生产丝状真菌培养产物的方法

专利名称：：生产丝状真菌培养产物的方法
技术领域：
：本发明涉及使用液体培养基生产丝状真菌培养产物的方法，具体而言，涉及生产丝状真菌培养产物的方法，其中在培养丝状真菌的同时，控制营养物从培养原材料中向培养系统释放率从而调节丝状真菌培养产物中的酶生产力。10
背景技术：
为了生产发酵食品和饮料如烧酒(shodm)，使用一种丝状真菌，曲霉。通过固体培养方法培养曲霉，其中使曲霉生长在谷物的表面上，即被称为固体曲方法。使用固体曲的方法是一种传统生产方法。然而，所述方法是15—种特定的培养方法，即固体培养，因此不适合于大规模的生产。另一个方面，作为通过液体培养曲霉获得的曲霉的培养产物的液体曲可以容易地控制培养物，并且是一种进行有效生产的适合的培养方法。然而，已经公知的是，液体曲不能提供生产发酵食品和饮料如烧酒酿造所需的足够的酶活性(见，非专利文献l-4)。因此，很少有将液体曲用于实际生20产的实例。在通过液体培养丝状真菌包括曲霉来生产酶中，已经了解的是，通过控制降低营养物如葡萄糖在培养系统中的浓度来提高酶的生产力。一般地，营养物如糖的浓度被流加培养方法所抑制，其中营养物如糖从培养系统外渐渐加入。然而，预期开发更简单的方法(见，非专利文献5-6)。25我们己经开发了生产包含足量的酶如葡糖淀粉酶和酸稳定性a-淀粉酶的曲霉培养产物的方法，其通过使用液体培养基培养曲霉进行，其中所述原材料被皮或壳所覆盖，并已经提交了专利申请(见，日本专利申请号2004-350661,2004-352320,2004-352324,2004-378453,2005-290651，和2005-290648的说明书)。然而，尚不了解怎样在生产方法中生产高产量的酶的机制，怎样基于该机制调节曲霉培养产物中的酶生产力的方法，和怎样调节除了曲霉之外的丝状真菌的酶生产力的方法。在另一方面，己经提出了一种通过使用在液体培养基中培养获得的酶液体，来液化未煮和未蒸过的淀粉的方法，所述液体培养基包含未煮和未5蒸过的原材料，矿物质等，具有极高的糖化未煮和未蒸过的淀粉能力的伏革菌属(CoW^m)的新菌株(见，专利文献l)。还提出了生产日本米酒的方法，其中上述酶液体与未煮和未蒸过的原材料反应(见，专利文献2)。然而，伏革菌属是一种bacidiomycetes,因此，其显著不同于广泛用于生产发酵食品和饮料的曲霉。此外，专利文献l和专利文献2描述黑曲霉(泡盛10曲霉0^;^^7/wm^mon'))和根霉属(i/zfeo;M力在糖化作用能力上不足。在酶液体是否具有足够的酸稳定性a-淀粉酶活性上尚不清楚。非专利文献l:HataY.等J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工程杂志)，84，532-537(1997)非专利文献2:HataY.等Gene.(基因)，207,127-134(1998)15非专利文献3:IshidaH.等J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工程杂志)，86，301-307(1998)非专利文献4:IshidaH.等Cmr.Genet.(当代基因)，37,373-379(2000)非专利文献5:BhargavaS.等BiotechnolBioeng.(生物技术生物工程)，82(1),111-7(2003)20非专利文献6:PedersenH.等ApplMicrobiolBiotechnol.(应用微生物生物技术)，53(3):272-7(2000)专利文献1:JPH05掘237B专利文献2:JPH06-053059B25
发明内容本发明待解决的问题本发明的一个目的是提供通过使用包含选自由谷物，豆类，块茎，苋属(amaranthus)和藜属(quinoa)植物组成的组的至少一种作为培养原材料的液体培养基调节在丝状真菌培养产物中的酶的生产力的方法，所述酶具体30而言指淀粉分解酶，植物纤维降解酶和蛋白水解酶，其中在丝状真菌培养的同时，控制营养物从作为培养原材料的谷物向培养系统中的释放率。解决问题的方法本发明的发明人已经进行广泛研究以解决上述问题，结果发现当将覆5盖有皮的原材料用作液体培养基的原材料时，可能通过调节原材料的脱壳比率来控制作为营养物之一的葡萄糖向液体培养基中的释放率。通过使用具有不同脱壳比率的原材料培养丝状真菌，结果发现丝状真菌培养产物中的酶生产力是可以由脱壳比率所控制的。本发明的发明人还发现将曲霉培养在液体培养基中以产生包含大量10生产发酵食品和饮料所需的葡糖淀粉酶和酸稳定性a-淀粉酶的液体曲，所述液体培养基包含去除了外壳或壳(husksorhulls)的含有淀粉的原材料，并且所述原材料没有被胶凝化。这可能是因为没有被胶凝化的原材料，即使没有被外壳或壳所覆盖也很难被分解，其中糖，氨基酸等向培养系统中的释放被抑制，并且作为结果，获得了需要的酶活性。15本发明的发明人因此基于这些发现完成了本发明。艮P,根据本发明的第一方面，提供通过使用液体培养基生产丝状真菌培养产物的方法，所述液体培养基包含选自由谷物，豆类，块茎，苋属和藜属植物组成的组的至少一种作为培养原材料，所述方法包括培养丝状真菌，同时控制营养物从培养原材料向培养系统中的释放率从而调节丝状真20菌培养产物中的酶的生产力。根据本发明的第二方面，提供生产根据本发明的第一方面的丝状真菌培养产物的方法，其中所述培养原材料是其表面完全或部分用至少外壳覆盖的谷物，且营养物从谷物向培养系统的释放率通过调节谷物的脱壳比率而被控25制。根据本发明的第三方面，提供生产根据本发明的第一方面的丝状真菌培养产物的方法，其中营养物从培养原材料向培养系统中的释放率通过使用其外壳或壳被去除并且没有被胶凝化的培养原材料而受到控制。根据本发明的第四方面，提供生产根据本发明的第一方面的丝状真菌30培养产物的方法，其中将所述液体培养基进行热处理，并且通过在热处理时调节液体培养基中的无机盐浓度而控制营养物从培养原材料向培养系统中的释放率。根据本发明的第五方面，提供生产根据本发明的第一方面的丝状真菌5培养产物的方法，其中所述营养物包含来自培养原材料中淀粉的糖和/或来自培养原材料中蛋白质的氨基酸。根据本发明的第六方面，提供生产根据本发明的第一方面的丝状真菌培养产物的方法，其中所述酶包含选自由淀粉分解酶，植物纤维降解酶和蛋白水解酶组成的组的至少一种。10根据本发明的第七方面，提供生产根据本发明的第一方面的丝状真菌培养产物的方法，其中丝状真菌包括选自由曲霉，木霉属(Trichoderma)和白腐真菌组成的组的至少一种。根据本发明的第八方面，提供了丝状真菌培养产物，其通过根据本发明的第一到第七方面任何一项的方法获得。15根据本发明的第九方面，提供生产酶制剂的方法，所述方法包括使用根据本发明第八方面的丝状真菌培养产物。根据本发明的第十方面，提供一种酶制剂，其通过根据本发明的第九方面的方法获得。根据本发明的第十一方面，提供通过使用包含选自由谷物，豆类，块20茎，苋属和藜属植物组成的组至少一种作为培养原材料的液体培养基生产酶的方法，所述方法包括培养丝状真菌，同时控制营养物从培养原材料向培养系统的释放率从而调节丝状真菌培养产物中的酶的生产力。根据本发明的第十二方面，提供酶，其通过根据本发明的第十一方面的方法获得。根据本发明的第十三方面，提供生产发酵食品和饮料的方法，所述方法包括使用根据本发明第八方面的丝状真菌培养产物。根据本发明的第十四方面，提供生产发酵食品和饮料的方法，所述方法包括使用根据本发明的第十方面的酶制剂。根据本发明的第十五方面，提供生产发酵食品和饮料的方法，所述方法包括使用根据本发明第十二方面的酶。根据本发明的第十六方面，提供发酵食品和饮料，其通过根据本发明的第十三方面到第十五方面的任一个的方法获得。5发明效果根据本发明，控制营养物从培养原材料向培养系统中的释放率，其中将培养系统中营养物如糖和氨基酸的浓度维持在低水平，并调节丝状真菌培养产物中的酶生产力。根据本发明的第二方面，通过调节脱壳比率控制葡萄糖向培养系统的10培养基中的释放率。通过使用具有不同脱壳比率的原材料生产曲霉液体培养产物，结果发现通过脱壳比率控制了淀粉分解酶和植物纤维降解酶的酶生产力。还已经发现通过相同的方法控制了由除了曲霉之外的丝状真菌生产的酶的生产力。根据本发明的第三方面，通过使用其上没有附着外壳或壳的原材料生]5产丝状真菌培养产物，其以平衡方式包含生产发酵食品和饮料如烧酒所需的葡糖淀粉酶和酸稳定性(x-淀粉酶。因此，例如，在生产大麦烧酒等中，使在生产液体曲的步骤和发酵步骤中使用相同的原材料成为可能，由此减少了生产成本。大麦的外壳或糠可能会不利地影响酒精饮料的质量。此外，原材料不经加热使用而节省了20能量。当通过组合通过使用不同原材料获得的丝状真菌培养产物和丝状菌株生产丝状真菌培养产物并使用其时，可以容易地生产各种发酵食品和饮料。预期本发明的方法类似地控制了谷物中存在的除葡萄糖之外的许多25营养物的释放率，如各种糖和氨基酸。因此，被培养系统中的糖浓度或氨基酸浓度导致的代谢物抑制所影响的酶生产力得到了广泛的调节。本发明的方法很可能应用于生产异蛋白，其应用淀粉分解酶基因的启动子区等。根据本发明，通过调节营养物从预先加入培养系统的原材料释放的速30率，将培养基中营养物如糖的浓度抑制到低水平，甚至通过比流加培养更简单的分批培养，也获得了与流加培养相同的培养效果。本发明的培养方法是一种以前没有报道过的新的培养方式。此外，与固体培养相比，液体培养受到了严格的控制。因此，根据本发明，其以低廉的成本生产了具有稳定质量的丝状真菌培养产物。