用于siRNA细胞内输送的siRNA-亲水性聚合物结合物及其方法

专利名称：用于siRNA细胞内输送的siRNA-亲水性聚合物结合物及其方法
技术领域：
本发明涉及siRNA (小分子干扰RNA)分子与亲水性聚合物之间的 结合物，所述结合物可有效用于癌症和其它传染病的基因治疗，还涉及 通过所述结合物与多官能阳离子化合物之间的离子相互作用而形成的聚 电解质复合物胶束。
背景技术：
对基因治疗所使用的安全而有效的基因转移技术进行研究已经有很 长时间，并由此研制了各种基因转移工具和基因输送系统。特别是已经 研制了基于腺病毒和逆转录酶病毒的载体以及用脂质体、阳离子脂质和 阳离子聚合物的非病毒载体作为基因转移工具。然而，将病毒用作使治
疗基因转移到靶细胞内的工具时，会产生如下重要问题没有证据表明 在将转移基因整合到宿主染色体内后，转移基因不会导致宿主基因功能 失常和/或致癌基因激活。此外，即使病毒基因以少量持续表达，也可能 会诱发自身免疫应答。而且，如果作为基因转移工具的病毒在宿主中出 现变异，则变异的病毒可能会感染宿主，宿主免疫系统会不能有效地保 护自身免受变异病毒的侵犯。因此，优选使用脂质体、阳离子脂质或 聚合物的基因输送系统，而不选用病毒载体，相关的研究旨在改善各系 统的缺点。虽然这些非病毒基因转移载体的效果逊于病毒载体，但优势 在于由于其负作用小因而安全，生产成本低因而经济，因此可以对改善
的非病毒载体进行工业化生产。
目前，药物输送系统和基因输送系统中出现的最重要方法是靶特异 性输送。当直接体内给药时，人体的每个器官和每个细胞均受到药物的 同等作用，并且无论希望与否，对正常的细胞和组织以及受损或感染的
细胞和组织均有破坏。为防止此问题发生，目前对药物输送系统(DDS)
的大量研究均用于开发一种用于药物和基因的选择性输送技术。例如，
将诸如叶酸(folate)、半乳糖、抗体等典型的组织/细胞特异胜配体直接 引入药物或与药物转运体结合，以使药物输送效率达到最大，同时使其 对正常细胞的药物副作用达到最小。将此组织/细胞特异性配体用于制备转运体以开发基于基因的治疗剂，则在细胞内的输送效率有望达到最大。
同时，胶束由具有亲水部分和疏水部分的分子以特定的比例在水溶 液环境中通过自组装而自发形成以达到最大的热力学稳定性。胶束内部 是疏水的，因此可容易地捕获水不溶性药物，而胶束表面是亲水的，因 此胶束系统促进了水不溶性药物和药物输送载体等的增溶作用。具有疏 水内芯和亲水外壳的胶束在水溶液环境中通过疏水相互作用达到稳定， 或者通过具有相反电荷的聚电解质之间的离子相互作用可以实现胶束的 增溶作用。聚乙二醇(PEG)结合的聚电解质与另一具有相反电荷的聚 电解质自发缔合形成具有胶束结构的复合物，被称为聚电解质复合物胶
束(Kataoka, K.等，Macrowo/ecw/w， 29， 8556-8557, 1996)。由于聚
电解质复合物胶束具有尺寸很小、尺寸分布十分均匀以及自缔合结构的 特点，因而利于药物制备的质量控制和再现性，所以聚电解质复合物胶 束比其它药物输送系统例如微球体或纳米粒子更具吸引力。
用于生物体的药物输送聚合物应当是生物相容的。这些生物相容聚 合物的代表性例子是PEG。由美国食品药品监督管理局(FDA)获准体 内使用的PEG已经在蛋白特性改善、聚合物表面修饰和基因输送的广泛 应用中长期使用。作为最广泛使用的生物相容聚合物之一的PEG具有极 好的水溶性、低毒性和免疫原性。此外，PEG还能通过修饰聚合物的表 面性质强烈抑制药物输送中使用的聚合物对蛋白的吸收。
同时，自从有报导siRNA对动物细胞(zooblast)内特定基因的表达 有极好的抑制作用以来，作为基于基因的治疗剂，siRNA就成为引起诸 多关注的物质。实际上，因其高活性和精确的基因选择性，siRNA有望 成为经过20多年的研究目前用作治疗剂的反义寡核苷酸(ODN)的替代 治疗剂。siRNA是一条短的、由约19 23个核苷酸构成的双螺旋RNA 链，抑制具有与其互补的碱基序列的靶mRNA的表达。
然而，因为silfNA稳定性很低并在体内快速降解，所以极大地降低 了其治疗效率。尽管可以提高昂贵的siRNA的剂量，但其阴离子性质阻 止其渗透过带有负电荷的细胞膜，因而导致siRNA转运至细胞内区室的 水平很低(Celia M.等，C7zem/c"/ fl"t/ 7Vevw Decem6er， 22，
32-36， 2003)。此外，尽管siRNA是双链，但与DNA中脱氧核糖的连接相比，RNA中核糖的连接具有很大的化学不稳定性，大多数siRNA的 体内半衰期为约30分钟并且快速降解。
根据近期关于增强siRNA稳定性的研究，已将各种官能团引入 siRNA以防止裂解酶的作用(Frank Czauderna等，7Vwc/e/c爿c/c^ i e;yearc/z， 31， 2705-2716， 2003)。然而，确保siRNA稳定性和有效的细胞膜渗透 性的技术仍处于研发阶段。研究还表明因为siRNA分子在血液中的不稳 定性，只是应该持续地引入高浓度的siRNA以实现siRNA的治疗作用。 然而遗憾的是，据报导该方法效率非常低。甚至从经济的角度看，也需 要开发一种促进作为基于基因的治疗剂siRNA的细胞内输送的新转运剂 的技术。

发明内容
因此，本发明的目的是提供siRNA分子和生物相容的亲水性聚合物 之间的结合物，以提高siRNA的细胞内输送效率，其中所述聚合物通过 可降解或不可降解的连接结合于siRNA的正义链或反义链的末端。
本发明的另一目的是提供通过所述结合物与阳离子化合物之间的相 互作用产生的聚电解质复合物胶束。
为了实现上述目的和优点，提供了如下式所示的相互共价连接的 siRNA-亲水性聚合物结合物
P-X-Y
其中，P是亲水性聚合物，X是无连接体作为媒介的 (linker-nonmediated)共价键或有连接体作为媒介的(linker-mediated) 共价键，Y是siRNA分子。
在本发明的结合物中，siRNA优选的分子量为10,000 30，000。 在此范围内，siRNA包括19 30个核苷酸，优选19 23个核苷酸。siRNA 非限定性的例子可优选来源于c-m少c、 c-m_y6、 c-/cw、 c-乂""、 c-ra/、 c-wc、 &c/-2、血管内皮生长因子(VEGF) 、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D或 PIGF。
此外，所述亲水性聚合物可优选来源于分子量为1,000 10,000的非
离子聚合物。所述亲水性聚合物的例子可包括非离子亲水性聚合物，例如PEG、聚乙烯吡咯烷酮、聚噁唑啉或其组合。
此外，共价连接(即式中的X)可以是不可裂解的连接或可裂解的 连接。不可裂解的连接可包括酰胺键或磷酸键，可裂解的连接可包括 二硫键、酸可裂解的连接、酯键、酐键、生物可降解的键或酶可裂解的 连接，但不限于此。
优选地，本发明的siRNA-亲水性聚合物结合物可在该结合物的末端 进一步引入细胞特异性配体。所述细胞特异性配体可包括细胞特异性抗 体、细胞特异性肽、细胞生长因子、叶酸、半乳糖、甘露糖、RGD或铁 传递蛋白，但不限于此。
本发明的另一个方面提供了一种通过将siRNA分子的末端基团与亲 水性聚合物共价键合，从而制备P-X-Y形式的siRNA-亲水性聚合物结合 物的方法，该方法包括以下步骤选择预定的siRNA分子；将所述siRNA 分子与亲水性聚合物共价键合，其中P是亲水性聚合物，X是无连接体 作为媒介的共价键或有连接体作为媒介的共价键，Y是siRNA分子。
