从琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中回收dna、rna或蛋白质片段的系统的制作方法

专利名称：从琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中回收dna、rna或蛋白质片段的系统的制作方法
从琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA、 RNA或蛋白质片段的系统技术领域生物技术、分子生物技术、生物技术平台、电化学、电分析化学。本发明是关于一种用于从琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中分离 DNA、 RNA或蛋白质片段的技术。本发明介绍了在使用琼脂糖凝胶或聚 丙烯酰胺凝胶(下文将称为凝胶)电泳后，收集凝胶中存在的DNA片段、 RNA片段或蛋白质片段的各种方法中的一种方法。在琼脂糖凝胶的情况下，电泳主要用于DNA或RNA，而在聚丙烯 酰胺凝胶的情况下，电泳主要用于蛋白质，但是偶尔可用于DNA或RNA。
背景技术：
在使用电泳后，通常将凝胶中的DNA、 RNA或蛋白质片段切成凝 胶片。为了提高所需片段的选择性，应该将它们沿每条泳带切成片。有 几种方法可用于从切片的凝胶中收集DNA、 RNA或蛋白质。常用的方法是将切片的凝胶放入透析管中，填充适当的缓冲溶液， 然后在电泳槽中再次使用电泳。于是凝胶中的片段就会出现，收集管中 除凝胶外的其他内容物。通过分离所收集的缓冲溶液和片段可以收集所 需片段。或者，在使用化学药品或加热溶解切片的凝胶后，直接放入细玻璃 珠、磁性物质或树脂使各片段结合在一起。然后通过分离结合的玻璃珠、 磁性物质或细树脂，可以从中收集所需片段。相比蛋白质而言，更多不同方法可用于收集DNA或RNA片段。将 膜放入注射器圆筒中，然后将切片琼脂糖凝胶放入其中。用适宜的压力 推动注射器活塞，向下磨碎凝胶。 一直推动活塞，以收集粘附在膜上的 DNA。在切片的凝胶上滴一滴或两滴缓冲溶液。将凝胶置于阴极射线和阳 极射线之间，通过供电将电荷传送到缓冲溶液和凝胶。于是凝胶中的DNA将被推入缓冲溶液中。以这种方式，可以提取缓冲溶液中所含的 DNA。在带盖塑料管的两个侧面上形成孔并放上膜。将切片的凝胶放入管 中，并在盖上盖后将膜与凝胶放置成对齐。将管放入电泳槽中，使电荷 传送到在两个侧面上放置膜的地方，以便可以提取凝胶中的DNA、 RNA 或蛋白质。 一定时间过后，当将要提取凝胶中的DNA、RNA或蛋白质时， 倒转管，以便在从膜提取DNA、 RNA或蛋白质前使其移到电荷流的相反 方向。然后取出管中的缓冲溶液并收集其中的片段。如上所述可以使用各种技术，但是最普遍的技术是使用过滤柱。将 含有玻璃元素的一张滤纸放入柱中。把凝胶切成片，使用化学药品溶解， 然后使溶解的溶液渗透进入过滤柱。使片段与滤纸中的玻璃元素结合， 以便通过洗涤可以提取DNA。 一种提取蛋白质的流行方法是只使用树脂 的方法。这种方法是最普遍使用的一种方法，并且关于这种特殊方法的 具体技术正在快速进展中，其将成为生物科学工业中的重要核心。发明内容技术问题生物科学工业的最终目标是质量生活的延伸。为了达到此目标，各 领域和形式都在发展。其中，在许多容易想象的任务存在下，分子生物 学行进步伐非常缓慢。从DNA领域到蛋白质领域的研究，包括最基本 DNA、些许高级的RNA和接近目的的蛋白质的发现，已经相继和同时在 进行中。这些研究计划通常由不同的分段工作构成。它们通常采取不同途径， 但只有少数在要求时能形成完成短区段计划的组合。这些工作多数用手 完成，并且从工作性质考虑需要受过良好教育的人。