附图简述图1显示了通过使包含具有不同脱壳比率的大麦的大麦底物溶液分别与曲霉培养上清液反应而获得的反应液体中的葡萄糖浓度的暂时变化。图2显示反应的第一个1小时的葡萄糖释放率，其中，使包含具有不io同脱壳比率的大麦底物溶液分别与曲霉培养上清液反应。图3分别显示通过使用具有不同脱壳比率的大麦作为培养原材料获得的白色曲霉培养产物中的酶活性。图3(A)显示葡糖淀粉酶(用白条显示)和oi-淀粉酶(用黑条显示)的酶活性，图3(B)显示酸稳定性oi-淀粉酶的酶活性。15图4分别显示通过使用具有不同脱壳比率的大麦作为培养原材料获得的白色曲霉培养产物中的酶活性。图4(A)显示纤维素酶活性，图4(B)显示卩-葡糖苷酶的酶活性。图5显示在使用具有不同脱壳比率的大麦作为培养原材料的黑色曲霉培养产物中的葡糖淀粉酶(GA)活性。20图6显示在使用具有不同脱壳比率的大麦作为培养原材料的黑色曲霉培养产物中的a-淀粉酶(AA)活性。图7显示在使用具有不同脱壳比率的大麦作为培养原材料的黑色曲霉培养产物中的酸稳定性oc-淀粉酶(ASAA)活性。图8显示在使用具有不同脱壳比率的大麦作为培养原材料的黄色曲25霉培养产物中的葡糖淀粉酶(GA)活性。图9显示在使用具有不同脱壳比率的大麦作为培养原材料的黄色曲霉培养产物中的a-淀粉酶(AA)活性。图10显示在使用具有不同脱壳比率的大麦作为培养原材料的绿色木霉(7Hc/K^wmaWn'&)培养产物中的纤维素酶(CEL)活性。30图11显示在使用具有不同脱壳比率的大麦作为培养原材料的Trichodermareesei培养产物中的纤维素酶(CEL)活性。图12显示在使用具有不同脱壳比率的大麦作为培养原材料的Trichodermareesei培养产物中的木聚糖酶(XYL)活性。图13显示在使用具有不同脱壳比率的大麦作为培养原材料的5Trichodermareesei培养产物中的(3-葡糖苷酶(BGL)活性。图14显示在使用具有不同脱壳比率的大麦作为培养原材料的棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)培养产物中的纤维素酶(CEL)活性。图15显示在使用具有不同脱壳比率的大麦作为培养原材料的棘孢曲霉培养产物中的P-葡糖苷酶(BGL)活性。io图16显示在使用具有不同脱壳比率的大麦作为培养原材料的白腐真菌培养产物中的纤维素酶(CEL)活性。图17显示在使用具有不同脱壳比率的大麦作为培养原材料的白腐真菌培养产物中的木聚糖酶(XYL)活性。图18显示在反应液体中的葡萄糖浓度，所述反应液体通过使灭菌时具15有不同盐浓度的大麦底物溶液分别与曲霉培养物上清液反应获得。图19显示在白色曲霉培养产物中的葡糖淀粉酶(GA)活性，其中使用灭菌时具有不同盐浓度的液体培养基。图20显示在白色曲霉培养产物中的酸稳定性a-淀粉酶(ASAA)活性，其中使用灭菌时具有不同盐浓度的液体培养基。20实施本发明的最佳实施方案其后，将详细描述本发明。本发明的第一方面涉及生产丝状真菌培养产物的方法，其特征在于包含选自由谷物，豆类，块茎，苋属和藜属植物组成的组的至少一种作为培25养原材料的液体培养基，和培养丝状真菌的同时，控制营养物从培养原材料向培养系统的释放率以调节丝状真菌培养产物中的酶的生产力。在本发明中，控制在培养原材料中存在的营养物向培养系统的释放率，由此将包含在培养系统中的营养物如糖或氨基酸的浓度维持在较低水平，并且增加丝状真菌培养产物中的酶活性。30控制培养原材料中的营养物向培养系统中的释放率的方式的实例包括通过调节谷物的脱壳比率的方法，通过使用外壳附于其上的豆类，块茎，苋属或藜属植物作为培养原材料的方法，通过使用其外壳或壳被去除，但未被胶凝化的培养原材料的方法，在热处理液体培养基时调节无机盐浓度的方法，和通过在谷物表面上人工形成可食用的薄膜等以保护谷物中的淀5粉成分和蛋白质成分的方法。然而，方法并不限于此。通过抑制培养液体中培养原材料的物理分解来控制营养物的释放率。例如，可以通过使用具有弱搅拌和剪切力的培养装置抑制营养物的释放率。由丝状真菌生产的酶的实例包括一组酶，其生产力受到培养系统中关于糖如葡萄糖和分解的蛋白质如氨基酸的浓度的代谢物抑制的影响。其具10体的实例包括，但不必限于淀粉分解酶如葡糖淀粉酶，酸稳定性oc-淀粉酶和ot-淀粉酶，植物纤维降解酶如纤维素酶，木聚糖酶和P-葡糖苷酶,和蛋白水解酶如蛋白酶，肽酶和谷氨酰胺酶。在本发明中所用的培养原材料的实例包括谷物如大麦，水稻，小麦，荞麦，稗子(barnyardmillet)，粟(foxtailmillet),小米，高粱和玉米，豆15类如大豆和红豆，块茎如甜马铃薯，和混杂的谷物如苋属和藜属植物。苋属是属于苋科家族苋属的植物的通用术语。在谷物中，苋属植物具有高的蛋白质含量和作为氨基酸之一的赖氨酸含量，与大豆中的含量相同。除此之外，与脱壳的水稻相比，苋属植物是包含大量钙、铁和纤维的高营养谷物。出产地区是南冲美州国家，印度，喜马拉雅山脉和尼泊尔的20具体区i或。另一方面，藜属植物是Agatha家族的一年生草本，其主要生长在高原如位于秘鲁南部和玻利维亚西部的安迪斯山脉。藜属植物富含矿物质，维生素，蛋白质和膳食纤维。所述培养原材料可以单独使用，或其两种或多种可以组合使用。对原25材料的形状没有特别限制。将培养原材料的任一种与水混合以制备液体培养基。分别调节培养原材料的混合比率到倾向于聚集的酶被选择性地产生并且在丝状真菌培养产物中积累的程度。例如，为了以平衡方式生产高产量的葡糖淀粉酶和酸稳定性ot-淀粉30酶，当将大麦用作原材料时，通过将1-20%(重量/体积)的粗大麦加入水中制备液体培养基。当将未脱壳的大麦用作粗大麦时，更优选地加入8-10%(重量/体积)制备液体培养基。当将作为粗大麦的95%-脱壳的大麦用作原材料时，通过加入更优选地1-4%(重量/体积)制备液体培养基。当所用的粗大麦的量超过20%(重量/体积)时，培养液体的粘度增加并5且需氧培养丝状真菌所需的氧或空气的供应不足。这减少了培养产物中的氧含量，限制了培养进程，因此不是优选的。接下来，当将水稻用作培养原材料时，通过加入1-20%(重量/体积)，优选地5-13%(重量/体积)，或更优选地8-10%(重量/体积)的水稻到水中来制备液体培养基。o当将豆用作培养原材料时，通过加入1-10%(重量/体积)的豆到水中，或优选地，通过加入8-10%(重量/体积)的大豆或1-2%(重量/体积)的红豆到水中制备液体培养基。当将块茎用作培养原材料时，通过加入1-10%(重量/体积)的块茎到水中制备液体培养基。当将苋属植物用作培养原材料时，例如通过加入1.5-15%(重量/体积)，is优选地2-10%(重量/体积)，或更优选地2-8%(重量/体积)的苋属植物到水中制备液体培养基。当将藜属植物用作培养原材料时，通过加入1.5-7%(重量/体积),优选地2-6%(重量/体积)，或更优选地2-4%(重量/体积)的藜属植物到水中制备液体培养基。可以对待混合的培养原材料的量进行适当地选择，因为最适合于混合20的量根据所意欲使用的酶，所用的原材料的脱壳程度，所用的丝状真菌菌株，原材料的种类等变化。除了上述原材料的任一种，优选将有机物质，无机物质等加入液体培养基作为营养源。例如，当将白曲霉如Aspergilluskawachii和黑曲霉如泡盛曲霉或黑曲25霉(Aspergillusniger)用作丝状真菌时，优选地组合使用硝酸盐和磷酸盐，或更优选地，除它们之外联合使用硫酸盐。硝酸盐的实例包括硝酸钠和硝酸钾，并且硝酸钾是特别优选的。磷酸盐的实例包括磷酸二氢钾和磷酸铵，并且特别优选磷酸二氢钾。硫酸盐的实例包括七水合硫酸镁，七水合硫酸铁和硫酸铵，并且特别优选七水合硫酸镁和七水合硫酸铁。可以组合使用30那些无机盐的两种或更多。当使用白曲和黑曲时，液体培养基中的无机盐的浓度分别被调节到葡糖淀粉酶和oi-淀粉酶被选择性地产生并且积累在曲霉培养产物中的程度。具体而言，硝酸盐的浓度是0.1-2.0%,或优选地0.2-1.5%，磷酸盐的浓度是0.05-1,0%,或优选地0.1-0.5%,硫酸盐的浓度是0.01-0.5%，或5优选地0.02-0.1%，条件是每个值以重量/体积表示。当将黄曲霉如米曲霉(Aspergillusoryzae)或酱油曲霉(Aspergillussojae)用作丝状真菌时，液体培养基优选地组合包含硝酸盐，磷酸盐和硫酸盐。硝酸盐的实例包括硝酸钠和硝酸钾，并且特别优选硝酸钠。磷酸盐的实例包括磷酸二氢钾和磷酸铵，并且磷酸二氢钾是特别优选的。硫酸盐io的实例包括七水合硫酸镁，七水合硫酸铁和硫酸铵，并且特别优选七水合硫酸镁和七水合硫酸铁。可以组合使用那些无机盐的两种或更多。当使用黄曲霉时，液体培养基中的无机盐的浓度分别被调节到葡糖淀粉酶和oi-淀粉酶被选择性地产生并且积累在曲霉培养产物中的程度。具体而言，硝酸盐的浓度是O.l-2.0%，或优选地0.2-1.5%,磷酸盐的浓度是150.05-1.0%,或优选地0.1-0.5%,硫酸盐的浓度是0.01-0.5%，或优选地0.02-0.1%，条件是每个值以重量/体积表示。可以任选地将除上述无机盐之外的有机物质和无机盐加入本发明的液体培养基中作为营养源。没有对那些添加剂进行特别的限制，只要它们是通常用于培养丝状真菌的。有机物质的实例包括米糠，麦麸，玉米浆，20豆饼和脱脂大豆。其它的无机盐的实例包括水溶性化合物如铵盐，钾盐，钙盐和镁盐。可以同时使用有机物质和/或无机盐的两种或多种。没有对其添加量进行特别限制，只要其促进了丝状真菌的生长。有机物质的添加量优选地是约0.1-5%(重量/体积)，无机盐的添加量优选地是约0.1-1%(重量/体积)。