制备siRNA-亲水性聚合物结合物的方法还可包括激活siRNA官能 团的步骤，所述的共价键合步骤可优选包括激活siRNA官能团的步骤， 以及将所述激活的官能团与亲水性聚合物共价键合的步骤。待激活的官 能团可包括胺基、硫醇基、磷酸基或其组合，但不限于此。优选地，激 活siRNA官能团的材料包括l-乙基-3，3-二乙基氨基丙基碳二亚胺、咪唑、 N-羟基琥珀酰亚胺、二氯己基碳二亚胺、N-(5-顺丁烯二酰亚胺丙酸、N.-p-顺丁烯二酰亚胺丙氧基琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚胺基吡啶基二硫代丙 酸酯等。
图1显示了在siRNA分子与亲水性聚合物例如PEG之间形成结合物 的过程示意图。如图所示，位于双链siRNA正义链3'端的伯胺基与杂官 能团键合剂例如:^-琥珀亚酰胺基-3- (2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(在下文 中，縮写为SPDP)的活性NHS基团反应，生成2-吡啶基二硫化物激活 的siRNA。随后，将末端带有巯基的甲氧基-PEG (mPEG-SH)力口到2-吡啶基二硫化物激活的siRNA上。通过巯基-二硫化物交换反应，形成了 与二硫键(-s-s-)连接的siRNA-s-s-PEG结合物(siRNA-PEG)。本发明的另一个方面还提供了通过siRNA-亲水性聚合物结合物与阳
离子化合物之间的离子相互作用形成的聚电解质复合物胶束。所述阳离 子化合物可包括阳离子肽、阳离子脂质、阳离子聚合物或其组合，但不 限于此。
所述阳离子肽的非限定性的例子可包括KALA(赖氨酸-丙氨酸-亮氨 酸-丙氨酸)、聚赖氨酸、鱼精蛋白或其组合，所述阳离子脂质的非限定 性的例子可包括二油酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇二油酰卵磷脂或其组合， 所述阳离子聚合物的非限定性的例子可包括聚乙烯亚胺(在下文中，縮 写为PEI)、聚胺、聚乙烯胺或其组合。
此外，本发明提供了一种制备聚电解质复合物胶束的方法，包括以 下步骤制备siRNA-亲水性聚合物结合物；以及将所述结合物和阳离子 化合物混合。
具体地，将siRNA与生物相容的亲水性聚合物通过共价键合得到的 结合物，将所述结合物与多价阳离子聚合物、脂质类或肽类混合，通过 离子相互作用生成本发明的聚电解质复合物胶束。由此获得的siRNA-亲 水性聚合物结合物和聚电解质复合物胶束用于改善siRNA的细胞内输 送，可用于治疗各种疾病。有关结合物合成、聚电解质复合物胶束形成 及其性质、细胞内输送效率和对疾病模型的治疗作用的更多细节将下文 加以证实。
本发明的另一个方面还提供了一种基因治疗的方法，包括以下步骤 制备聚电解质复合物胶束；将所述的聚电解质复合物胶束引入动物体内。 尽管对动物种类没有限制，本发明基因治疗的方法优选用于人类。然而， 很明显本方法同样适用于除人类以外的动物。
本发明的另一个方面还提供了包含siRNA-亲水性聚合物结合物或聚 电解质复合物胶束的药物组合物。
为了更好地给药，除上述活性成分外，所述组合物还可含有至少一 种药学上可接受的载体。重要的是所述药学上可接受的载体必须与本发 明的活性成分相容。此载体的例子包括盐溶液、灭菌水、Ringer氏溶液、 缓冲盐溶液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精(水)溶液、甘油、乙醇及其混合物。如需要，可加入典型的添加剂，例如抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂等。 而且，通过加入更多添加剂，例如稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合 剂和润滑剂等，可将上述组合物制成在药学上用于注射的水溶液、悬浮 液、乳液等形式。而且，根据疾病种类或成分的不同，可使用常规方法 或i e/m'"gtow、 /Vwrmacez^/cfl/ 5We"ce (最新版本)，Mack Publishing Company, Eastern PA所述的方法制备成具有药物用途的组合物。
本发明所应用的技术领域的专家可基于患者的典型症状和疾病严重 程度确定本发明的药物组合物。所述组合物可以制备成各种形式，例如 粉剂、片剂、胶囊剂、溶液剂、注射剂、软膏剂、糖浆剂等，还可以单 剂量容器或多剂量容器的形式，例如以密封安瓿或密封瓶的形式提供给患者。
本发明的药物组合物可以口服或胃肠道外途径给药。尽管不限制药 物组合物的给药途径，但该组合物可以不同给药途径接触身体，包括口 服给药、静脉给药、肌内给药、动脉内给药、髓内给药、鞘内给药、心 内给药、经皮给药、皮下给药、腹腔内给药、肠内给药、舌下给药和局 部给药。
为了用于上述临床给药，可使用常规技术制备具有足量产物的本发 明的药物组合物。例如，如果所述组合物需要口服给药，可以将其与无 活性的稀释剂或可食用的载体混合，密封在硬质或软质明胶胶囊里或压 成片剂。在口服给药的情况下，将活性化合物与赋形剂混合，以口服片 剂、口含片、锭剂(troches)、胶囊剂、酏剂、混悬液、糖浆剂、糯米 纸囊剂(wafers)等形式使用。另一方面，在对本发明的药物组合物进行 注射给药或胃肠道外给药的情况下，其生产可使用本发明所应用的技术 领域的公知方法或任何常规方法来实现。组合物剂量随患者体重、年龄、 性别、健康状况、饮食、给药时间、给药方法、排空率、疾病严重程度 等而变化，必须由专家(医生)确定。


图1是简要描述亲水性聚合物PEG与siRNA分子结合为含有在细胞 内可裂解的二硫键的结合过程的示意图。图2是简要描述siRNA聚电解质复合物胶束概念的示意图。
图3是使用反相HPLC分析含有可生物降解的二硫键的siRNA-亲 水性聚合物结合物和裸siRNA的色谱图。
图4示出在类似于体内环境的10mM谷胱甘肽的存在下，含有可生 物降解的二硫键的siRNA-亲水性聚合物结合物的二硫键裂解的照片。
图5是简要描述siRNA和亲水性聚合物例如PEG之间形成的含有不 可裂解的连接的结合物的示意图，在该结合物中引入癌细胞特异性配体 (叶酸)。
图6示出通过DLS方法测量的siRNA-PEG/KALA (阳离子肽)聚电 解质复合物胶束尺寸的图。
图7示出为评价在血液中的稳定性，分别使用裸siRNA、 siRNA-PEG 结合物和siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束，在血清蛋白存在下 siRNA随时间降解程度的电泳照片。
图8示出含有可生物降解的二硫键的hVEGF siRNA-PEG结合物与 KALA之间通过相互作用生成的聚电解质复合物胶束对人前列腺癌细胞 系(PC-3)中VEGF表达抑制程度的图。
图9示出在移植了人前列腺癌细胞系(PC-3)的动物模型中，含有 可生物降解的二硫键的hVEGF siRNA-PEG结合物与KALA之间通过相 互作用生成的聚电解质复合物胶束对肿瘤生长抑制程度的图。
图10示出(a)裸siRNA、 ( b )siRNA-PEG结合物和(c)siRNA-PEG/PEI
聚电解质复合物胶束的稳定性的照片。样品于37。C下在含有50%FBS的 培养基中进行培养。
图11示出在由siRNA/PEI复合物(黑条)禾n siRNA-PEG/PEI聚电 解质复合物胶束(灰条)处理的PC-3细胞中，VEGF基因表达抑制作为 N/P比值函数(A)禾BsiRNA量函数(B)的图。
