用于获得无异源物质的hBS细胞系的方法

专利名称：用于获得无异源物质的hBS细胞系的方法
技术领域：
本发明涉及获得稳定的无异源物质的(xeno-free) hBS细胞的方 法、按照所述方法获得的无异源物质的hBS细胞和其用途。
背景技术：
干细胞是具有自我更新和产生特化或分化的细胞的独特能力。尽 管身体的大多数细胞例如心脏细胞和皮肤细胞负责进行特化的功能，
的功能。使干细胞独4特的是其增殖能力和其变得特化的、能力:多年来，
研究者一直集中在发现使用干细胞替换丢失的、被破坏的或生病的细 胞和组织的方法。到目前为止，大多数研究集中在两种类型的干细胞， 胚胎干细胞和成体千细胞。胚胎干细胞来源于植入前(pre-implanted) 的受精卵，即胚泡，而成体干细胞存在于成年生物体中，例如存在于 骨髓、表皮和肠内。多能检测(Pluripotency test)已显示尽管来源 于胚胎或胚泡的干细胞(此后称为胚泡源干细胞(blastocyst-derived stem cell)或BS细胞)可在生物体中产生所有细胞，包括生殖细胞， 但成体干细胞在后代细胞类型中具有更有限的细胞库。
也许hBS细胞影响最深远的潜在应用是产生可用于所谓的细胞疗 法的细胞和组织。许多疾病或病症是由细胞功能的中断或身体组织的 破坏导致的。今天，通常将捐赠的器官和组织用于替代患病的或被破 坏的组织。不幸的是，到目前为止遭受适合于通过这些方法治疗的病 症的人数超过了可获得用于移植的器官数目。hBS细胞的可获得性和 对发展用于将这些细胞导向不同细胞命运(例如产生胰岛素的P细胞、 心肌细胞和产生多巴胺的神经元)的有效方法的深入研究保持着对将 来在变性性疾病(degenerative diseases )例如糖尿病、心肌梗塞和
帕金森氏病的基于细胞的治疗中应用的日益增加的希望。
然而，所有目前可获得的人胚泡源干细胞(hBS)系在其衍生和/或
维持期间在一些点上已被直接或间接暴露于动物材料。在患者中使用 被xeno污染的hBS细胞的一个潜在的后果是增加了移植物排斥的可能 性[Martin JM等人，2005]。此外，异源物质暴露(xeno-exposure ) 增加了在任何临床应用中转移非人病原体的风险。因此，预期的与在 患者中使用暴露于xeno的hBS细胞相关的危害使此类细胞不适合用于 临床应用。为了力图克服这些问题，几个研究小组使用无饲养者基质 (feeder-free matrices ) [Xu C等人，2001]或人来源的饲养细胞进 行hBS细胞系的衍生[Richards M等人，2002， Inzunza J等人]和 培养[Richards M等人，2003]。然而，到目前为止仍然不可能在完全 无异源物质的系统中衍生和连续培养hBS细胞系。为了获得和培养完 全无异源物质的hBS细胞，必须克服3个主要障碍。第一，必须发展 用于在无异源物质的条件下衍生新的hBS细胞系的方案。通过免疫外 科法经典地进行内细胞团(inner cell mass) (ICM)的分离，所述免 疫外科法是包括使用豚鼠血清的方法。我们已在早期报导[Heins等人， 2004]:可排除免疫外科法，从而可进行ICM细胞的分离而不暴露于动 物的组分。第二和第三，无异源物质的饲养者培养系统与无异源物质 的培养基的使用结合是必需的。因为引起xeno污染的不是基本培养 基，而是普遍使用的胎牛血清(FBS)或包含各种动物蛋白的血清潜代 物，我们决定检验hBS细胞是否可在人血清中进行长时间培养。关于 人血清用于hBS细胞培养的用途的之前报导非常少且该培养只显示短 期的培养稳定性，即少于10代[Richards等人，2002 and 2004]的稳 定性。其他人报导的使用补充人血清的培养基使hBS细胞维持在未分
化状态的困难一开始就激励本发明者寻找发展完全确定的培养条件即 无飼养者培养物和具有完全已知的组成和浓度的培养基(确定的培养
基)而不是发展使用人和合成的组分的hBS细胞培养系统。然而，本发 明者已经能够发展基于人成纤维细胞和此处描述的包含血清的培养基 的用于hBS细胞的增殖系统。hBS细胞系SA121 (按照WO2003055992
的方法建立的)现已在基于该血清的培养基中成功地培养so多代。 此外，本发明者已发展了用于衍生和培养完全无异源物质的人飼
养细胞的系统。之前已报导存在无异源物质的人饲养细胞例如人包皮