25不优选那些营养源的添加量超过上限，因为会抑制丝状真菌的生长。也不优选添加量少于下限，因为酶不能足量产生。除了那些营养源之外，可以任选地将添加剂如抗生素或杀菌剂加入液体培养基中。如本发明的第四方面所述，当将热处理的液体培养基用于本发明时，30还通过在热处理时适当调节液体培养基中的无机盐浓度来控制营养物从培养原材料向培养系统中的释放率。艮l]，在热处理时，通过增加液体培养基中的无机盐浓度来抑制营养物从培养原材料向培养系统中的释放。这可能是因为在无机盐的存在下，通过加热培养原材料抑制了培养原材料的物理分解。5没有对无机盐的实例进行特别限制，如上所述可以使用通常用于丝状真菌的液体培养基的任何无机盐。然而，更优选硝酸盐，磷酸盐和硫酸盐。可以将加热处理的液体培养基中的无机盐浓度设定为如上所述的液体培养基中优选无机盐浓度的1-10倍。当在加热处理的液体培养基中的无机盐浓度超过培养丝状真菌优选10的浓度范围，可以在加热处理后稀释液体培养基以适当地调节其无机盐浓度，并接着用于培养。可以在80到130°C或优选地100到121°C的温度条件下进行上述的热处理，进行5-120分钟，或优选地10-30分钟。具体而言，优选用高压灭菌器等进行的热灭菌处理液体培养基的一般条件，即，110-121。C的温15度，处理5-20分钟，因为同时进行了培养基的灭菌处理。接下来，将丝状真菌接种到液体培养基中。对于用于本发明的丝状真菌，可以广泛使用这样的丝状真菌，其在培养系统中生产酶受到关于营养物如糖或氨基酸的浓度的代谢物抑制。其实例包括曲霉属(Aspergillus),木霉属(Trichoderma)和白腐真菌的一种，艮卩，乳白耙菌(Irpexlacteus)。20曲霉属的具体实例包括白曲霉，典型的是Aspergilluskawachii等，黄曲霉，典型地是米曲霉，酱油曲霉等，黑曲霉典型地是泡盛曲霉，黑曲霉等，和棘孢曲霉。木霉属的具体实例包括绿色木霉和Trichodermareesei，其是产纤维素酶的真菌。那些丝状真菌可以用于单一菌株培养或用于与两种或更多同源或异25源菌株的混合培养。容许使用在预培养中获得的孢子或菌丝体形式。然而，优选地使用菌丝体，因为其对于对数生长阶段需要的时间更少。接种到液体培养基中的丝状真菌量没有被特别限制，但是孢子的量可以在约lxl04-lxl06/ml液体培养基的范围内。就菌丝体而言，优选接种约0.1-10%的预培养液体。30丝状真菌的培养温度优选地是25-45。C,或更优选地30-40。C，但是没有被特别限制，只要生长没有被不利影响。如果培养温度低，可能被感染性微生物污染，因为丝状真菌的生长会变慢。培养时间优选地在24-120小时范围内。培养装置可以是那些能够进行液体培养的任一种。丝状真菌必须需氧培养。因此，培养应该在需氧条件下进行，其中将氧或空气供应5到培养基中。此外，优选搅拌培养基从而使原材料，氧和丝状真菌在培养过程中均匀地分布在装置中。搅拌条件和通风量可以是任意的，只要维持需氧培养环境，并且因此可以根据培养装置，培养基的粘度等适当地进行选择。本发明的第二方面，在上述生产丝状真菌培养产物的方法中，使用其10表面完全或部分用至少外壳覆盖的谷物作为培养原材料，并调节谷物的脱壳比率以控制营养物从谷物向培养系统的释放率。在本发明中，谷物的表面需要完全或部分用至少外壳(husks)覆盖。可以使用未脱壳的原料或其具有相同或更多的脱壳比率(polishingratio)的原料，其中其以这样的脱壳比率脱壳，从而使得外壳至少被保留在谷粒15的表面上。还可以使用粗水稻，粗大麦等。例如，当谷物是大麦时，可以使用脱壳比率为100%的未脱壳的原料，或条件是未脱壳原料的脱壳比率被限定为100%,脱壳比率不少于通过从未脱壳原料的脱壳比率中减去大麦的外壳比率(通常是7-8%)而确定的值的原料，所述值即92-93%。根据本发明的第二方面，调节谷物的脱壳比率，并且控制培养系统中20营养物的释放率从而增加丝状真菌培养产物中的酶活性。因此，根据待产生的酶的种类，原材料谷物的种类等选择优化的脱壳比率。例如，当通过使用大麦作为原材料产生葡糖淀粉酶或酸稳定性a-淀粉酶时，将脱壳比率设定为90-100%或更优选地98%，其中两种酶以平衡方式高产量产生。术语"脱壳比率"指在谷物脱壳后剩余的谷物的百分比。例如，术语25"90%的脱壳比率"指在谷物的表面层部分有10%的外壳等被脱去。在本发明中，术语"粗大麦"包括那些从未脱壳的大麦到外壳仍保留在谷粒表面上的脱壳大麦，即具有90%或更多脱壳比率的原料。术语"外壳(husk)"指覆盖谷物颗粒表面的外面部分。可以在培养前首先将谷物中存在的淀粉进行胶凝化。可以根据，但不30特别限于常规方法的任一种进行胶凝化淀粉，所述常规方法包括蒸汽方法，烘烤方法等。在如后面所述的对液体培养基灭菌的步骤中，通过在高温和高压下灭菌将淀粉加热到胶凝化温度或更高，通过这样的处理同时进行淀粉的胶凝化。通过混合水，上述培养原材料和其它培养基成分制备在本发明的第二5方面使用的液体培养基。如果需要，可以将液体培养基进行灭菌处理并且对这样的处理的步骤不进行特别限制。例如，可以在121。C的温度进行高温和高压灭菌方法达15分钟。本发明的第三方面，在上述生产丝状真菌培养产物的方法中，使用其外壳或壳被去除并且没有被胶凝化的原料作为培养原材料，控制营养物从io培养原材料向培养系统中的释放率。在本发明的第三方面，需要去除上述培养原材料的外壳或壳，并且没有胶凝化培养原材料。例如，当培养原材料是大麦时，所述原料的脱壳比率不少于通过从未脱壳原料的脱壳比率(100%)中减去大麦的外壳比率(通常是7-8%)而确定15的值，即约92-93%。还可以使用珍珠麦(Pearledbariey)(具有65%的脱壳比率)。没有将上述培养原材料进行处理，如加热，通过加热，其中的淀粉将被胶凝化。然而，根据需要，可以将上述培养原材料进行这样的处理如脱粒，脱壳，剥皮，洗涤，切细(chopping),挤压和冷冻。20在本发明的第三方面中，将上述培养原材料在液体培养基中的混合比率设定到这样的程度，即葡糖淀粉酶和酸稳定性cx-淀粉酶在丝状真菌培养产物中被选择性地产生并且积累。具体而言，可以以关于液体培养基1-10%(重量/体积)，优选地2-6%(重量/体积)的量加入培养原材料。然而，因为优化的混合比率根据所用的丝状真菌菌株的种类，培养原材料25等而变化，可以适当地选择混合比率。在其中使用需氧丝状真菌的情形中，如果所用的培养原材料的量超过上限，培养液体的粘度增加并且需氧培养丝状真菌所需的氧或空气的供应变得不足。这减少了培养产物中的氧含量，限制了培养进程，因此不是优选的。另一方面，当所用的原材料的量少于下限，葡糖淀粉酶和酸稳定性30a-淀粉酶不能以高产量产生。本发明的第三方面所用的液体培养基通过混合水，上述培养原材料和其它培养基成分而制备。在该情形中，如果需要，将除了培养原材料之外的培养基成分与水混合，将混合物提前灭菌，并接着可以将没有被胶凝化的含淀粉的原材料另外加入其中。备选地，可以釆取将培养原材料的部分5和其它培养基成分与水混合的方法，提前将混合物进行灭菌，并接着将没有被胶凝化的剩余的培养原材料加入其中。对灭菌方法没有特别限制。例如可以是在121°C的温度下进行15分钟的高温高压灭菌方法。通过上述培养方法培养丝状真菌以获得丝状真菌培养产物，其中所意10欲的酶有效产生和积累。本发明的丝状真菌培养产物除了培养产物本身之夕卜，包括通过将培养产物进行离心分离等获得的培养液体，其浓缩物，其纯化产物，或其干燥产物等。如上所述，根据上述培养方法，可以高效生产一组酶，在培养系统中，其生产力受到关于糖如葡萄糖或分解的蛋白质如氨基酸的浓度的代谢物15抑制的影响。因此，根据本发明的第十一方面生产酶的方法，与上述生产丝状真菌培养产物的方法相同。将通过本发明获得的丝状真菌培养产物不仅用于生产发酵食品和饮料，还用于生产糖，氨基酸，其衍生物，酶制剂和药物消化剂。可以使用20曲霉培养产物取代固体曲，例如，在生产日本米酒的情形中，在制备酵母醪液或日本米酒醪液的阶段；在生产烧酒的情形中，在醪化(mashing)烧酒醪液的阶段；在生产酱汁的情形中，在堆积阶段；在生产味噌的情形中，在醪化的阶段；在生产酿造醋的情形中，在醪化的阶段；在生产甜日本米酒的情形中，在醪化的阶段；和在生产日本甜米酒(amazake)的情形中，25在醪化的阶段中。可以将用于生产那些发酵食品和饮料的发酵原材料(另外的原材料)进行胶凝化或不进行胶凝化。可以将得到的丝状真菌培养产物的部分用作随后的丝状真菌培养产物的生产的起始物。通过以这种方式连续生产丝状真菌培养产物，获得稳定的产物并且同时提高了生产效率。30作为从本发明的丝状真菌培养产物生产酶制剂的方法，将培养产物本身，其滤液，通过离心分离的上清液等用作液体酶制剂，或其可以通过常规制备方法被干燥或固定以支持。此时，可以将适合的赋形剂等加入其中。当使用上述丝状真菌培养产物生产发酵的食品和饮料如酒精饮料时，可以在液体阶段进行所有的步骤。例如，当生产烧酒时，将玉米，小麦，5水稻，马铃薯，甘蔗等用作原材料并接着将其在约80。C加热以通过用抗热的酶制剂溶解进行液化，将上述曲霉培养产物和酵母加入其中以使醪液进行酒精发酵，并接着将其在正常压力或减压等下蒸馏。实施例10在下文，本发明将通过实施例的方式详细描述。然而，本发明并不限于这些实施例。<实验实施例1>测量葡萄糖从具有不同脱壳比率的大麦的释放率15使具有65%-98%的不同脱壳比率的大麦(斯特灵(Stirling)，产于澳大利亚)与来自曲霉培养产物的酶反应，并测量葡萄糖从大麦中的释放率。