出于这些原因，研 究的前进步伐不可避免地比科学家所希望看到的慢。对科学家而言，研 究步伐与科学家大脑的速度保持一样快将会非常理想。这种需要要求一种被称为自动化的技术，而在DNA研究中自动化主要用于碱基序列的分 析。然而，碱基序列分析之前的阶段仍由分段工作构成。有鉴于上述问题，本发明的技术提出一种自动化的技术方案，并且 为省时、高再现性以及未来自动化的技术线索铺平道路。技术方案在本发明中，使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将与DNA、 RNA或蛋白质片段相同宽度的薄膜(ll)以较小间距放置于凝胶上。在薄 膜上形成狭缝(12)并填入缓冲溶液或电解液，然后在缓冲溶液或电解液的 上部连接电泳电极(21) (+，-)。尽管经常连接正电极，但是根据待收集的 片段的电荷，可以连接负电极。附图显示了如何处理与电极(21)连接的电 泳槽盖(图2、图3)。与电泳槽盖(图2、图3)连接的电极(图2)通过狭缝 浸没在缓冲溶液或电解液中。 一旦在凝胶(14)上完成电泳，则通过截断片 段方向的电源(31、 32)并将其转向与盖连接的电极(21)(图2b),使DNA、 RNA或蛋白质片段流进狭缝(12)中的缓冲溶液或电解液。然后通过聚集 缓冲溶液或电解液收集DNA、 RNA或蛋白质片段。在狭缝(12)的下部(14)有孔，此处的下部指与狭缝接触的琼脂糖凝胶 的上部或聚丙烯酰胺凝胶的一面(93)。狭缝(12)由一片薄膜构成(图7)， 而提取DNA、 RNA或蛋白质需要多于一个像薄膜的面(图7)。向薄膜另 一面供给缓冲溶液或电解液，并且向供给的缓冲溶液或电解液上施加电 泳电源(62)。在凝胶的上部或凝胶的里面放置狭缝或薄膜的一面，对于由狭缝、 一个狭缝或多于一个的狭缝构成的狭缝而言，通过将电荷的起点或终点 限定在狭缝内，可以将DNA、 RNA或蛋白质片段聚集于狭缝内。这就是 此方法与传统方法的不同之处，传统方法只可以通过将凝胶切片来收集 DNA、 RNA或蛋白质片段。有几种已知的方法用于从琼脂糖凝胶中收集蛋白质、DNA和聚丙烯 酰胺。这些方法的共同之处是必须在电泳后将凝胶切片，并且为了切片 而停止电泳。'如果相继研究针对同一目标而进行的八个实验，就很容易理解本发明的结构。在使用普通电泳进行DNA、 RNA或蛋白质的分离及确认过程 的情况下，给出以下实验条件。下列条件基于水平的情况。相同条件也 可以用于垂直的情况，在此情况下，将位置由水平转为垂直可以得到相 同的结果。第一，当使用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳时(图5)，片段通常 从负电极(41)流向正电极(42)。对于凝胶板(43)，在片段方向形成孔(44) 并使用缓冲溶液填充孔(44)。当使用电泳时，各种片段(45)—旦到达孔就 迅速穿过(48)孔而到达孔的另一面。即使将荧光物质或染料用于片段使其 发光，但是凭裸眼仍不能直接观察到片段穿过(48)孔的场面。此时，可以 观察到(48)的是围绕孔的片段(47)从负电极消失，然后在正电极方向出 现。如果此时截断电流并收集孔(49)中的缓冲溶液，可以提取到非常少量 的各种片段。如果将可以吸收DNA、 RNA或蛋白质片段的材料，即细玻璃珠、 磁性物质或树脂放入缓冲溶液或电解液中，然后一起取出，那么效率会 极大提高。第二，当使用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳时，如果在电源负 极(51)和电源正极(52)之间将非导电材料与凝胶(53)连接起来，就会形成 与非导体相同宽度的不能电泳的阴影(54)区段。但是如果用允许电流自由流动的导体(53)代替非导体与其连接，则从导体到负电极方向会发生电泳 (57)。