图12示出在siRNA/PEI复合物(黑条)禾B siRNA-PEG/PEI聚电解 质复合物胶束(灰条)转染的PC-3细胞中，10。/。FBS对VEGF基因沉默 作用的图。对照细胞未经siRNA处理(白条)。图13示出VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束对PC-3细胞 中VEGF mRNA下调的RT-PCR分析照片。泳道1:未处理；泳道2: VEGF siRNA/PEI复合物；泳道3: VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束； 泳道4: GFP siRNA/PEI复合物;泳道5:错义(scrambled) siRNA/PEI 复合物；泳道6:错义siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束。人-(5-肌动 蛋白用作对照。转染反应在含有10%FBS的培养基中进行。
图14示出在使用各种VEGF siRNA配方转染的PC-3细胞中VEGF
基因沉默作用的照片。
图15示出各种VEGF siRNA配方瘤内注射进入PC-3肿瘤异种移植 后的抗癌作用的照片，PC-3肿瘤异种移植由(a) PBS、 (b)错义 siRNA-PEG/PEI、 (c) VEGF siRNA、 (d) VEGF siRNA/PEI禾口 (e) VEGF siRNA-PEG/PEI处理。
图16示出由各种siRNA配方处理后，瘤内VEGF蛋白量的图。
图17示出RT-PCR分析测定的瘤内VEGF mRNA水平的电泳照片 人(5-肌动蛋白用作对照。泳道l:未处理；泳道2:错义siRNA-PEG/PEI; 泳道3:未修饰的VEGF siRNA;泳道4: VEGF siRNA/PEI;泳道5: VEGF siRNA-PEG/PEI 。
图18示出PC-3肿瘤异种移植的免疫组织化学图像的照片，PC-3肿 瘤异种移植由(A) PBS、 (B)错义siRNA-PEG/PEI、 (C)未修饰的VEGF siRNA、 (D) VEGF siRNA/PEI和(E) VEGF siRNA-PEG/PEI处理。(F) 示出PC-3肿瘤的瘤内微血管密度的分析图。
图19示出全身静脉注射各种VEGF siRNA配方后肿瘤体积变化的图。
图20示出全身静脉注射各种VEGF siRNA配方后VEGF蛋白量的图。
图21示出通过静脉给药方式，将不同VEGF siRNA配方进行全身给 药后，采用RT-PCR所得的关于肿瘤内VEGF mRNA量的结果曲线，其
中人P-肌动蛋白作为对照组泳道1: PBS;泳道2:错义siRNA-PEG/PEI;
泳道3:未修饰的VEGF siRNA;泳道4: VEGF siRNA/PEI;泳道5: VEGFsiRNA-PEG/PEI。
图22是siRNA聚电解质复合物(A)和寡脱氧核苷酸(ODN)聚电 解质复合物(B)之间基因抑制作用的对比图。
具体实施例方式
参照如下关于本发明的优选实施方式的详细描述及其包含的实施 例，可以更容易地理解本发明。
本发明的siRNA-亲水性聚合物结合物具有siRNA与亲水性聚合物 相互共价连接的形式，具有下式表示的结构
P-X-Y
其中P是亲水性聚合物，X是无连接体作为媒介的共价键或有连接 体作为媒介的共价键，X是siRNA分子。
在本发明的结合物中，亲水性聚合物(P)优选来源于分子量为 1,000 10,000的非离子聚合物。亲水性聚合物的非限制性的例子可包括 非离子亲水性聚合物，例如PEG、聚乙烯吡咯垸酮、聚噁唑啉或其组合。 在上述分子量范围内，优选适于增强结合物在血液中稳定性的亲水性聚 合物，所述结合物由阳离子聚合物和siRNA形成。
亲水性聚合物的官能团可由其它官能团取代。例如，巯基(-SH)、 羧基(-COOH)或胺基(-NH2)可以取代羟基(-OH)。在亲水性聚合物 中，优选PEG用于合成本发明的结合物，因为PEG具有可引入不同分子 量和官能团的末端，具有高的人体亲和性(anthr叩hophilic)，不诱导免 疫反应，并增加水溶性，因此改善了体内的基因输送效率。在siRNA与 亲水性聚合物之间发生结合时，为了使siRNA引起的RNAi作用的降低 减至最小，PEG在正义链的3'端与siRNA发生所期望的结合。
在本发明的结合物中，siRNA优选分子量为10,000 30,000。在此 范围内，siRNA可以是包括19 30个核苷酸，优选19 23核苷酸的双 链低聚物形式，可对靶基因的表达具有抑制活性。本发明的siRNA可以 是用于治疗或研究用途的任何siRNA。 siRNA的非限制性的例子可优选 来源于可能用于基因治疗的任何基因的siRNA，例如，c-mjc、 c-my6、c如、c如、c-ra/、 c，、 6c/-厶或VEGF、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D 或PIGF。
在本发明的优选实施例中，hVEGF siRNA用于抑制VEGF的表达。 VEGF与存在于人血管内皮细胞表面的VEGF受体结合，用以促进内皮 细胞的生长和迁移，因此促进了新血管形成。特别是，因为癌细胞生长 或转移与新血管形成紧密相关，因此作为治疗癌症的新方法，抑制新血 管形成用以抑制癌细胞生长引起诸多关注。
siRNA正义链或反义链的3'端基团可由另一官能团取代。例如，可 以用胺基、巯基或磷酸基取代siRNA3'端的羟基。
本发明的结合物具有P-X-Y结构，其中X代表连接体或仅是将亲水 性聚合物(P)与来自于siRNA (Y)的残基共价键合的共价键。对作为 亲水性聚合物与来自于siRNA的残基的端基之间的共价键的媒介的连接 体不加限制，只要其在预定条件下视需要可降解。即，在合成siRNA和 /或亲水性聚合物的结合物的过程中，激活siRNA和/或亲水性聚合物的 任意化合物可用作连接体X。例如，认为激活物质SPDP与在3'端具有 胺基的siRNA键合，生成激活的siRNA，使末端的胺基激活成吡啶基二 硫醇基。通过使用该激活的siRNA作为原料(或反应物)、使用具有巯 基修饰PEG (SH-PEG)作为亲水性聚合物单元(P)，结合物中的X结 构变为-NH-CO-CH2-CH2-S-S-。换句话说，X可以是反应物(即，结合 物制备过程中的亲水性聚合物和siRNA)的激活过程产生的残基部分(连 接体)，或在反应不需要激活步骤的情况下，在亲水性聚合物和siRNA 的官能团之间只是简单地无连接体的共价键。X可视siRNA所要输送的 靶的不同而不同，可以是不可裂解的连接或可裂解的连接。不可裂解的 连接可包括但不限于酰胺键或磷酸键，可裂解的连接可包括二硫键、酸 可裂解的连接、酯键、酐可裂解的键、生物可降解的键或酶可裂解的连 接。优选地，X是二硫键。
当siRNA是分子量为约30,000的、由长的核苷酸链构成的情况下， 例如，尽管存在与siRNA结合的亲水性聚合物，siRNA低聚物的两条链 可以稳定地结合成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，该复合物(RISC) 是一种参与基因表达抑制的细胞内酶复合物。同时，当siRNA是分子量约为10，000的、具有19个核苷酸的情况下，其在细胞内与RISC结合的 过程中，其结构稳定性可能会因亲水性聚合物引入siRNA末端而降低。 因此，理想的是引入能在体内或细胞内分解的可裂解的连接。该键的例 子优选包括在细胞内被细胞质内大量存在的谷胱甘肽裂解的二硫键、进 入细胞后在酸性环境下能轻易且有效裂解的酸可裂解的连接、进入细胞 后能轻易且有效裂解的酯键、酑键、刚要进入细胞之前被存在于特定细 胞周围的酶裂解的酶可裂解的连接。
