由它们原位生产的酶制剂。
29.根据权利要求28的方法，其中所述真菌属于Marasmius属，优选地属于Marasmius scorodonius。
30.根据权利要求23-29中任一项的方法，其中在生产食品时还额外地添加氧化还原酶。
31.能够通过根据权利要求23到30中任一项的方法获得的食品。
32.根据权利要求1到4或17中任一项的多肽直接将色素转化为下述形式的用途，所述形式导致食品的至少一部分的白度提高。
33.根据权利要求1到4或17中任一项的多肽用于去污剂或酶石漂白过程的用途。
全文摘要
本发明涉及根据caroase01-05的新颖的多肽或它们中任一的任何功能等价物，其适用于制备具有提高的白度的食品的方法；所述酶用于提高至少食品一部分的白度的用途；用于制备食品的方法，其中使用所述酶；和所获得的食品。
文档编号C12N9/00GK101223270SQ200680025579
公开日2008年7月16日 申请日期2006年7月12日 优先权日2005年7月12日
发明者霍尔格·佐恩, 马诺拉·希尔本恩, 巴贝尔·胡尔斯旦, 拉夫·干特尔·贝尔格, 莱克斯·博尔德, 罗埃尔弗·伯恩哈德·梅玛 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司