具体而言，分别称重2g为65%-脱壳大麦，83%-脱壳大麦，92%-脱壳大麦，95%-脱壳大麦，98%-脱壳大麦和98%-脱壳大麦的压碎产物，并将每种称重的材料和50ml水置于200-ml锥形烧瓶中。将其用高压灭菌器在20121°C进行灭菌15分钟，以制备"大麦底物溶液"。随后，将通过使用大麦(斯特灵(Stirling),产于澳大利亚)生产的作为培养原材料的曲霉培养产物通过用滤纸过滤来进行固体液体分离从而获得"曲霉培养物上清液"。在下面描述用在本实验中的生产曲霉培养产物的方法。25l.预培养的方法将8g65%-脱壳的大麦和100ml水置于500-ml带有挡板的锥形烧瓶中，并将其用高压灭菌器在121°C灭菌15分钟以获得预培养的培养基。冷却后，将白曲霉(AspergilluskawachiiNBRCM308)以1x106/ml接种在预培养的培养基中，并在37。C和100rpm摇动培养24小时以获得预培养的30液体o2.主培养的方法将98%-脱壳的大麦加入补充了0.2%(重量/体积)硝酸钾和0.3°/。(重量/体积)磷酸二氢钾的水中从而使98%-脱壳的大麦的量是2.0%(重量/体积)5以制备液体培养基。将3,000ml制备的液体培养基置于5,000-ml的小型发酵罐(由丸菱株式会社(MarubishiCo.,Ltd)生产)中并用高压灭菌器(在121°C15分钟)灭菌，随后用30ml的白曲霉(AspergilkiskawachiiNBRC4308)的预培养液体接种，其在液体培养基中，通过上述方法提前进行预培养。随后，在37。C的温度和300rpm的搅拌速率，0.5vvm的通风io体积进行培养42小时，用滤纸(2号Toyo滤纸)过滤产物以获得"曲霉培养物上清液"。将50ml由此制备的大麦底物溶液和50ml由此制备的曲霉培养物上清液分别在37°C保持5分钟，接着混合以起始反应。用葡萄糖C-IITestWako15(由瓦克纯化学品工业有限公司(WakoPureChemicalIndustriesCo.,Ltd.)生产)，测量在起始反应后l小时，2小时，3小时和4小时后取样的反应液体中的葡萄糖浓度。4.结果将在反应液体中的葡萄糖浓度的暂时变化显示于图1中。证实释放的20葡萄糖的量根据用于大麦底物溶液的大麦的脱壳程度而不同。一般而言，大麦具有约10%的外壳比例，并且分别用在该实验中的65%-脱壳大麦和83%-脱壳大麦在其表面上没有外壳。与此相对，92%-脱壳大麦，95%-脱壳大麦和98%-脱壳大麦在其表面上仍然具有外壳。如在图1中所示，在其中分别使用了在其表面上没有外壳(husks)的2565%-和83%-脱壳大麦和98%-脱壳大麦压碎产物的实验绘图中，显示了高葡萄糖浓度。与此相对，在其中分别使用了92%-,95%-,和98%-脱壳大麦的实验绘图中，证实了脱壳比率越低，葡萄糖浓度也越低。为此原因，揭示了释放的葡萄糖的量由外壳的存在控制。图2显示在该实验的第一个1小时的反应中葡萄糖释放率的计算值。30从图2证实了，脱壳比率越低，葡萄糖释放率被控制得也越低。在另一个方面，在其中使用了98%-脱壳大麦的压碎产物的实验绘图中，将葡萄糖释放率增加到与65%-脱壳大麦相同的水平。因此，说明在物理上覆盖大麦的淀粉成分的外壳是调节葡萄糖释放率的主要因素。5<实施例1>使用具有不同脱壳比率的大麦生产白曲培养产物通过如下所述的方法，使用不同程度的脱壳大麦(斯特灵(Stirling),产于澳大利亚)，生产白曲霉培养产物，并测量其中的酶活性。io1.预培养的方法将8g65%-脱壳的大麦和100ml水置于500-ml带有挡板的锥形烧瓶中，并将其用高压灭菌器在121。C灭菌15分钟以获得预培养的培养基。冷却后，将白曲霉(AspergilluskawachiiNBRC4308)以1x106/ml接种在预培养的培养基中，并在37。C和100rpm摇动培养24小时以获得预培养的15液体。2.主培养的方法将2g65%-脱壳大麦，83%-脱壳大麦，92%-脱壳大麦，95%-脱壳大麦和98%-脱壳大麦的任一种，0.2g硝酸钾，0.3g磷酸二氢钾和100ml水置于20500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并将其用高压灭菌器在121。C灭菌15分钟以制备主培养基。冷却后，将主培养基用lml的预培养液体进行接种，并在37°C和100rpm摇动培养48小时。3.测量方法25在培养结束后，测量作为淀粉分解酶的葡糖淀粉酶(GA),a-淀粉酶(AA)和酸稳定性cx-淀粉酶(ASAA)的活性。通过使用糖化作用冥微分量化试剂盒(saccharificationpowerfractionalquantificationkit,由龟甲万(Kikkoman)丰朱式会社生产)观lj量葡糖淀粉酶(GA)活性，并且通过使用(x-淀粉酶测量试剂盒(由龟甲万30(Kikkoman)株式会社生产))测量a-淀粉酶(AA)活性。为了测量酸稳定性a-淀粉酶(ASAA)活性，将在SudoS.等J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工程杂志),76,105-110(1993)，SudoS.等J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工程杂志),77，483-489(1994)，和ShigetoshiSudo等JournaloftheBrewingSocietyofJapan(日本酿造协会杂志)，89,768-774(1994)中所述5的方法稍稍改进。即，通过用酸处理培养产物而将酸不稳定性的OC-淀粉酶活性灭活，接着用a-淀粉酶测量试剂盒(由龟甲万(Kikkoman)株式会社生产)测量酸稳定性ot-淀粉酶活性。更具体地说，将9ml的100mM乙酸缓冲液液体(pH3)加入1ml的培养液体中，在37。C进行酸处理1小时，并用a-淀粉酶测量试剂盒(由龟甲万(Kikk謹an)株式会社生产)测量。io接着测量作为纤维素分解酶的纤维素酶(CEL)和j3-葡糖苷酶(BGL)的活性。通过用二硝基水杨酸(DNS)方法量化由作为底物的羧甲基纤维素(CMC)的水解产生的还原糖的量的方法来测量纤维素酶(CEL)活性。更具体而言，将1ml的培养液体加入1ml的1%CMC底物溶液(通过在100mM乙酸缓冲液液体(pH5)中溶解希格玛-奥尔德利希(Sigma-Aldrich)生产的低is粘度TM获得的溶液)，并使酶反应在40。C精确进行10分钟。随后，将包含0.75%的二硝基水杨酸，1.2%的氢氧化钠，22.5%的四水合酒石酸钠钾和0.3M的一水合乳糖的4mlDNS试剂加入混合物中，并充分混合以终止反应。为了在终止反应后，量化液体中的还原糖的量，将终止反应后的液体在煮沸的水浴中精确加热15分钟。随后，将液体冷却到室温，测定在20540nm的吸光度以量化与葡萄糖的量对应的还原糖的量。一个单位的纤维素酶(CEL)活性表示每分钟产生对应于1pmol的葡萄糖的还原糖所需要的酶量。通过如下面所述的方法测量P-葡糖苷酶的活性。使用1mM的对-硝基苯基-(3-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)作为底物，将酶反应在37°C在50mM乙酸25缓冲液液体(pH5)中精确进行10分钟。反应终止后，通过在410nm的吸光度来量化产生的对-硝基苯酚的量以计算酶活性。通过在其中加入反应液体双倍量的200mM碳酸钠溶液来终止反应。将一个活性的单位表示为通过其每分钟释放1pmol的葡萄糖的活性。图3和4显示测量结果。4.结果如在图3中所显示，当脱壳比率减少时，淀粉分解酶的生产力增加。甚至对于具有低脱壳比率的98%-脱壳大麦而言，当大麦被压碎时，其中的酶生产力显著减少。此外，如在图4中所显示，观察到当脱壳比率减少5时，纤维素分解酶的生产力增加的趋势。以这种方式，观察到在白曲霉培养产物中的酶生产力具有与葡萄糖释放率成逆相关的趋势，如在实验实施例1中所示，并且揭示在白曲霉培养产物中的酶生产力通过改变大麦的脱壳比率而被控制。io<实施例2>使用具有不同脱壳比率的大麦生产黑曲霉培养产物通过使用不同程度的脱壳大麦(斯特灵(Stirling),产于澳大利亚)，利用如下面所述的方法生产黑曲霉培养产物，并测量其中的酶活性。151.预培养的方法将8g65%-脱壳的大麦和100ml水置于500-ml带有挡板的锥形烧瓶中，并将其用高压灭菌器在121。C灭菌15分钟以获得预培养的培养基。冷却后，将黑曲霉(泡盛曲霉NBRC4388)以1x10Vml接种在预培养的培养基中，并在37。C和100rpm摇动培养24小时以获得预培养的液体。202.主培养的方法将2g65%-脱壳大麦，83%-脱壳大麦，92%-脱壳大麦，95%-脱壳大麦和98%-脱壳大麦的任一种，0.2g硝酸钾，0.3g磷酸二氢钾和100ml水置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并将其用高压灭菌器在121°C灭菌15分钟25以制备主培养基。冷却后，将主培养基用1ml的预培养液体进行接种，并在37。C和100rpm摇动培养48小时。3.测量方法在培养结束后，测量作为淀粉分解酶的葡糖淀粉酶(GA),a-淀粉酶30(AA)和酸稳定性(x-淀粉酶(ASAA)的活性。通过使用糖化作用冥微分量化试剂盒(由龟甲万(Kikkoman)株式会社生产)测量葡糖淀粉酶(GA)活性，并且通过使用a-淀粉酶测量试剂盒(由龟甲万(Kikkoman)株式会社生产))测量a-淀粉酶(AA)活性。