据报导，根据结构改变之处的不同，siRNA的化学修饰使其对应的 活性降低10% 50%，并且在某种程度上引发细胞毒性(M.Amarzguioui, 等，7Vwc/e/ci 仏，31， 589-595， 2003)。在本发明的优选实施方 式中，为了使由于结合亲水性聚合物例如PEG引起RNAi的活性损失减 至最小，将亲水性聚合物与siRNA正义链的3'端结合，在siRNA和亲水 性聚合物之间引入可裂解的二硫键，以使得在还原性的细胞内环境下释 放出完整的siRNA (参见图4)。在细胞液环境中，由于存在谷胱甘肽二 硫化物(GSSG)还原酶，保持还原硫醇态(GSH)的细胞内谷胱甘肽高 于98% (W. Wang，等，尸/zwmaco/. i ev., 50， 335-356， 1998)。细胞内 GSH可以轻易地将siRNA和亲水性聚合物之间的二硫键裂解，由此产生 完整的siRNA (参见图10)。在细胞液中，裂解的siRNA分子首先相遇， 与RISC蛋白相互作用，以启动一系列RNAi过程。在这种意义上，完整 siRNA的细胞内再生将完全维持RNAi活性和特异性。在siRNA与亲水 性聚合物例如PEG结合的情况下，考虑到结合物的结构，较为优选的是 二硫键。在细胞内，引入siRNA正义链5'端的PEG可从siRNA分离出 来，这不会阻止siRNA和RISC之间复合物的形成。
同时，反义寡脱氧核苷酸(ODN)和PEG通过不可裂解的连接结合， 本发明者由此制备了反义ODN/PEG/PEI聚电解质复合物胶束(JH Jeong, 等，A.oc—g. C/z缝，16， 1034-1037， 2005)。所述反义ODN的基因抑 制机制与siRNA的基因抑制机制很不相同。与siRNA不同的是，ODN 不与蛋白复合物结合，而是直接结合于靶mRNA序列并使其降解。因此， 对ODN而言，从亲水性聚合物中分离出来并不是绝对必要的(A,Kalota, 等，Ca證嵐n 3， 4-12， 2004)。另一方面，在siRNA与亲水性聚合物结合的情况下，亲水性聚合物会提供相当大的空间位阻而阻止形
成siRNA-RISC复合物。因此，为了完全显示siRNA的活性，所期望的 是将siRNA从亲水性聚合物中分离出来。也就是说，在PEG和反义ODN 共价键合的情况下，引入可裂解的连接并不是绝对必需的。同时，对于 siRNA，引入可裂解的连接对引入PEG很重要。而且，因为siRNA比反 义ODN对靶基因的特异性相对更高，因此仅使用反义ODN剂量1/10的 siRNA就可使其它基因的非选择性抑制副作用显著降低，并且十分有效 地抑制特定靶基因(参见图22)。当剂量减少时，以药物组合物的形式临 床给予siRNA聚电解质复合物胶束时，身体的负担会减少，总成本也会 降低。此外，与使用单链DNA分子的ODN产生的聚电解质复合物不同， siRNA产生的聚电解质复合物使用双链RNA分子，因此其稳定性比 ODN-PEG聚电解质复合物好很多。简言之，与常规的基于DNA的ODN 聚电解质复合物相比，本发明的siRNA聚电解质复合物在选择性、剂量 和靶mRNA稳定性方面显示出突出的优势。
本发明的siRNA-亲水性聚合物结合物可在结合物末端引入细胞特 异性配体。所述细胞特异性配体可优选自细胞特异性抗体、细胞特异性 肽、细胞生长因子、叶酸、半乳糖、甘露糖、RGD或铁传递蛋白等。可 将所述配体引入结合物末端，更优选通过二硫键、酰胺键或酯键将其引 入PEG末端的OH基。
并且，本发明提供了通过亲水性聚合物与siRNA端基共价键合制备 P-X-Y形式的siRNA-亲水性聚合物结合物的方法。此处，P是亲水性聚 合物，X是共价键或有连接体作为媒介的共价键，Y是siRNA分子。
制备siRNA-亲水性聚合物结合物的方法还可包括激活siRNA或亲 水性聚合物的官能团的步骤。待激活的官能团可包括但不限于胺基、硫 醇基、磷酸基或其组合。优选地，激活siRNA官能团的材料包括1-乙基 -3,3-二乙基氨基丙基碳二亚胺、咪唑、N-羟基琥珀酰亚胺、二氯己基碳 二亚胺、N-卩-顺丁烯二酰亚胺丙酸、N,(3-顺丁烯二酰亚胺丙氧基琥珀酰 亚胺酯、N-琥珀酰亚胺基吡啶基二硫代丙酸酯等。
对亲水性聚合物和siRNA分子之间的反应条件无特别限制，但是反 应通常在室温下进行约24 48小时。尽管没有指定反应所需的反应物的混合比值，亲水性聚合物与siRNA分子的摩尔比值(％)在10:卯 90:
IO范围内，由此可以调整引入siRNA分子的亲水性聚合物的比值。
本发明的亲水性聚合物-siRNA结合物可用作聚电解质复合物胶束 的成分。聚电解质复合物胶束是由结合于非离子亲水性聚合物的siRNA 与具有相反电荷的聚合物(例如阳离子化合物)之间相互作用而自组装 的聚集分子，该胶束的尺寸约为100 200nm (参见图2)。通过siRNA 分子与阳离子化合物之间的离子相互作用产生的核存在于胶束内芯，胶 束的外表层由亲水性聚合物部分组成。
在本发明中，阳离子化合物的非限制性的例子可以是阳离子肽例如 KALA、聚赖氨酸或鱼精蛋白、阳离子聚合物例如PEI、聚胺、聚乙烯胺、 或阳离子脂质例如二油酰磷脂酰乙醇胺或胆固醇二油酰卵磷脂。
下面将解释制备该胶束的方法。首先，将siRNA-亲水性聚合物结合 物稀释于磷酸盐缓冲溶液中，将其与阳离子化合物混合以在水溶液中形 成聚电解质复合物胶束。为了稳定胶束，将混合物在室温下放置几十分 钟。根据所需，调整加入的阳离子化合物的量，以使阳离子化合物的正 电荷与siRNA负电荷的比值落在1: 1 (+/-=1/1) 24: 1 (+/-=24/1)的
范围内。
根据本发明的优选实施方式，为了形成促进体内siRNA-PEG结合物 细胞内输送的聚电解质复合物胶束，使用阳离子肽KALA。当使用动态 光散射(DLS)方法测量水溶液中siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶 束的尺寸时，发现胶束具有很窄的尺寸分布，其尺寸约为150nm (图6)。
此外，为了评价体内siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束的 siRNA的稳定性，将siRNA-PEG结合物的siRNA稳定性与裸siRNA的 稳定性进行对比。证明将PEG引入siRNA时，24小时内稳定性很好， 当形成聚电解质复合物胶束时，稳定性获得急剧改善(参见图7)。
在本发明的另一优选实施方式中，使用人前列腺癌细胞系(PC-3) 检验VEGF siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束对血管内皮生长因子 (VEGF)表达的作用。观察到当用VEGF siRNA/KALA禾卩VEGFsiRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束处理PC-3细胞系时，显著抑制 VEGF的表达(参见图8)。
此外，为了获知VEGF siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束对体 内癌细胞增殖的抑制活性的程度，将人癌细胞移植到小鼠并通过小鼠血 管将siRNA配方给予小鼠。当观察癌细胞系的增殖程度时， siRNA-PEG/KELA聚电解质复合物胶束对移植到动物模型中的癌细胞系 的生长显示出相当大的抑制作用(参见图9)。
根据本发明的另一实施方式，siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束 对核酸酶介导的siRNA降解显示出强烈的抗性(参见图10)，并有效抑 制了人前列腺癌细胞系(PC-3)的VEGF体外表达(参见图11)。当增 大N/P比值或增加siRNA剂量时，VEGF基因抑制作用甚至更加明显。 而且，不管是否存在血清，siRNA-PEG聚电解质复合物胶束对VEGF的 基因表达具有相同的抑制作用(参见图12)，由聚电解质复合物胶束诱导 的VEGF基因抑制显示出高序列特异性方式(参见图13)。