如果使用电泳直至片段到达电源正极，则从导体到电源正极会形成 阴影(57)。第三，按照上述第二个实验组合导体与非导体，以此方式形成薄膜 (65)，使得导体(62)与正电极连接，而非导体(61)与负电极连接。导体(63) 被设置成与非导体(65)的上部(66)重叠，并且覆盖至非导体上部的某一高 度。将其称作"双薄膜"作为它的俗名。使用凝胶电泳后，连接"双薄 膜"(图7、图8)到待收集片段的正电极方向，即，片段泳带边缘的正方 向。当"双薄膜"与凝胶板连接时，导体应面对正电极方向，而非导体 应面对负电极方向，并且凝胶不应该接触"双薄膜"的非导体上部的导 体(62)。将电解液或缓冲溶液沿"双薄膜"的非导体方向滴入，即负电极方向。此时，不允许电解液或缓冲溶液扩散，而是使其停留在待提取的 泳带上。电荷流动从正电极开始，然后通过"双薄膜"的导体、"双薄膜"非导体上部的导体(62)、和电解液或缓冲溶液，直至到达片段。片段在被 电解液或缓冲溶液阻止之前，沿着电荷流动的相反方向前进。此外，如 果使用移液管移取缓冲溶液，则可以简单地收集各种片段。因此，使用 此实验可以收集凝胶上的片段。第四，可以使用另一种实验方法以不同方式制作"双薄膜"。向与缓 冲溶液或电解液接触的"双薄膜"的一面加入由非导体(73)制成的薄膜， 使缓冲溶液或电解液不扩散而保留在安全区域内(图10、图11)。以这种 方式制作的"双薄膜"也被称为"双薄膜孔"，而非导体薄膜与"双薄膜" 之间的空间被称为"狭缝"，有时也被称为"孔"。当电泳结束时，调整 "狭缝"到待收集片段泳带的上部(74)。将"双薄膜孔"(图10、图11) 与凝胶连接，然后在再次使用电泳之前将缓冲溶液或电解液放入"孔" 中。以这种方式，可以从"狭缝"的电解液或缓冲溶液中收集DNA或 RNA片段。如果将"双薄膜孔"的"双薄膜"下部剪掉而不是与凝胶连接，则 可以得到(图12)所示的结果。只除去正电极的导体部分并且直接将电源 正极与其上部连接。截断电泳的电源正极并向与电泳的电源负极相连接 的电源正极和"双薄膜孔"的上部提供电流。于是从"狭缝"可以收集 DNA、 RNA或蛋白质片段以及缓冲溶液或电解液。第五，如图15所示，制作具有不同导体位置的"双薄膜孔"。在下 部建一座桥(101)，并且在桥上形成一个像帘子一样的隔板(101)。将"双 薄膜孔"(图16)放入将要在电泳中分离的样品的泳道上。当确认将要凝胶中提取的片段正好在狭缝下面时，停止正在进行的 电泳，向导体连接部分的电源和相关的电源供电。于是从负电极(lll)方 向，即任意x轴(113)方向，流向正电极(112)方向的片段将同时向任意y 轴(114)和任意z轴(115)方向移动。此处y轴(114)指x轴(113)水平面的垂 直方向，z轴(115)指x轴和y轴平面的垂直方向。移动的片段将包含在 狭缝或孔的缓冲溶液或电解液中。此处在"双薄膜孔"的情况下，y轴方向的下部(116)比x轴方向的 下部(117)还要向下。因此，当使用多泳道电泳时，可阻止相邻泳道的各 片段相混合。从凝胶孔底到凝胶底的高度(92)应该高于"双薄膜孔"y轴 下部的高度。第六，上述实验结果表明，DNA、 RNA或蛋白质片段可以通过电泳 得到部分收集。当使用多泳道电泳时，必须配备可以收集多泳带片段的 装置。因此，应该将它们的"双薄膜孔" 一个接一个地水平和垂直放置。 直接连接薄膜孔的导体和电源正极，或者从"双薄膜孔"完全除去导体， 并将正电极插脚直接浸泡在缓冲溶液或电解液中。当制作琼脂糖凝胶或 聚丙烯酰胺凝胶时，凝胶中的孔(94)的位置应该在与薄膜孔(即，狭缝)对 齐的x轴(95)方向，并且凝胶中的孔(94)的底面高度(94)(S卩，凝胶中的孔 (92)的底面位置)应该高于"双薄膜孔"下部的y轴(102)方向下部的高度。 