为了测量酸稳定性oc-淀粉酶(ASAA)活性，将在SudoS.等J.Ferment.Bioeng.(发5酵生物工程杂志)，76,105-110(1993),SudoS.等:J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工程杂志)，77，483-489(1994),和ShigetoshiSudo等JournaloftheBrewingSocietyofJapan(日本酿造协会杂志)，89,768-774(1994)中所述的方法稍稍改进。即，通过用酸处理培养产物而将酸不稳定性的a-淀粉酶活性灭活，接着用a-淀粉酶测量试剂盒(由龟甲万(Kikkoman)株式会社io生产)测量酸稳定性a-淀粉酶活性。更具体地说，将9ml的100mM乙酸缓冲液液体(pH3)加入1ml的培养液体中，在37°C进行酸处理1小时，并用a-淀粉酶测量试剂盒(由龟甲万(Kikkoman)株式会社生产)测量。图5-7显示测量结果。154.结果如在图5-7中所显示，当脱壳比率减少时，淀粉分解酶的生产力增加。甚至对于具有低脱壳比率的98%-脱壳大麦而言，当大麦被压碎时，其中的酶生产力显著减少。以这种方式，观察到在黑曲霉培养产物中的酶生产力具有与葡萄糖释放率成逆相关的趋势，如在实验实施例1中所示，并且20揭示在黑曲霉培养产物中的酶生产力通过改变大麦的脱壳比率而被控制。<实施例3〉使用具有不同脱壳比率的大麦生产黄曲霉培养产物通过如下所述的方法，使用不同程度的脱壳大麦(斯特灵(Stirling),25产于澳大利亚)，生产黄曲霉培养产物，并测量其中的酶活性。1.培养方法将100ml培养基置于500-ml的带挡板的锥形烧瓶中，并用高压灭菌器在121。C灭菌15分钟以制备培养基，所述培养基包含2g65。/。-脱壳大30麦，83%-脱壳大麦，92%-脱壳大麦，95%-脱壳大麦和98%-脱壳大麦的任一种，1.2%(重量/体积)的硝酸钠，0.8%(重量/体积)的氯化钾，0.4%(重量/体积)的磷酸二氢钾，0.2%(重量/体积)的七水合硫酸镁，0.08%(重量/体积)的七水合硫酸铁和水。冷却后，将黄曲霉(米曲霉RIB40)以1x106/ml接种到预培养的培养基中并在30°C和100rpm摇动培养72小时。52.测量方法在培养结束后，测量作为淀粉分解酶的葡糖淀粉酶(GA)和a-淀粉酶(AA)的活性。通过使用糖化作用冥微分量化试剂盒(由龟甲万(Kikkoman)株式会io社生产)测量葡糖淀粉酶(GA)活性，并且通过使用ct-淀粉酶测量试剂盒(由龟甲万(Kikkoman)株式会社生产))测量a-淀粉酶(AA)活性。图8和9显示测量结果。3.结果15如在图8和9中所显示，当脱壳比率减少时，淀粉分解酶的生产力增力口。具体地，当使用98%-脱壳大麦时，葡糖淀粉酶的活性显著增加。甚至关于具有低脱壳比率的98%-脱壳大麦而言，当使用其压碎的大麦时，其中的酶生产力显著减少。如上所述，揭示了在黄曲霉培养产物中的酶生产力被葡萄糖释放率大大影响，如在实验实施例1中所显示，并且通过改20变大麦的脱壳比率控制黄曲霉培养产物的酶生产力。<实施例4>通过使用具有不同脱壳比率的大麦生产丝状真菌(绿色木霉)培养产物通过下面所述的方法，使用不同程度的脱壳大麦(斯特灵(Stirling),产25于澳大利亚)，生产能够产生纤维素分解酶的丝状真菌(绿色木霉)的培养产物，并测量其中的酶活性。1.预培养方法将100ml的培养基置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并将其用高压灭30菌器在121°C灭菌15分钟以制备预培养培养基，所述培养基中包含2%的葡萄糖，0.5%的酵母提取物，0.1%的硝酸钾，0.1%的磷酸二氢钾，0.07%的硫酸铵，0.03%的七水合硫酸镁，0.02%的氯化钙(每个％以重量/体积表示)和水。冷却后，将绿色木霉(绿色木霉NBRC31137)以lxl0"ml接种到预培养的培养基中，并在30。C和100rpm摇动培养24小时以获得预培5养的液体。2.主培养的方法将100ml的培养基置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并用高压灭菌器在121。C灭菌15分钟以获得主培养基，所述培养基包含2M的脱壳大麦，io0.08%的胰胨，0.25%的硫酸铵，0.1%的磷酸铵，0.03%的氯化钙，0.03%的七水合硫酸镁，0.12%的硝酸钾(每个％以重量/体积表示)和水。将65%-脱壳大麦，83%-脱壳大麦，92%-脱壳大麦，95%-脱壳大麦,98%-脱壳大麦或98%-脱壳大麦压碎产物用作上述的脱壳大麦。冷却后，将主培养基用10ml的预培养液体接种，并在30。C和100rpm15摇动培养90小时。培养结束后，测量作为纤维素分解酶的纤维素酶(CEL)的活性。通过用二硝基水杨酸(DNS)方法量化由作为底物的羧甲基纤维素(CMC)的水解20产生的还原糖的量的方法来测量纤维素酶(CEL)活性。更具体而言，将1ml的培养液体加入1ml的1%CMC底物溶液(通过在100mM乙酸缓冲液液体(pH5)中溶解希格玛-奥尔德利希(Sigma-Aldrich)生产的低粘度，获得的溶液)，并使酶反应在40。C精确进行IO分钟。随后，将包含0.75%的二硝基水杨酸，1.2%的氢氧化钠，22.5%的四水合酒石酸钠钾和0.3%的一水合25乳糖的4mlDNS试剂加入混合物中，并充分混合以终止反应。为了在终止反应后，量化液体中的还原糖的量，将终止反应后的液体在煮沸的水浴中精确加热15分钟。随后，将液体冷却到室温，测定在540nm的吸光度以量化与葡萄糖的量对应的还原糖的量。一个单位的纤维素酶(CEL)活性表示每分钟产生对应于1pmol的葡萄糖的还原糖所需要的酶量。304.结果图10显示测量结果。其证实了在绿色木霉中，纤维素酶(cellulose)生产力根据脱壳比率也有所不同，所述绿色木霉是除了曲霉之外的丝状真菌。98%-脱壳大麦提供最高的酶生产力，而其压碎产物在酶活性上显著减少。因此，说明大麦外壳的营养物释放抑制作用有利于纤维素酶的高产量。<实施例5>通过使用具有不同脱壳比率的大麦生产丝状真菌(Trichodermareesei)通过下面所述的方法，使用不同程度的脱壳大麦(斯特灵(Stirling),产io于澳大利亚)，生产能够产生纤维素分解酶的丝状真菌(Trichodermareesei)的培养产物，并测量其中的酶活性。1.培养方法(1)预培养方法15将100ml的培养基置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并将其用高压灭菌器在121°C灭菌15分钟以制备预培养培养基，所述培养基中包含2%的葡萄糖，0.5%的酵母提取物，0.1%的硝酸钾，0.1%的磷酸二氢钾，0.07%的硫酸铵，0.03%的七水合硫酸镁，0.02%的氯化钙(每个％以重量/体积表示)和水。冷却后，将Trichodermareesei(TrichodermareeseiNBRC31326)20以1x106/ml接种到预培养的培养基中，并在30°C和100rpm摇动培养72小时以获得预培养的液体。(2).主培养的方法将100ml的培养基置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并用高压灭菌25器在121°C灭菌15分钟以获得主培养基，所述培养基包含2%的脱壳大麦，0.08%的胰胨，0.25%的硫酸铵，0.1%的磷酸铵，0.03%的氯化钙，0.03%的七水合硫酸镁，0.12%的硝酸钾(每个％以重量/体积表示)和水。将65%-脱壳大麦，83%-脱壳大麦，95%-脱壳大麦，98%-脱壳大麦或98%-脱壳大麦压碎产物用作上述的脱壳大麦。30冷却后，将主培养基用10ml的预培养液体接种，并在30。C和100rpm摇动培养96小时。'2.测量酶活性的方法在培养结束后，将培养物液体离心以收集上清液，并测量上清液中的5植物纤维降解酶的活性。G)测量纤维素酶活性的方法通过用二硝基水杨酸(DNS)方法量化由作为底物的羧甲基纤维素(CMC)的水解产生的还原糖的量的方法来测量纤维素酶(CEL)活性。更具体而言，将1ml的培养液体加入1ml的1%CMC底物溶液(通过在100mM乙酸缓10冲液液体(pH5)中溶解希格玛-奥尔德利希(Sigma-Aldrich)生产的低粘度TM获得的溶液)，并使酶反应在40。C精确进行IO分钟。随后，将包含0.75%的二硝基水杨酸，1.2%的氢氧化钠，22.5%的四水合酒石酸钠钾和0.3%的一水合乳糖的4mlDNS试剂加入混合物中，并充分混合以终止反应。为了在终止反应后，量化液体中的还原糖的量，将终止反应后的液体在煮沸的15水浴中精确加热15分钟。随后，将液体冷却到室温，测定在540nm的吸光度以量化与葡萄糖的量对应的还原糖的量。一个单位的纤维素酶(CEL)活性表示每分钟产生对应于1pmol的葡萄糖的还原糖所需要的酶量。(2)测量木聚糖酶活性的方法20接下来，通过使还原糖与DNS反应并且量化在540nm的吸光度的增加来测量木聚糖酶(XYL)活性，所述还原糖通过将来自燕麦-斯卑尔脱小麦(oatspelts)的木聚糖作为底物酶促水解产生。更具体地，将0.1ml的培养物液体加入1.9ml的1%木聚糖底物溶液(木聚糖，来自溶解在200mM乙酸缓冲液体(pH4.5)的由希格玛-奥尔德利希(Sigma-Aldrich)出品的燕麦-斯25卑尔脱小麦)，并使酶促反应在40°C精确进行10分钟。