本发明的另一实施方式检验了 siRNA对动物模型中肿瘤的影响。结 果证实与对照组相比，经过VEGF siRNA处理，肿瘤生长得到不同程 度的抑制。特别是VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束比VEGF siRNA/PEI复合物对肿瘤生长的抑制作用更强(参见图14和图15)。
肿瘤内VEGF蛋白和VEGF mRNA的量证实与VEGF siRNA/PEI复 合物不同，VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束显著抑制VEGF 蛋白的表达(参见图16)，并且经过VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复 合物胶束处理，完全抑制了肿瘤内VEGF mRNA的水平。裸siRNA和 siRNA/PEI复合物略微降低了 VEGF mRNA的浓度，而错义siRNA聚电 解质复合物胶束根本没有降低VEGF mRNA的浓度(参见图17)。这些 结果证实了本发明的聚电解质复合物胶束比siRNA/PEI复合物更利于抑 制VEGF的体内表达。
在体内条件下，siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束显著的基因沉 默作用可归因于聚电解质复合物胶束的两个独特的结构特征(i)在细 胞摄入前保持聚电解质复合物胶束在组织液内的胶体稳定性而暴露在其表面的PEG链，和(ii)通过细胞内吞作用，在细胞摄入后，在细胞液
中siRNA-s-s-PEG结合物的特异性细胞内裂解。
本发明的另一个例子是通过免疫组织化学染色检验肿瘤内的微血管 分布。与对照组相比，VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束使肿 瘤单元面积内的微血管数目显著减少(参见图18)。该结果表明肿瘤内血 管的形成主要依赖于实体瘤区域中的VEGF量。因此，由VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束诱导的RNAi-介导的VEGF表达抑 制有效地减少了肿瘤内新血管的形成，因此显著延迟了肿瘤的生长。
此夕卜，根据本发明的另一个例子，当全身给予VEGF siRNA-PEG/PEI 聚电解质复合物胶束时，其比对照组的siRNA配方更有效地减慢了肿瘤 细胞的生长(参见图19)。而且，肿瘤内VEGF量的测定揭示了 VEGF 表达的降低主要发生在用VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束处 理的移植的PC-3肿瘤内(参见图20和图21)。这些结果显示VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束进入血管停留的时间得到延长，通 过EPR (强化的渗透和滞留，Enhanced Permeation and Retention)作用在 肿瘤区内有效积聚。众所周知，结合有纳米尺寸载体的药物或结合有聚 合物的药物通过疏松的维管结构更容易积聚在肿瘤区内。因此，VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束的被动肿瘤靶向很可能影响肿瘤生 长的延迟。
描述至此，混杂结合物(hybrid conjugates)是通过引入用于使阴离 子低聚物siRNA分子与亲水性聚合物之间结合的二硫键、各类可生物降 解的连接或不可裂解的连接而制备获得的。这些混杂结合物随后与其它 阳离子聚合物、脂质类和肽类等相互作用形成聚电解质复合物胶束。根 据本发明，这些聚电解质复合物胶束作为用于siRNA分子的细胞输送方 法是有用的。而且，通过将细胞特异性配体引入siRNA-PEG结合物，可 改善可替代的(alternative)基因治疗效果。特别当使用含有二硫键的 siRNA-亲水性聚合物的结合物、阳离子聚合物、脂质类和肽类形成的聚 电解质复合物胶束时，该胶束的细胞输送效率高于仅使用siRNA时的细 胞输送效率。此外，通过使用VEGF的siRNA作为治疗癌症的靶基因， 有可能抑制VEGF、抑制肿瘤的体内增殖。这些结果证实了 hVEGFsiRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束能通过抑制VEGF表达极好地抑 制癌细胞生长，并显示出急剧改善的体内稳定性。
实施例
将通过下述实施例对本发明进行更详细地描述，但这些实施例并不 意图限制本发明。
实施例1含有可生物降解的二硫键的siRNA-PEG结合物的合成
对于下文的实施例，使用hVEGF (人血管内皮生长因子)siRNA。 SEQ. ID. No. 1 (hVEGF， 189-207 bp)代表hVEGF siRNA的耙序列、SEQ. ID. No. 2代表hVEGF siRNA的正义链、SEQ. ID. No. 3代表hVEGF siRNA的反义链。此外，SEQ. ID. No. 4代表错义siRNA的正义链、SEQ. ID. No. 5代表错义siRNA的反义链。
使用在siRNA的正义链3'端引入胺基的siRNA (Qiangen Inc.)和异 双官能团的(heterobifunctional)可裂解的交联剂SPDP，合成吡啶基二硫 醇激活的siRNA中间体(将末端的胺激活为吡啶基二硫醇基)。首先， 将溶于800fil、5mM磷酸盐缓冲溶液(pI^7.5)中的300|ig siRNA(20nmol) 与溶于二甲亚砜(DMSO)的20pl、 20mM SPDP在室温下混合30分钟。 将由此得到的反应物在5mM磷酸盐缓冲溶液(pH=7.5)中用截留分子量 10,000的透析膜透析3小时以除去未反应的SPDP。然后，将溶于5mM 磷酸盐缓冲溶液(pH-7.5)的终浓度为20mM的PEG-SH(分子量3，400， Nektar，美国制造)100^1加入吡啶基二硫醇激活的siRNA中间体中，在 室温下反应18小时，由此在siRNA和PEG间引入二硫键。然后使用截 留分子量为10,000的透析膜将混合物再次透析24小时，以除去未反应 的PEG，得到所需的含有可生物降解的二硫键的siRNA-PEG结合物。使 用反相HPLC (C-4)分离所合成的siRNA-PEG结合物。使用lOOmM醋 酸铵和50%乙腈在梯度浓度下分离siRNA-PEG结合物(参见图3)。
为评价在模拟细胞内条件下，siRNA-s-s-PEG结合物中二硫键的可 裂解性，将0.5|ag siRNA-PEG结合物在总体积为25^1的10mM谷胱甘肽 培养基中培养。使裂解反应在37'C下进行2小时。加入10pl凝胶加样缓 冲液(0.25% (w/v)溴酚蓝和40% (w/v)蔗糖)终止该反应。对裂解的siRNAs通过电泳进行显示。结果是通过GSH处理，将siRNA从 siRNA-PEG结合物上裂解下来，释放出完整形式的siRNA (图4)。这表 明完整的siRNA可参与RNAi反应而无任何活性损失。
实施例2含有不可裂解的连接、引入癌细胞选择性配体的siRNA-PEG 结合物的合成