成纤维细胞，尽管在许多情况下在饲养细胞的实际建立和培养过程中
饲养细胞已与许多动物材料接触。
在本发明中报导了只使用满足调节要求的组分例如人或合成来
源的组分的用于hBS细胞的衍生和维持培养的完全无异源物质的系统 的成功开发。此处描述的方法完全避开了对动物组分的直接或间接暴 露，由此可获得完全无异源物质的hBS细胞以进一步用作用于发展细 胞疗法的不受限制的来源和其他用途(例如用于药物的发现和开发、 毒性试验)、用于药物例如抗体和疫苗的制造。
发明详述
本发明涉及用于获得无异源物质的hBS细胞系的方法，该方法包 括步骤
i) 通过无异源物质的操作从胚泡除去透明带(zona pellucida) 以获得滋养外胚层包围的内细胞团，
H) 通过无异源物质的操作至少部分地除去滋养外胚层以获得分离 的内细胞团细胞，
iii) 将内细胞团细胞置于在无异源物质的培养基中的人飼养细胞层 上，
iv) 将内细胞团细胞与人饲养细胞在无异源物质的培养基中共培养 大约5天至大约10天的时间期限，
v) 如果有的话，通过无异源物质的操作从过度生长的滋养外胚层 中释放内细胞团细胞或来源于其的细胞，
vi) 选择性地，通过将内细胞团细胞或来源于其的细胞转移至在无 异源物质的培养基中的新鲜人铜养细胞层上，以获得无异源物质的 hBS细胞，
Vii)通过与人饲养细胞在无异源物质的培养基中共培养来增殖无异
源物质的hBS细胞以获得无异源物质的hBS细胞系。
在特定的实施方案中，本发明提供了用于获得上述无异源物质的 hBS细胞系的方法，但该方法中的起始点可以是上述步骤中的任一步 骤，即，本发明的方法可包括步骤H)-步骤vii)、步骤iU)-步骤vii)、 步骤iv)-步骤vii)、步骤v)-步骤vii)、步骤vi)-步骤vii)或步骤
vii) (或下面提及的步骤viii))。
如此处所用的，术语"无异源物质的"希望表示从不直接或间接 暴露于非人动物来源的材料例如细胞、组织和/或体液以及其衍生物。
为了维持按照本发明获得的无异源物质的hBS细胞系，方法可进 一步包括步骤
viii) 通过在无异源物质的培养基中与人饲养细胞共培养和以大约 2天至大约20天，例如大约4天至大约12的合适的时间间隔使细胞 传代，从而增殖无异源物质的细胞系。
步骤vi i i)中选择的时间间隔依赖于细胞生长。 上述步骤viii)也是本发明的特殊方面。
可能想要在无伺养层培养系统中维持获得的无异源物质的hBS细 胞系，从而本发明的方法可进一步包括步骤
ix) 将无异源物质的hBS细胞系转移至无异源物质的和无飼养层培 养系统。
可按照W02004099394进行步骤ix)，所述申请通过引用合并入本文。
步骤i)
透明带是富含糖蛋白的围绕哺乳动物卵子(卵)的厚厚的细胞外 基质。可通过使用a)酸性溶液、b)重组酶例如透明质酸酶或链霉蛋白 酶(pronase)或c)机械方法从受精卵除去透明带以在步骤i)中获得 滋养外胚层包围的内细胞团。可通过显微镜下的目检来观察透明带的 降解过程。
如此处所用的，术语"滋养外胚层包围的内细胞团"旨在表示在 将受精卵经历步骤I)后获得的材料，其中通过酸性水解、酶消化或 机械方法除去透明带。
此处使用的重组酶具有相应于这些酶的人氨基酸序列的氨基酸 序列，即此处使用的重组酶具有人氨基酸序列但是是通过重组产生的。
当通过使用酸性溶液除去透明带时，将胚泡经历酸性溶液大约5 秒至大约180秒，例如大约10秒至大约120秒，大约15秒至大约90 秒，大约20秒至大约60秒，大约30秒至大约50秒。
重要地，酸性溶液的pH对于水解透明带的糖类结构足够低，即， 酸性溶液的pH为大约2至大约3，例如大约2. 5至大约2. 8,例如2. 5。 可使用任何合适的酸。在本发明的优选实施方案中，酸性溶液是具有 pH 2. 5±0. 3的酸性蒂罗德溶液(Acid Tyrodes solution) (Sigma)。
如果通过使用一种或多种重组酶除去透明带，则将胚泡接受一种 或多种重组酶的溶液。 一种或多种重组酶具有相应于这些酶的人氨基 酸序列的氨基酸序列。
合适的酶的实例是例如重组链霉蛋白酶、重组透明质酸酶和重组 胰蛋白酶。步骤(i)中合适的细胞酶消化液的另外的实例是重组的或无 异源物质的和潜在地组合蛋白水解和溶胶原活性的酶，例如 Accutase (Chemicon)和为重组的或无异源物质的、潜在地组合蛋白 水解、溶胶原和DNA酶活性的酶消化液例如Accumax (Innovative Cell Technologies),