随后，将包含0.75%的二硝基水杨酸，1.2%的氢氧化钠，22.5%的四水合酒石酸钠钾和0.3%的一水合乳糖的4mlDNS试剂加入混合物中，并充分混合以终止反应。为了在终止反应后，量化液体中的还原糖的量，在终止反应后，将液体在煮沸的水浴中精确加热15分钟。随后，将液体冷却到室温，测定在540nm30的吸光度以量化对应于木糖的量的还原糖的量。一个单位的木聚糖酶活性表示在40°C和10分钟反应条件下，每分钟生产对应于1(imol的木糖的还原糖所需要的酶量。(3)测量(3-葡糖苷酶活性的方法5通过如下面所述的方法测量P-葡糖苷酶(BGL)活性。在50mM乙酸缓冲液液体(pH5)中，使用lmM对-硝基苯基-卩-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)作为底物，将酶促反应在37。C精确进行10分钟。反应终止后，通过在410nm的吸光度量化产生的对-硝基苯酚的量来计算酶活性。通过加入反应液体2倍量的200mM的碳酸钠溶液来终止反应。一个单位的活性表示通过io其使每分钟有1pmol的葡萄糖被释放的活性。3.结果图11-13显示测量结果。其证实植物纤维降解酶的生产力在Trichodermareesei中也随脱壳比率变化，所述Trichodermareesei是除了曲霉之外的丝15状真菌。当使用95%-或98%-脱壳大麦时，获得了高酶生产力。然而，当使用98%-脱壳大麦压碎产物时，酶活性显著减少。因此，其说明大麦外壳对营养物释放的营养物释放抑制作用有利于植物纤维降解酶的高产量。<实施例6>20使用具有不同脱壳比率的大麦生产丝状真菌(棘孢曲霉)培养产物通过下面所述的方法，使用不同程度的脱壳大麦(斯特灵(Stirling)，产于澳大利亚)，生产能够产生纤维素分解酶的丝状真菌(棘孢曲霉)培养产物，并测量其中的酶促活性。251.培养方法(1)预培养方法将100ml的培养基置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并将其用高压灭菌器在121°C灭菌15分钟以制备预培养培养基，所述培养基中包含2%的葡萄糖，0.5%的酵母提取物，0.1%的硝酸钾，0.1%的磷酸二氢钾，0.07%30的硫酸铵，0.03%的七水合硫酸镁，0.02%的氯化钙(每个％以重量/体积表示)和水。冷却后，将棘孢曲霉(棘孢曲霉NBRC3530)以1x10"ml接种到预培养的培养基中，并在30。C和100rpm摇动培养72小时以获得预培养的液体。(2)主培养的方法将100ml的培养基置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并用高压灭菌器在121。C灭菌15分钟以获得主培养基，所述培养基包含2。/。的脱壳大麦，0.08%的胰胨，0.25%的硫酸铵，0.1%的磷酸铵，0.03%的氯化钙，0.03%的七水合硫酸镁，0.12%的硝酸钾(每个％以重量/体积表示)和水。将65%-脱壳大麦，83%-脱壳大麦，95%-脱壳大麦，98%-脱壳大麦或98%-脱壳大麦压碎产物用作上述的脱壳大麦。冷却后，将主培养基用10ml的预培养液体接种，并在30。C和100rpm摇动培养96小时。2.测量酶活性的方法在培养结束后，将培养物液体离心以收集上清液，并测量上清液中的植物纤维降解酶的活性。(1)测量纤维素酶活性的方法通过用二硝基水杨酸(DNS)方法量化由作为底物的羧甲基纤维素(CMC)的水解产生的还原糖的量的方法来测量纤维素酶(CEL)活性。更具体而言，将lml的培养液体加入lml的1。/。CMC底物溶液(通过在100mM乙酸缓冲液液体(pH5)中溶解希格玛-奥尔德利希(Sigma-Aldrich)生产的低粘度TM获得的溶液)，并使酶反应在40。C精确进行10分钟。随后，将包含0.75%的二硝基水杨酸，1.2%的氢氧化钠，22.5%的四水合酒石酸钠钾和0.3%的一水合乳糖的4mlDNS试剂加入混合物中，并充分混合以终止反应。为了在终止反应后，量化液体中的还原糖的量，将终止反应后的液体在煮沸的水浴中精确加热15分钟。随后，将液体冷却到室温，测定在540nm的吸光度以量化与葡萄糖的量对应的还原糖的量。一个单位的纤维素酶(CEL)活性表示每分钟产生对应于1pmol的葡萄糖的还原糖所需要的酶量。(2)测量(3-葡糖苷酶活性的方法通过如下面所述的方法测量(3-葡糖苷酶(BGL)活性。在50mM乙酸缓冲液液体(pH5)中，使用lmM对-石肖基苯基-卩-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)作为底物，将酶促反应在37°C精确进行10分钟。反应终止后，通过在4105nm的吸光度量化产生的对-硝基苯酚的量来计算酶活性。通过加入反应液体2倍量的200mM的碳酸钠溶液来终止反应。一个单位的活性表示通过所述活性每分钟有1pmol的葡萄糖被释放。3.结果io图14和15显示测量结果。其证实植物纤维降解酶的生产力在棘孢曲霉中也随脱壳比率变化，所述棘孢曲霉是除了曲霉之外的丝状真菌。当使用98%-脱壳大麦时，获得了高酶生产力。然而，当使用其压碎产物时，CEL和BGL活性减少。因此，其说明大麦外壳对营养物释放的营养物释放抑制作用有利于那些酶的高产量。15<实施例7>使用具有不同脱壳比率的大麦生产白腐真菌培养产物通过使用不同程度的脱壳大麦(斯特灵(Stirling)，产于澳大利亚)，通过下面所述的方法生产能够产生纤维素分解酶的白腐真菌的培养产物，20并测量其中的酶活性。1.培养方法(1)预培养方法将100ml的培养基置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并将其用高压灭25菌器在121°C灭菌15分钟以制备预培养培养基，所述培养基中包含2%的葡萄糖，0.5%的酵母提取物，0.1%的硝酸钾，0.1%的磷酸二氢钾，0.07%的硫酸铵，0.03%的七水合硫酸镁，0.02%的氯化钙(每个％以重量/体积表示)和水。冷却后，将预培养培养基以30个5mmx5mm大小的乳白耙菌(乳白耙菌NBRC5367)菌丝丛接种，并在28°C和UOrpm摇动培养％小30时以获得预培养的液体。(2)主培养的方法将100ml的培养基置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并用高压灭菌器在121。C灭菌15分钟以获得主培养基，所述培养基包含2。/。的脱壳大麦，50.1%的聚胨，0.14%的硫酸铵，0.2%的磷酸二氢钾，0.03%的尿素，0.03%的七水合硫酸镁，0.03%的氯化钙，0.1%的吐温80(每个％以重量/体积表示)和水。将65%-脱壳大麦，83%-脱壳大麦，98%-脱壳大麦或98%-脱壳大麦压碎产物用作上述的脱壳大麦。io冷却后，将主培养基用10ml的预培养液体接种，并在28。C和120rpm摇动培养96小时。2.测量酶活性的方法在培养结束后，将培养物液体离心以收集上清液，并测量上清液中的15植物纤维降解酶的活性。(1)测量纤维素酶活性的方法通过用二硝基水杨酸(DNS)方法量化由作为底物的羧甲基纤维素(CMC)的水解产生的还原糖的量的方法来测量纤维素酶(CEL)活性。更具体而言，将1ml的培养液体加入1ml的1%CMC底物溶液(通过在100mM乙酸缓20冲液液体(pH5)中溶解希格玛-奥尔德利希(Sigma-Aldrich)生产的低粘度获得的溶液)，并使酶反应在40。C精确进行IO分钟。随后，将包含0.75%的二硝基水杨酸，1.2%的氢氧化钠，22.5%的四水合酒石酸钠钾和0.3%的一水合乳糖的4mlDNS试剂加入混合物中，并充分混合以终止反应。为了在终止反应后，量化液体中的还原糖的量，将终止反应后的液体在煮沸的25水浴中精确加热15分钟。随后，将液体冷却到室温，测定在540nm的吸光度以量化与葡萄糖的量对应的还原糖的量。一个单位的纤维素酶(CEL)活性表示每分钟产生对应于1kimol的葡萄糖的还原糖所需要的酶量。(2)测量木聚糖酶活性的方法30接下来，通过使还原糖与DNS反应并且量化在540nm的吸光度的增加来测量木聚糖酶(XYL)活性，所述还原糖通过将来自燕麦-斯卑尔脱小麦的木聚糖作为底物酶促水解产生。更具体地，将O.lml的培养物液体加入1.9ml的1%木聚糖底物溶液(木聚糖，来自溶解在200mM乙酸缓冲液体(pH4.5)的由希格玛-奥尔德利希(Sigma-Aldrich)出品的燕麦-斯卑尔脱小5麦)，并使酶促反应在40°C精确进行10分钟。随后，将包含0.75%的二硝基水杨酸，1.2%的氢氧化钠，22.5%的四水合酒石酸钠钾和0.3%的一水合乳糖的4mlDNS试剂加入混合物中，并充分混合以终止反应。为了在终止反应后，量化液体中的还原糖的量，在终止反应后，将液体在煮沸的水浴中精确加热15分钟。随后，将液体冷却到室温，测定在540nm的吸光io度以量化对应于木糖的量的还原糖的量。一个单位的木聚糖酶活性表示在40°C和10分钟反应条件下，每分钟生产对应于1pmol的木糖的还原糖所需要的酶量。3.结果15图16和17显示测量结果。其证实了在白腐真菌中，植物纤维降解酶的生产力也随脱壳比率变化。当使用98%-脱壳大麦时，获得了最高的酶生产力。然而，当使用其压碎产物时，酶活性显著减少。因此，说明大麦外壳对营养物释放的营养物释放抑制作用有利于植物纤维降解酶的高产量。20<实施例8>使用没有被胶凝化的珍珠麦生产白曲霉培养产物(1)预培养的方法将8g珍珠麦(斯特灵(Stirling)，产于澳大利亚)和100ml水置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并用高压灭菌器在121。