为了将具有癌细胞选择性配体的PEG通过不可裂解的连接引入 siRNA，使用正义链3'端具有胺基(-NH2)的siRNA。首先，将130mg 叶酸(0.3mmo1)溶于DMSO中，并与60mgDCC (二环己基碳二亚胺) 和34mgNHS (N-羟基琥珀酰亚胺)混合。在室温下反应30分钟，因而 激活叶酸的羧基。在混合物中加入34mg胱胺，再继续反应3小时。此 时，叶酸和胱胺之间反应的摩尔化学计量为2: 1。将得到的反应物用水 透析，除去所有未反应的副产物。然后冻千反应物。接着，将胱胺-叶酸 -胱胺(胱胺-F0L2)溶于DMSO水溶液(水DMSO = 50: 50)，生成 0.1M 2-巯基乙醇中的游离巯基(-SH)，得到叶酸-SH。将300pg siRNA 和200吗异双官能团PEG (例如，NHS-PEG-MAL (顺丁烯二酰亚胺)) 在lOmM磷酸钠缓冲溶液中反应1.5小时，制备在siRNA的正义链3'端 具有PEG的siRNA-PEG-MAL。然后，将siRNA-PEG-MAL和O.lmg叶 酸-SH混合并在室温下反应3小时。使用截留分子量为5,000的透析膜用 水对得到的反应物进行透析，并用反相HPLC (C-4)将siRNA-PEG-FOL 结合物从反应物中分离出来(图5)。
实施例3 siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束的形成及其特征(1)
为了得到能将实施例1合成和分离的siRNA-PEG结合物转移到靶细 胞的基因转移工具，使用阳离子肽例如KALA (Peptrone，韩国)或鱼精 蛋白(Sigma-Aldrich，美国)、阳离子聚合物例如PEI (Sigma-Aldrich， 美国)、或阳离子脂质例如二油酰卵磷脂(DOPC， Nutfidd，英国)等制 备聚电解质复合物胶束。本文中，将使用KALA形成聚电解质复合物胶 束作为实施例在下面进行详细描述。首先，将siRNA-PEG结合物 (50pmo1)在相同体积的2x PBS中稀释，然后将溶于PBS的KALA加 入稀释的结合物中，形成聚电解质复合物胶束，随后在室温下培养15min 以稳定形成的胶束，其中KALA肽的正电荷与寡核苷酸的负电荷比值为1: 1 (+/-=1/1)。
使用DLS方法分析所得的siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束 在水溶液中的胶束尺寸。结果是发现siRNA-PEG/KALA聚电解质复合 物胶束具有很窄的尺寸分布，其尺寸约为150nm (图6)。
实施例4在类似于体内的条件下，评价siRNA-PEG/KALA聚电解质复 合物胶束的稳定性
将三种配方(裸的、未修饰的siRNA，实施例1合成的siRNA-PEG 结合物以及实施例3制备的siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束)分 别在类似于体内条件的含有10%FBS (胎牛血清)的培养基中培养O、 1、 2、 4、 8、 16、 24和48小时，评价每种配方的稳定性，以了解原本的siRNA 分子的稳定性改善程度。所得产物使用电泳评价。
结果发现经过24小时后，siRNA-PEG结合物的稳定性好，而 siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束的稳定性急剧提高(图7)。
实施例5 hVEGF siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束对前列腺癌细 胞系中VEGF表达的作用
为了研究hVEGF siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束对前列腺 癌细胞系中hVEGF表达的影响，使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定由 人前列腺癌细胞系(PC-3)分泌到培养基中的hVEGF量。首先，将PC-3 细胞以密度为1><105细胞/孔接种于12孔板，在含有10%FBS的RPMI 1640培养基中培养24小时。除去培养基并重新换成含有10%FBS的新 RPMI 1640培养基。接着，将实施例1合成的lOpmolhVEGF siRNA-PEG 与阳离子KALA肽混合，其中负电荷与正电荷的比值为1: 1(+/-=1: 1)。 将所得的混合物在室温下培养15分钟以上，以形成聚电解质复合物胶束。 然后于37。C下，在lml RPMI 1640培养基中将PC-3细胞用最适宜浓度 的聚电解质复合物胶束UOpmol)处理4小时。随后，将培养基换为新 的含有10%FBS的RPMI 1640培养基，再将细胞培养6小时。为了对抑 制的hVEGF进行定量，加入lml含有10%FBS的RPMI 1640，用ELISA 测量在37。C下分泌18小时所得的hVEGF总量。分别用无PEG的hVEGF siRNA、仅siRNA-PEG结合物、siRNA/KALA复合物、含有错义siRNA的聚电解质复合物胶束以及绿色荧光蛋白(GEP) siRNA的聚电解质复 合物胶束处理PC-3细胞，以未经任何处理的PC-3细胞用作对照组。结果是当用siRNA/KALA和siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物 胶束处理PC-3细胞时，显著抑制VEGF的表达(图8)。实施例6 hVEGF siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束对动物模型中 癌细胞生长的抑制作用为检验hVEGF siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束对体内癌细 胞增殖的抑制活性，将实施例1和实施例3合成的siRNA配方经静脉注 射到带有人癌细胞的小鼠内，观察每只小鼠的癌细胞增殖程度。为了此 目的，通过皮下给药将5xl(^PC-3细胞移植到7 8周龄的裸鼠腰部。当 肿瘤体积达到0.1 cm3时，将hVEGF siRNA-PEG/KALA 、 hVEGF siRNA/KALA、错义siRNA/KALA和错义siRNA-PEG静脉注射给小鼠， 每种配方一次给予7.5吗。在第1天和第10天给予每种配方，并分别测 量从给药开始第l、 3、 5、 7、 10、 12、 14和18天的肿瘤尺寸。结果是当用hVEGF siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束处理 时，移植到动物体内的癌细胞的增殖得到显著抑制(图9)。实施例7siRNA-PEG/KALA聚电解质复合物胶束的形成及其特征(2)为制备siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束，将实施例1制备的 siRNA-PEG结合物与PEI (Sigma-Aldrich，美国)以所示的N/P比值混 合，并在室温下放置以形成siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束。实施例8 siRNA-PEG结合物及由其制备的胶束在血清中的稳定性通过在含有50%FBS (Gibco BRL， Grand Island, NY)的培养基中 培养每种配方(10pg siRNA)，研究裸siRNA、 siRNA-PEG结合物和 siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束在血清中的稳定性。在所示时间间 隔(0、 1、 2、 4、 8、 16、 24和48小时)从样品中移取等分部分，并使 用凝胶电泳在tris-醋酸盐缓冲溶液中(1.2%琼脂糖凝胶)中分析。使用 肝素钠盐溶液(50mg/ml)对siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束进行 预处理，除去阳离子的PEI以获得脱复合的(decomplexed) siRNA-PEG 结合物。在含有培养基的血清中经过8小时培养后，未修饰的siRNA显示其 几乎完全降解(图10 (a))。相反，在相同条件下，siRNA-PEG结合 物可持续16小时而其完整性的丧失不显著(图10 (b))。