此方法将避免提取片段时相邻泳道的片段偶然混合的可能性。通过将缓 冲溶液或电解液放入狭缝中，并使用狭缝的正电流和相同轴线的负电流 提取片段。第七，当在使用电泳后将要收集片段时，将"双薄膜孔"以重叠形 式(图17)置于琼脂糖凝胶(图13)或聚丙烯酰胺凝胶(93)上。"双薄膜孔" 在正电极里面应该具有导体。可以按照图12的状态制作"双薄膜孔"， 其中切去其用于连接的下部，而不是如第四个实验所示与凝胶连接。在任意x轴线上使用电泳后，保留负电流而关闭正电流。使用"双 薄膜孔"的导体供电，并且为电泳供应负电流，为"双薄膜孔"的导体 供应正电流。当用于在狭缝中聚集片段所需时间结束后，切断电源，并 收集狭缝中的缓冲溶液或电解液以收集其中的片段。最后的方法从制作(图18)所示的琼脂或聚丙烯酰胺凝胶板开始。如 图19和图20所示，"双薄膜孔"由导体(131)和非导体(132)构成。当欲 将其置于凝胶板上使琼脂或聚丙烯酰胺转化为凝胶时，在凝胶切片后将 其置于固化的凝胶板上。使用非导体作为狭缝。当将"双薄膜孔"置于 凝胶中以固化凝胶时，确保液化凝胶不会在狭缝之间流动。在检査使用 电泳进行的片段分离和使用缓冲溶液或电解液填充狭缝后，使电荷从狭 缝(132)侧流向片段(133)侧，以将待收集的DNA、RNA或蛋白质片段(133)送到狭缝(132)侧。以这种方式，将DNA、 RNA或蛋白质片段(133)收集 到狭缝(134)中。在需要多泳道电泳的情况下，将多个插脚置于泳道之间，然后如上 所述顺次使用电泳。有益效果上述发明已经整合了以往在RNA、 DNA或蛋白质片段确认(传统电 泳工作的下一步骤)后所作的单独提取工作，因此节省了时间并允许由连 续工作代替无关联的多阶段手动操作。本方法还在只有分离和确认功能 的电泳过程中加入了量化和纯化的新过程。电泳技术还不能发挥其全部功能，因为还没有办法收集电解的物质， 而不管它是否是电解作用的一部分，但是电泳技术已开创了一个新纪元， 即通过促进收集而从组织、细胞、动物血液和植物中直接提取DNA、 RNA、甚至蛋白质。这将是一项使手动操作自动化的基础性技术，特别是提高了工作的 再现性，并将成为生物科学领域的一项有益发明。


图1显示了本发明的凝胶板。 图2显示了向凝胶板提供电源。图3显示了向凝胶板提供电源的电极的后部分，其中背面的电路与 电极相分离。图4显示了本发明的凝胶板。图5显示了在有孔存在时，片段穿过孔的顺序。图6显示了当使用电泳时导体和非导体的排列。图7和图8显示了本发明中片段收集装置的最基本形式和其操作原理。图9、图IO和图11显示了比图7和图8更有效地收集片段的装置。图12显示了比图9、图10和图11更有效地收集片段的装置。图13和图14解释了凝胶表面和孔之间的距离以及x轴方向。图15显示了当同时收集大量片段时，不会被相邻泳道污染的原理。图16简要显示了同时收集大量片段而不被相邻泳道污染的装置。图17显示了不管片段尺寸如何而从相同样品同时收集大量片段的 装置。图18、图19和图20显示了帮助生产大量易于使用的收集装置的设备。附图主要部分的附图标记说明11:薄膜12:狭缝13:凝胶铸件和凝胶板14:凝胶16: L，待纯化和收集的诸如DNA、 RNA、蛋白质和组织等实验对象放入其中31、 32、 41、 42、 51、 52、 71、 72、 81、 111、 112:电源的电极或导线44:含有缓冲溶液或电解液的孔 45: DNA、 RNA或蛋白质片段 53:非导体 55:导体62、 63、 66:包括导体的板65:由非导体制成的薄板 53:非导体 55:导体62、 63、 66:包括导体的板65:由非导体制成的薄板74:包括部分导体和非导体的双重板的薄膜孔92:放置实验对象的孔和凝胶外壁之间的厚度103:关于为了不被相邻泳道污染，而应该薄于厚度92的说明113、 114、 115:关于x、 y和z轴电泳部分的详细理论说明具体实施方式