C灭菌15分钟以获25得预培养培养基。将白曲霉(AspergilluskawachiiNBRC4308)以1x106/ml接种到预培养培养基中，并在37。C和100rpm摇动培养24小时以获得预培养的液体。(2)主培养方法30将0.2g的KN03，0.3g的KH2P04，100ml水置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并用高压灭菌器在121°C灭菌15分钟。冷却后，将氯霉素(瓦克纯化学品工业有限公司(WakoPureChemicalIndustriesCo.,Ltd,))加入得到的产物使其浓度为50吗/ml，并将没有经过加热处理的2g珍珠麦加入其中以获得主培养基。用lml的预培养液体接种主培养基，并在37。C和5100rpm摇动培养72小时以获得曲霉培养产物。通过使用胶凝化的培养原材料生产曲霉培养产物作为对照。即，将2g珍珠麦，0.2g的KN03,0.3g的KH2P04,和100ml水置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并用高压灭菌器在121。C灭菌15分钟。冷却后，将氯霉素加入得到的产物使其浓度为50叱/ml，以获得主培养基。用1ml的预培养io液体接种主培养基，并在37°C和100rpm摇动培养72小时以获得曲霉培养产物。(3)测量方法测量在各个实验设计中获得的在曲霉培养产物中的葡糖淀粉酶，酸稳15定性a-淀粉酶,和cc-淀粉酶的活性。即，通过使用糖化作用冥微分量化试剂盒(由Kikkoman株式会社生产)测量葡糖淀粉酶活性。为测量酸稳定性a-淀粉酶活性，将在SudoS.等J.FermentBioeng.(发酵生物工程杂志)，76,105-110(1993),SudoS.等J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工程杂志)，77,483-489(1994),禾口ShigetoshiSudo等JournaloftheBrewingSocietyof20Japan(日本酿造协会杂志)，89，768-774(1994)中所述的方法稍稍修改。艮口，通过用酸处理培养产物来灭活酸不稳定性oc-淀粉酶活性，接着用oc-淀粉酶测量试剂盒(由Kikkoman株式会社生产)测量酸稳定性a-淀粉酶活性。更具体地，将9ml100mM乙酸缓冲液液体(pH3)加入1ml的培养液体，并在37。C进行酸处理1小时，并用ot-淀粉酶测量试剂盒(由Kikkoman25株式会社生产)测量。通过使用oi-淀粉酶测量试剂盒(由Kikkoman株式会社生产)测量a-淀粉酶活性。结果显示在表1中。(4)结果在本发明的珍珠原麦(pearledrawbarley)曲霉培养产物中，以良好和30平衡的方式生产葡糖淀粉酶和酸稳定性cc-淀粉酶。而ot-淀粉酶的产量稍低。在对照中，生产相对大量的酸稳定性a-淀粉酶和cx-淀粉酶。这可能是因为尽管使用了胶凝化的原材料，由于KN03和KH2P04的存在，营养物条件维持在适合的范围。因此，揭示了根据本发明生产了可用于生产发酵食品和饮料的曲霉培养广物。1实验设计酶活性珍珠原麦曲霉培养(没有外壳并且没有被胶凝化)对照(没有外壳并且被胶凝化)葡糖淀粉酶活性(U/ml)110.629,2酸稳定性a-淀粉酶活性(U/ml)3.63.7a-淀粉酶活性(U/ml)8.310.7io<实施例9>通过使用没有被胶凝化的珍珠麦，用白曲霉培养产物生产大麦烧酒(l)预培养方法将8g珍珠麦(斯特灵(Stirling)，产于澳大利亚)和100ml水置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并用高压灭菌器在121。C灭菌15分钟以获得预培15养培养基。将白曲霉(AspergilluskawachiiNBRC4308)以1x106/ml接种到预培养培养基中，并在37。C和100rpm摇动培养24小时以获得预培养的(2)主培养的方法将0.5g的珍珠麦，0.2g的KN03，0.3g的KH2POjn100ml的水置于20500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并将其用高压灭菌器在121°C灭菌15分钟以获得主培养基。将主培养基用1ml的预培养液体接种，并在37°C和100rpm摇动培养24小时。随后，将没有被加热处理的1.5g珍珠麦加入其中，并在37。C和100rpm再摇动培养48小时以获得曲霉培养产物。(3)酵母将鹿儿岛(Kagoshima)酵母在1ml的YPD培养基中在100rpm摇动培养过夜，离心以收集细胞，并用灭菌水洗涤2次。(4)醪化将醪化组合显示在表2中。对于附加的大麦，使用珍珠麦，其被洗涤随后进行浸没60分钟，排水30分钟，和蒸40分钟。使用上述酵母的总量。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>10(5)发酵条件将发酵在25。C进行20天。在一级醪化后3天进行二级醪(6)蒸馏在-650mmHg的减压下进行蒸馏。15(7)结果连续进行发酵，发酵结束后的醪液具有17.5%的酒精含量。由6个酒精饮料的专家组成的小组对蒸馏后获得的样品进行感官评估。结果，获得的样品被高度评价为酒精饮料上等品。从该结果，揭示根据本发明的方法生产了具有无暇品质的大麦烧酒。20<实施例10>使用没有被胶凝化的珍珠麦生产黄曲霉培养产物(1)预培养的方法将8g珍珠麦(斯特灵(Stirling)，产于澳大利亚)和100ml水置于500-ml25带挡板的锥形烧瓶中，并用高压灭菌器在121°C灭菌15分钟以获得预培养培养基。将黄曲霉(米曲霉NRIB40)以1x10々ml接种到预培养培养基中，并在37°C和100rpm摇动培养24小时以获得预培养的液体。(2)主培养方法将0.8g的KN03,1.2g的KH2P04,0.2g的MgS04和100ml水置于5500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并用高压灭菌器在121°C灭菌15分钟。冷却后，将氯霉素(瓦克纯化学品工业有限公司(WakoPureChemicalIndustriesCo.,Ltd.))加入得到的产物使其浓度为50(ig/ml，并将2g珍珠麦加入其中以获得主培养基。用1ml的预培养液体接种主培养基，并在37°C和100rpm摇动培养72小时以产生曲霉培养产物。)0对于阳性对照，通过根据本发明的第二方面的方法生产曲霉培养产物。即，将2g95%-脱壳大麦(斯特灵(Stirling)，产于澳大利亚)，0.8g的KN03，1.2g的KH2PO4，0.2g的MgS04和100ml的水置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中，并在121。C用高压灭菌器灭菌15分钟。冷却后，将氯霉素加入得到的产物中使其浓度为50吗/ml以获得主培养基。将主培养基用1ml15的预培养液体接种，并将其在37。C和100rpm摇动培养72小时以生产曲霉培养产物。(3)结果以与实施例8相同的方式测量在各个实验设计中获得的曲霉培养产20物中的葡糖淀粉酶和a-淀粉酶的活性。表3显示结果。在珍珠原麦曲霉培养产物中，以良好的方式生产葡糖淀粉酶，而a-淀粉酶活性稍低。两种酶的活性都次于阳性对照中的那些酶活性。然而，两种酶都以平衡方式生产。因此，揭示，提供了可用于生产发酵食品和饮料的曲霉培养产物。25表3<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><实验实施例2>测量在灭菌时具有各种无机盐浓度的大麦底物溶液中的葡萄糖释放率通过用高压灭菌器对包含大麦的各种盐浓度的无机盐水溶液进行灭5菌来获得大麦底物溶液。使每种大麦底物溶液与来自曲霉培养产物的酶反应，并测量来自大麦中的葡萄糖释放率。1.制备大麦底物溶液的方法第一，称重2g的98。/。-脱壳大麦(斯特灵(Stirling)，产于澳大利亚)，io接着将其与50ml水一起置于500-ml锥形烧瓶中。将其用高压灭菌器灭菌(在121°C15分钟)以制备大麦底物溶液，接着将其表示为"1号对照设计"。在"2号使用盐的设计"中，以与"1号对照设计"相同的方式进行高压灭菌器灭菌，除了使用50ml的包含0.1g的硝酸钾和0.15g的磷酸二氢钾的无机盐水溶液取代水。换言之，用高压灭菌器灭菌时的盐浓度是0.2%的硝酸钾，和0.3%的磷酸二氢钾。在"3号灭菌时使用高浓度的盐的设计"中，以与"1号对照设计"相同的方式进行高压灭菌器灭菌，除了使用包含0.1g的硝酸钾和0.15g的磷酸二氢钾的10ml无机盐水溶液取代水，并且将40ml的灭菌水加20入其中。换言之，灭菌时的盐浓度是1.0%的硝酸钾，和1.5%的磷酸二氢钾，其是实验设计2号中的那些的5倍。然而，调节灭菌和添加水后的盐浓度以获得0.2%的硝酸钾和0.3%的磷酸二氢钾，其与实验设计2号中的那些相同。2.制备曲霉培养物上清液的方法随后，通过使用大麦(斯特灵(Stirling)，产于澳大利亚)作为培养原材料生产的曲霉培养产物通过用滤纸过滤进行固体-液体分离，以获得"曲霉培养物上清液"。生产用在本实验中的曲霉培养产物的方法如下面所述。