对于 siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束配方，即使经过48小时的培养后， 也不能监测到siRNA的核酸酶介导的降解(图10 (c))。此结果表明 在血清存在下，仅使用PEG结合可在某种程度上有助于保持siRNA的结 构完整性。在聚电解质复合物胶束配方中观察到的延长保护可能是因为 在外壳层存在PEG链，其可从空间上阻止核酸酶进入siRNA/PEI的内芯。实施例9细胞培养和转染将人前列腺癌细胞(PC-3)以密度为1.5><105细胞/孔接种到12孔板， 使其附着24小时。在进行转染实验前，用预温的无血清培养基替代生长 培养基。通过在细胞中加入所需siRNA配方进行转染。4小时后，用新 的补加血清的培养基替代转染培养基并培养6小时。然后用新的含有 10%FBS和肝素(20ng/ml)的RMPI 1640培养基替代上述培养基。16 小时后，收集含有hVEGF的培养基并离心除去细胞碎片。根据厂商说明 书，使用Quantikine hVEGF免疫测定试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, MN)测定细胞分泌的HVEGF量。结果是siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束有效地降低了 PC-3 细胞内的hVEGF表达。与siRNA/PEI复合物相比，siRNA-PEG/PEI聚电 解质复合物胶束对hVEGF表达的抑制显示出更高的水平，尤其在较低 N/P比值(N/P比值为2和4，图11 (A))时更是如此。当N/P比值为 16时，显示含有50pmol siRNA的两个配方几乎完全抑制PC-3细胞分泌 hVEGF。并且以剂量依赖方式抑制hVEGF的表达(图11 (B))。尽管不存在血清时，siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束和 siRNA/PEI复合物对hVEGF表达的抑制无显著差别，但是在10%FBS存 在时，它们的VEGF基因沉默作用差别很大(图12)。在添加10%FBS 时，siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束显示VEGF分泌的沉默程度稍 微降低(从14.6到25.9pg/ml)，然而，在相同的血清条件下，siRNA/PEI 复合物显示出小得多的基因沉默作用(从21.2到91.3pg/ml)。实施例10半定量RT-PCR为了研究细胞内hVEGF mRNA的减少是否导致hVEGF表达的 抑制，使用RT-PCR分析法估计细胞内hVEGFmRNA的水平。用所需配 方转染PC-3细胞，所述配方包括VEGF siRNA/PEI复合物、VEGF siRNA-PEG/PEI聚审解质复合物胶束(N/P=16) 、 GFP siRNA/PEI复合 物、错义siRNA/PEI复合物和错义siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束， 经转染的PC-3细胞使用胰蛋白酶消化，培养16小时后收集。SEQ.ID.No. 6代表GFP siRNA的正义链，SEQ. ID. No. 7代表GFP siRNA的反义链。 根据厂商说明书，使用RNeasy Mini Kit (Qiagen， Valencia, CA)分离总 RNA。使用Superscript III One-Step RT-PCR系统和Platinum Taq DNA 聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)，用提取的总RNA (l吗)进行半定量 RT-PCR。 RT-PCR热循环条件如下cDNA合成，55°C 25min， 1个循环； 变性，94°C 2min， 1个循环；PCR扩增，94°C 20s、 60°C 30s、 72°C 30s， 26个循环；最后延伸，70°C 5min， 1个循环。检测hVEGF和人卩-肌动 蛋白的PCR引物由Bioneer Co. (Daejeon，南韩)得到。SEQ. ID. No. 8 和SEQ. ID. No. 9代表用于检测hVEGF的引物、SEQ. ID. No. 10和SEQ. ID. No. 11代表用于检测人(3-肌动蛋白的引物。hVEGF和P-肌动蛋白的 PCR产物的长度分别为522bp和1126bp。用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析 PCR产物并用溴化乙锭染色显示。如图13所示，VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束(泳道3) 显示出非常微弱的VEGF mRNA泳带，但是含有与VEGF mRNA错配的 siRNA或无关序列的siRNA (错义siRNA和GFP siRNA)的样品显示了 与未转染细胞(泳道l)相当的完整mRNA的泳带亮度。此结果表明VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束可以高序列特异性的方式在转录后 水平上沉默VEGF的表达。实施例11小鼠模型中siRNA功效的验证由Charles River (Wilmington, MA)得到雌性裸鼠(ww/"")，并在 7周龄时使用。将人前列腺癌细胞(PC-3， 1.5乂106细胞)皮下注射到小 鼠的胁区，产生动物肿瘤模型。当PC-3肿瘤异种移植的体积达到50mm3 时，将含有500pmol siRNA的所表明的siRNA配方(即hVEGFsiRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束(N/P比值=16) 、 hVEGF siRNA/PEI、裸hVEGF siRNA和错义RNA-PEG/PEI)瘤内给药(第1 天)。对Mock-处理的对照组注射PBS。在第IO天进行另一次注射。通 过测径器测量正交直径(perpendicular diameter)对肿瘤大小进行监测。 基于以前发表的文献所描述的下式来确定肿瘤体积(McPhillips等，5r.J Ca聰r， 85， 1753-1758， 2001):月中瘤体积- (长轴)x (短轴)2x (兀/6)。 使用学生"检验(Student's Mest)进行统计分析以评价肿瘤体积的差别。 统计的显著性限定为尸<0.05。
结果是与对照组、错义RNA-PEG/PEI和PBS溶液相比，所有的 三种hVEGF siRNAs处理均显示了不同程度的肿瘤生长延迟(图14和 图15)。在这三种siRNA配方中，hVEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复 合物胶束比hVEGF siRNA/PEI复合物在更大程度上显著延迟了肿瘤生 长。由于其在局部注射点的自身序列特异性基因沉默活性，裸siRNA在 瘤内条件下也显示某种程度的RNAi-介导的基因沉默作用。在注射后的 第38天，与注射PBS溶液(100%)的对照相比，siRNA-PEG/PEI聚电 解质复合物胶束、siRNA/PEI复合物、裸siRNA的相对肿瘤体积分别减 至13.3%、 32.8%和55.4%。
实施例12瘤内hVEGF蛋白和mRNA量的定量
为测定实体瘤区域的hVEGF量，使用siRNA配方在第10天进行处 理，3天后从具有肿瘤的小鼠收集实体瘤。将肿瘤称重，用电组织匀浆机