为了使本发明的效果最大化，这将是从收集装置中分离凝胶的最佳 方式，并且在分离后通过独立地进行确认过程和收集过程，用户使用新 技术说明而无需脱离现有方法就能获得便利。发明实施方式作为放置图1中凝胶的凝胶铸件，图2a的盖部分作为下侧，而图 2b作为上侧。它们的组合使得能够进行分离、纯化和收集。工业实用性大多数在生物基因工程实验室中进行的实验通常是需要大量手动操 作的第一阶段实验。本发明对这些实验将有很大帮助，并且通过作为使 手动操作自动化的技术背景，将为生命科学进程做出实质性的贡献。
权利要求
1. 片段在琼脂糖凝胶上沿着电流流动的x轴方向流动，在x轴方向形成孔，所述片段将移向所述孔，并使用片段吸收剂收集所述孔中的片段，一种收集缓冲溶液或电解液的方法，以及一种利用所述孔中的剩余片段进行另一个过程的方法。
2. 片段在聚丙烯酰胺凝胶上沿着电流流动的x轴方向流动，在x轴 方向形成孔，所述片段将移向所述孔，并使用片段吸收剂收集所述孔中 的片段， 一种收集缓冲溶液或电解液的方法，以及一种利用所述孔中的 剩余片段帮助进行下一个过程的设备。
3. 片段在二维聚丙烯酰胺凝胶上沿着电流流动的x轴方向流动，并 且当电流在y轴方向流动时片段也流动，在y轴方向形成孔，所述片段 将移向所述孔，使用片段吸收剂收集所述孔中的片段， 一种收集缓冲溶 液或电解液的方法，以及一种利用所述孔中的剩余片段帮助进行下一个 过程的设备。
4. 通过切断水平面上x轴的电流并使用垂直面上z轴方向的电流， 使片段垂直移向收集装置，其中在水平面上电流在琼脂糖凝胶上流动， 并且通过在z轴方向上施加电流使片段垂直移动而进行收集，以及一种 通过使其在z轴方向移动而不是试图收集来帮助从所述收集装置进行下 一个过程的设备。
5. 通过切断水平面上x轴的电流并使用垂直面上z轴方向的电流， 使片段垂直移向收集装置，其中在水平面上电流在聚丙烯酰胺凝胶上流 动，并且通过在z轴方向上施加电流使片段垂直移动而进行收集，以及 一种通过使其在z轴方向移动而不是试图收集来帮助从所述收集装置进 行下一个过程的设备。
6. 通过切断水平面上x轴的电流和水平面上y轴的电流并使用与两条线垂直的垂直面上Z轴方向的电流，使片段垂直移向收集装置，其中 在水平面上电流在二维聚丙烯酰胺凝胶上流动，并且通过在Z轴方向上 施加电流使片段垂直移动而进行收集，以及一种通过使其在Z轴方向移 动而不是试图收集来帮助从所述收集装置进行下一个过程的设备。
7. 通过在水平面的x轴和与x轴垂直的z轴的总和方向施加电流， 使片段移向收集装置，其中在水平面上电流在琼脂糖凝胶上流动，与x 轴相似，在水平面的y轴和与y轴垂直的z轴的总和方向上施加电流， 使片段移向所述收集装置，并且在由x轴、y轴和z轴形成的平面的某一 起点方向上施加电流后，通过在水平面和z轴的总和方向施加电流，使 片段移向收集装置，并移动片段进行收集，以及一种帮助从所述收集装 置进行下一个过程而不是试图收集的设备。
8. 通过在水平面的x轴和与x轴垂直的z轴的总和方向施加电流， 使片段移向收集装置，其中在水平面上电流在聚丙烯酰胺凝胶上流动， 与x轴相似，在水平面的y轴和与y轴垂直的z轴的总和方向上施加电 流，使片段移向所述收集装置，并且在由x轴、y轴和z轴形成的平面的 某一起点方向上施加电流后，通过在水平面和z轴的总和方向施加电流， 使片段移向所述收集装置，并移动片段进行收集，以及一种帮助从所述 收集装置进行下一个过程而不是试图收集的设备。