(1)预培养的方法将8g65%-脱壳大麦和100ml水置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中并用高压灭菌器在121。C灭菌15分钟以获得预培养培养基。冷却后，将白曲霉(AspergilluskawachiiNBRC4308)以1x106/ml接种在预培养的培养基5中并在37°C和100rpm摇动培养24小时以获得预培养液体。(2)主培养的方法将98%-脱壳大麦加入补充了0.2%(重量/体积)的硝酸鉀和0.3%(重量/体积)的磷酸二氢钾的水中以使98%-脱壳大麦的量是2.0%(重量/体积)以io制备液体培养基。将3,000ml的制备液体培养基置于5，000-ml的小型发酵罐(由丸菱株式会社(MarubishiCo.,Ud)生产)中，并用高压灭菌器(在121。C，15分钟)灭菌，随后用30ml的白曲霉(AspergilluskawachiiNBRC4308)的预培养液体接种，所述白曲霉用上述方法在液体培养基中提前预培养。随后，在37。C的温度和300rpm的搅拌速率，以及0.5vvm的15通风体积，进行培养42小时，用滤纸(2号Toyo滤纸)过滤得到的产物以获得"曲霉培养物上清液"。3.测量葡萄糖释放率的方法将50ml的大麦底物溶液和50ml的曲霉培养上清液分别保持在37°C20达5分钟，并接着混合以起始反应。用葡萄糖C-IITestWako(由瓦克纯化学品工业有限公司生产)测量在反应起始后3小时分别取样的反应液体中的葡萄糖浓度以计算葡萄糖的释放率。4.结果25通过如图18所显示，测量反应液体中的葡萄糖浓度的结果计算葡萄糖释放率。证实了在制备大麦底物溶液上，葡萄糖释放率随盐浓度而变化。在实验实施例l中，己经显示葡萄糖释放率随大麦的脱壳比率而调节。实验实施例2还揭示，在用如高压灭菌器灭菌的热处理后，由于盐的存在葡萄糖释放率变慢。这可能是因为当热处理大麦时，盐的存在抑制了大麦的30物理分解。<实施例11>使用灭菌时具有各种盐浓度的大麦生产白曲霉培养产物使用不同程度的脱壳大麦(斯特灵(Stirling),产于澳大利亚)，通过5在下面所述的方法生产白曲霉培养产物，并测量其中的酶活性。1.预培养方法将8g65%-脱壳大麦和100ml水置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中并用高压灭菌器在121。C灭菌15分钟以获得预培养培养基。冷却后，将白曲io霉(AspergilluskawachiiNBRC4308)以1x106/ml接种在预培养的培养基中并在37°C和100rpm摇动培养24小时以获得预培养液体。2.主培养方法称重2g的98%-脱壳大麦(斯特灵(Stirling)，产于澳大利亚)，并将其15与100ml水一起置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中。用高压灭菌器将其在121。C灭菌15分钟以制备主培养基，接着将其表示为"l号对照设计"。在"2号使用盐的设计"中，以与"1号对照设计"相同的方式进行高压灭菌器灭菌，除了使用100ml的包含0.2g的硝酸钾和0.3g的磷酸二氢钾的无机盐水溶液取代水。20在"3号灭菌时使用高浓度的盐的设计"中，以与"1号对照设计"相同的方式进行高压灭菌器灭菌，除了使用包含0.2g的硝酸钾和0.3g的磷酸二氢钾的20ml无机盐水溶液取代水，并且将80ml的灭菌水加入其中。换言之，灭菌时盐浓度分别是1.0%的硝酸钾，和1.5%的磷酸二氢钾，其是实验设计2号中的那些的5倍。然而，调节灭菌和添加水后的25盐浓度以获得0.2%的硝酸钾和0.3%的磷酸二氢钾，其与实验设计2号中的那些相同。冷却后，将由此制备的主培养培养基用1ml的预培养培养基接种，并在37°C和100rpm摇动培养48小时。303.测量方法培养结束后，测量作为淀粉分解酶的葡糖淀粉酶(GA)和酸稳定性(x-淀粉酶(ASAA)的活性。通过使用saccharificationpowerfractional量化试齐U盒(由Kikkoman株式会社生产)测量葡糖淀粉酶(GA)活性。5为了测量酸稳定性a-淀粉酶(ASAA)活性，将在SudoS.等J.Ferment.Bioeng,(发酵生物工程杂志)，76,105-110(1993),SudoS.等J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工程杂志)，77,483-489(1994),和ShigetoshiSudo等JournaloftheBrewingSocietyofJapan(日本酉良造协会杂志)，89,768-774(1994)中所述的方法稍稍改进。即，通过用酸处理培养产物而将酸io不稳定性的(x-淀粉酶活性灭活，接着用ot-淀粉酶测量试剂盒(由Kikkoman株式会社生产)测量酸稳定性ot-淀粉酶活性。更具体地说，将9ml的100mM乙酸缓冲液液体(pH3)加入1ml的培养物液体中，在37°C进行酸处理1小时，并用a-淀粉酶测量试剂盒(由Kikkoman株式会社生产)测量。154.结果图19显示葡糖淀粉酶活性的测量结果，图20显示酸稳定性a-淀粉酶活性的测量结果。如在图19和20中所显示，在培养后，与其中具有相同盐浓度的2号设计中的酶生产力相比，在其中灭菌时盐浓度更高的3号设计中提高了酶20生产力。在实验实施例2中，证实了当大麦底物溶液中的无机盐浓度在热处理时变高时，来自原材料大麦的糖释放率变低。因此，说明了除了盐对曲霉生长的作用之外，酶的生产力还受到糖释放率的影响。l号设计不包含盐，因此认为曲霉的生长被抑制并且其中的酶生产力被显著抑制是由于高糖释放率。25直到最近，认为在制备培养基时加入的无机盐仅涉及培养过程中的曲霉的生长。然而，根据该实施例，说明了在曲霉的液体培养物中的酶生产也被来自原材料大麦的糖释放抑制作用所促进的可能性。工业应用性30根据本发明的方法，将培养系统中的营养物浓度控制较低，因此通过简单的分批培养获得与流加培养相等的培养模式，而无需进行其中从培养系统外逐渐加入营养物的流加培养。根据本发明，提供稳定地和廉价生产丝状真菌培养产物的方法，所述丝状真菌培养产物用于除用于生产由所述丝状真菌培养产物生产的发酵食品和饮料，酶和酶制剂之外的各种工业中。此外，预期将本发明应用于异蛋白生产，其使用淀粉分解酶基因等的启动子区。因此，本发明可应用于广泛的工业中，包括食品加工工业，发酵工业，药物工业等。权利要求1.一种通过使用包含选自由谷物，豆类，块茎，苋属植物和藜属植物组成的组的至少一种作为培养原材料的液体培养基生产丝状真菌培养产物的方法，所述方法包括，在培养丝状真菌的同时，控制营养物从所述培养原材料向培养系统中的释放率从而调节丝状真菌培养产物中的酶的生产力。2.根据权利要求1生产丝状真菌培养产物的方法，其中io所述培养原材料是其表面被完全或部分覆盖有至少外壳的谷物，禾l〕通过调节所述谷物的脱壳比率，控制营养物从谷物向所述培养系统中的释放率。3.根据权利要求1生产丝状真菌培养产物的方法，其中通过使用其外15壳或壳被去除并且没有被胶凝化的培养原材料来控制营养物从所述培养原材料向所述培养系统中的释放率。4.根据权利要求1生产丝状真菌培养产物的方法，其中将所述液体培养基进行热处理，并且通过在热处理时调节液体培养基中的无机盐浓度而控制营养物从所述培养原材料向所述培养系统中的释放率。5.根据权利要求1生产丝状真菌培养产物的方法，其中所述营养物包含来自所述培养原材料中淀粉的糖和/或来自所述培养原材料中蛋白质的氨基酸。6.根据权利要求1生产丝状真菌培养产物的方法，其中所述酶包含选自由淀粉分解酶，植物纤维降解酶和蛋白水解酶组成的组的至少一种。7.根据权利要求1生产丝状真菌培养产物的方法，其中所述丝状真菌包括选自由曲霉属，木霉属(Trichoderma)和白腐真菌组成的组的至少一种。8.—种丝状真菌培养产物，其通过根据权利要求l-7任一项的方法获得。9.一种生产酶制剂的方法，所述方法包括使用根据权利要求8的丝状真菌培养产物。10.—种酶制剂，其通过根据权利要求9的方法获得。11.一种生产酶的方法，其通过使用包含选自由谷物，豆类，块茎，苋属和藜属植物组成的组的至少一种作为培养原材料的液体培养基来进行，所述方法包括培养丝状真菌，同时控制营养物从所述培养原材料向所述培养系统的释放率从而调节所述丝状真菌培养产物中的酶的生产力。12.酶，其通过根据权利要求11的方法获得。13.生产发酵食品和饮料的方法，所述方法包括使用根据权利要求8的丝状真菌培养产物。14.生产发酵食品和饮料的方法，所述方法包括使用根据权利要求IO的酶制剂。15.生产发酵食品和饮料的方法，所述方法包括使用根据权利要求12的酶。16.发酵食品和饮料，其通过根据权利要求13-15的任一项的方法获得。全文摘要本发明的目的是提供生产真菌培养产物的方法，其通过在液体培养基中培养真菌而获得，所述液体培养基包含至少一种选自谷物，豆类，马铃薯，苋属和藜属植物的成员作为培养原材料，其中控制释放在培养材料中的营养物的比率，由此控制真菌培养物的酶(特别是，淀粉消化酶，植物纤维消化酶或蛋白水解酶)的生产力。即，生产真菌培养物的方法，特征在于包括通过使用包含选自谷物，豆类，马铃薯，苋属和藜属植物的至少一种作为培养原材料的液体培养基培养真菌，同时控制在培养原材料中营养物向培养系统中释放率，从而控制真菌培养物的酶生产力。文档编号C12N1/14GK101273120SQ20068003551公开日2008年9月24日申请日期2006年9月5日优先权日2005年10月5日发明者小路博志,杉本利和申请人:朝日啤酒株式会社