(Kinematica AG，瑞士)在PBS中对肿瘤进行匀桨。将组织匀浆液在 3,000rpm (4°C)下离心5min,储存上清液作进一步分析。使用ELISA
(Quantikine⑧人VEGF免疫测定试剂盒，R&D Systems, Minneapolis, MN) 测定HVEGF的量。
结果是所述siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束(N/P比值=16) 比VEGF siRNA/PEI复合物更显著抑制VEGF的表达(图16)。与PBS 对照(100%)相比，聚电解质复合物胶束、siRNA/PEI复合物和裸siRNA 显示分别使VEGF的量减少74.8%、 36.3%和20.0%。相反，没有检测到 错义RNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束对VEGF表达的显著抑制。为测定瘤内VEGFmRNA的水平，根据厂商的建议，使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)从肿瘤组织分离总RNA 。使用 Superscript III One-step RT-PCR试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)进 行半定量RT-PCR。以如下热循环条件下进行RT-PCR: cDNA合成，55°C 25min， 1个循环；变性，94°C 2min， 1个循环；PCR扩增，94°C 20s、 60°C 30s、 72。C30s， 26个循环；最后延伸，70°C 5min， 1个循环。检测 hVEGF和人P-肌动蛋白的PCR引物购自BioneerCo. (Daejeon，南韩)。 用0.8%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物并用溴化乙锭染色显示。
结果是使用hVEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束可完全下 调瘤内hVEGF mRNA的水平。裸siRNA和siRNA/PEI复合物略微降低 VEGF mRNA的水平，而序列错配的siRNA聚电解质复合物胶束则没有 降低其水平。这些结果清楚地显示相对于siRNA/PEI复合物，聚电解质 复合物胶束用于体内hVEGF表达的基因沉默具有的优势。
实施例13实体瘤区域中微血管的免疫组织化学染色和分析
在第28天，将带有肿瘤的小鼠处死以用于免疫组织化学染色。收集 实体瘤区域，固定于10%磷酸盐缓冲的甲醛溶液中，用石蜡包埋。将石 蜡包埋的肿瘤组织切割成3微米的切片，并使用VonWillebrandFactor(因 子VIII)的抗体染色。该切片在二甲苯中脱石蜡，在梯度浓度的乙醇
(100%、 95%、 70%和50%)中再水化，最后浸于PBS中。在自动免疫 染色机(Ventana ES， Ventana Medical Systems, Tucson， AZ)上进行抗 原修复预处理和免疫染色。预处理和染色条件如下。通过用蛋白酶2
(20)ig/ml)处理水化的切片4min，进行酶诱导的抗原修复。将切片与识 别小鼠因子VIII (兔单克隆IgG， Dako Cytomation, Carpinteria， CA)的 一抗在l: 100稀释的条件下于室温培养30min，然后与生物素标记的抗 兔IgG(l: 300的稀释液，Sigma, St. Louis， MO)在室温下培养30min。 根据厂商建议，使用IView DAB检测试剂盒(Ventana Medical Systems) 进行微血管的比色检测。用苏木精(Ventana Medical Systems)对组织切 片进行复染，用梯度浓度的乙醇(50%、 70%、 95%和100%)脱水。
为测定瘤内微血管密度，在染色部分随机选择五个独立区域(显微 镜视野2.3mmX3mm， 6.9mm2)，在配备CCD照相机的相差显微镜的100倍放大倍数下得到区域图像。在所选区域对因子VIII-阳性微血管进 行计数，并通过下式计算平均瘤内微血管密度..微血管密度(因子VIII-
阳性血管数/mm2)=因子VIII-阳性血管数X6.9。在通过使用Von Willebrand Factor (因子VIII)的抗体染色显示PC-3肿瘤异种移植区域 微血管的形成。
与对照组相比，用VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束 (N/P比值H6)处理的肿瘤组显示出每单位区域的瘤内微血管数量显著 减少(图18)。此结果显示瘤内血管生成的活性主要取决于实体瘤区域内 的VEGF量。总之，VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束对RNAi-介导的VEGF表达抑制有效地减少了瘤内新血管形成的程度，导致肿瘤 生长的显著延迟。
实施例14 hVEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶束通过全身给药对 动物模型中癌细胞生长的抑制作用
为进一步验证siRNA-PEG/聚电解质复合物胶束全身给药的抗癌作 用，将其通过PC-3肿瘤异种移植裸鼠尾静脉注射五次(第1、 4、 10、 18和28天)。每次单剂量静脉注射siRNA的剂量为20|Lig。
与对照siRNA配方相比，VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质复合物胶 束的全身注射有效减慢肿瘤的生长(图19)。瘤内VEGF的量还显示VEGF 表达的减少主要发生在聚电解质复合物胶束配方处理的PC-3肿瘤异种 移植中(图20和图21)。此结果揭示了 VEGF siRNA-PEG/PEI聚电解质 复合物胶束可以更为延长的方式在血流中循环，并且通过强化的渗透和 滞留(EPR)作用有效地积聚在肿瘤位点内。
工业实用性
总之，本发明的siRNA-亲水性聚合物结合物和聚电解质复合物胶束 可有利地用于改善siRNA分子在体内的稳定性。因此，现在有可能将用 于治疗用途的siRNA分子更容易地输送到细胞内，即使使用小剂量的 siRNA， siRNA分子仍有活性。因此，作为新的siRNA输送工具'siRNA-亲水性聚合物结合物及其产生的聚电解质复合物胶束不仅可用于治疗癌 症和其它传染病，还可用于生物工程和医药工业的基础研究。尽管对本发明的优选实施方式已经进行描述，但是本领域技术人员 可以理解的是本发明不应该仅限于所述优选实施方式，在所附权利要求 书所限定的本发明精神和范围内，可作各种改变和修改。
权利要求
1.一种相互共价连接的siRNA-亲水性聚合物结合物，其表示为下式P-X-Y其中P是亲水性聚合物，X是无连接体作为媒介的共价键或有连接体作为媒介的共价键，Y是siRNA分子。
全文摘要
本发明公开了siRNA(小分子干扰RNA)分子与亲水性聚合物共价键合而形成的混杂结合物，其用于改善对基因治疗有效的siRNA分子在体内的稳定性，还公开了通过所述结合物与多官能阳离子化合物之间的离子相互作用而形成的聚电解质复合物胶束。所述siRNA-亲水性聚合物结合物及其产生的聚电解质复合物胶束可有利地用于改善siRNA分子在体内的稳定性。因此，可促进用于治疗应用的siRNA分子向细胞内的输送，并且即使使用小剂量的所述siRNA，其仍有活性。
文档编号C12N15/113GK101287835SQ200680035462
公开日2008年10月15日 申请日期2006年8月17日 优先权日2005年8月17日
发明者朴泰宽, 郑智勋, 金善花 申请人:株式会社百奥尼;株式会社三养社;韩国科学技术院