9.置，在平面的某一起点方向上施加电流后，通过 在水平面和z轴的总和方向施加电流，使片段移向所述收集装置，并移 动片段进行收集，以及一种帮助从所述收集装置进行下一个过程而不是 试图收集的设备。
10. 通过将电流从使用琼脂糖凝胶电泳的x轴转向水平面上的y轴 方向，使片段移向收集装置，并且通过在y轴方向上施加电流使片段移 动而进行收集，以及一种通过使其在y轴方向移动而不是试图收集来帮助从所述收集装置进行下一个过程的设备。
11. 通过将电流从使用聚丙烯酰胺凝胶电泳的x轴转向水平面上的y 轴方向，使片段移向收集装置，并且通过在y轴方向上施加电流使片段 移动而进行收集，以及一种通过在y轴方向移动它们而不是试图收集来 帮助从所述收集装置进行下一个过程的设备。
12. 通过向收集装置施加电流使片段移向收集装置，其中所述收集 装置用于经使用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到的片段，并移动片段 进行收集，以及一种帮助从所述收集装置进行下一个过程而不是试图收 集的设备。
13. 可以使电流流向容纳用于收集片段的缓冲溶液或电解液的容器 或狭缝的电极，浸在缓冲溶液或电解液中的长度大于0.01 mm但小于90 mm的电极，浸在缓冲溶液或电解液中的宽度大于0.01 mm但小于90 mm 的电极。
14. 容纳用于收集片段的缓冲溶液或电解液的容器或狭缝，其中如 图7和图8所示，导体被部分涂布。
15. 容纳缓冲溶液或电解液、用于收集片段的容器或狭缝，其中如 图5所示，薄膜被部分涂布。
16. 容纳用于使用电泳装置收集片段的缓冲溶液或电解液的容器或 狭缝，其壁宽大于0.01mm但小于40mm。
17. 收集装置的孔底和凝胶底部之间的距离(84)和所述收集装置从y 轴下部的底部到凝胶底部的长度(85)(68)很短。
18. 对于收集装置，必须具有狭缝，其长度(79)大于0.4 mm但小于 40mm，其长度(79)大于孔长度(80)的1/5但小于孔长度的40倍，其宽度大于孔宽度的1/10但小于孔宽度的10倍。
19. 能够将<-><+>电流的流动方向从x轴转向与x轴相应的y轴方 向的电泳槽，其中为在琼脂电泳槽中进行电泳初始设定x轴。
20. 在电泳槽中能够将<-><+>电流的流动方向从x轴方向或y轴方 向转向z轴方向的装置。
21. 对于电泳槽，放置凝胶或凝胶板的部分必须由透明材料制成， 以使光线可以穿透，而其余部分呈黑色或类似色，以使光线可以被部分 吸收。
全文摘要
本发明涉及一种直接收集琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上的DNA、RNA或蛋白质的装置，所述DNA、RNA或蛋白质是在对其使用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳后经分离和纯化得到的。本发明已经改进了收集凝胶中DNA、RNA或蛋白质片段的传统方法，传统方法是将凝胶切片，以收集对DNA、RNA或蛋白质电泳后经分离和纯化后得到的DNA、RNA或蛋白质片段。本发明提供了一种系统，所述系统在使用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳后，确认经电泳的DNA、RNA或蛋白质片段，然后通过另一电泳将DNA、RNA或蛋白质送到所需位置来收集DNA，其中所述系统集成了根据电荷的流动方向或逆方向提取DNA、RNA或蛋白质的过程，并且利用不同于传统系统的电泳系统来提取DNA、RNA或蛋白质。
文档编号C12M1/42GK101233224SQ200680028027
公开日2008年7月30日 申请日期2006年8月1日 优先权日2005年8月1日
发明者郑在景 申请人:郑在景