下面给出合适的浓度和处理时间
链霉蛋白酶10 U/ml，进行大约2至大约20分钟，例如大约2 至大约10分钟，大约2至大约5分钟或大约3至4分钟(最佳)的时 间期限。
透明质酸酶70. 000 U/ml，进行大约2至大约240分钟的时间 期限。
人重组胰蛋白酶5-10. 000 U，进行大约0. 5至大约30分钟的 时间期限。
还可通过机械方法除去透明带，其中例如在借助于显微镜的目检 下使用玻璃毛细管。
步骤ii)
在除去透明带后，将胚泡的剩余部分即滋养外胚层包围的内细胞
团经历步骤ii)以至少部分地除去滋养外胚层。可选择地，可将自发 孵育的胚泡直接经历步骤ii),从而略过步骤i)。
可通过使用a)酸性溶液、b)—种或多种重组酶或c)机械方法进 行步骤ii)。
当通过使用酸性溶液进行步骤ii)时，将在步骤i)中获得的滋养 外胚层包围的内细胞团经历酸性溶液，进行大约5秒至大约180秒， 例如大约IO秒至大约120秒，大约15秒至大约90秒，大约20秒至 大约60秒，大约30秒至大约50秒。
重要地，酸性溶液的pH对于水解滋养外胚层的蛋白质性质结构 足够低，即酸性溶液的pH为大约2至大约3，例如大约2. 5至大约2. 8， 例如2.5。可使用任何合适的酸。在本发明的优选实施方案中，酸性 溶液是pH 2. 5±0. 3的酸性蒂罗德溶液(Sigma)。
如果通过使用一种或多种重组酶至少部分地除去滋养外胚层，将 滋养外胚层包围的内细胞团经历一种或多种重组酶的溶液。 一种或多 种重组酶是具有相应于这些酶的人氨基酸序列的氨基酸序列的重组
酵o
合适的酶是重组蛋白水解酶，例如丝氨酸蛋白酶，包括重组胰蛋
白酶和TrypLE Select,如果使用TrypLE Select,通常通过将步 骤i)中获得的滋养外胚层包围的内细胞团经历未稀释的即用浓度的 TrypLE Select,进行大约0. 5至10分钟，例如大约0.5至大约8 分钟，大约0.5至大约5分钟，大约1至大约3分钟，例如l. 5分钟 来进行步骤ii)。如果使用重组胰蛋白酶，通常通过将步骤i)中获得 的滋养外胚层包围的内细胞团经历大约5. OOOU至大约IO.OOOU的重 组胰蛋白酶，进行大约0. 5分钟至大约30分钟来进行步骤ii)。
步骤(ii)中合适的细胞酶消化液的另外的实例是重组的或无异
源物质的、潜在地组合蛋白水解和溶胶原活性的酶，例如Accutase (Chemicon)和为重组的或无异源物质的、潜在地组合蛋白水解酶、溶 胶原蛋白酶和DNA酶活性的酶消化液例如AccumaxTM (Innovative Cell Technologies)。
还可通过机械方法至少部分地除去滋养外胚层，其中可通过使用 玻璃毛细管作为切削工具进行所述方法。使用显微镜可视地容易地进 行内细胞团细胞的检测。
步骤iii)
在步骤iii)中，通常通过在显微镜下使用玻璃毛细管将步骤ii) 后所得的材料置于人滋养层上。此外，如果需要，可将人滋养层装入 合适的培养皿例如PR頂ARIAS塑料培养皿中。如果需要，可用合适的 基质材料涂铺培养皿的培养表面，只要该基质材料是无异源物质的。 适合用于该背景的材料包括重组人明胶。
步骤iv)
在本发明的方法的步骤iv)中，将内细胞团细胞共培养大约5天 至大约50天，例如大约5天至大约30天，大约5天至大约20天或大 约5天至大约15天的时间期限，从而扩增细胞群体。在本发明的一个 实施方案中，将内细胞团细胞在步骤iv)中共培养10天的时间期限。
可在步骤iv)中在内细胞团细胞的共培养期间通过更换大约20% 至大约100%例如大约30%至大约80%,大约40%至大约60%的培养基来 进行一次或更多次培养基的更换。在本发明的一个实施方案中，在步 骤iv)中在内细胞团细胞的共培养期间通过更换大约50%的培养基来 进行一次或更多次培养基的更换。可以以大约2天至大约14天，例如 大约4天至大约7天的时间间隔进行一次或更多次培养基的更换。
因为当在步骤iii)中放置内细胞团细胞时可能已将残留滋养外 胚层细胞置于人飼养细胞层上，因此可定期进行使用显微镜的目检，
以看滋养外胚层是否干扰内细胞团细胞或内细胞团来源的细胞的生 长。将细胞带入步骤V)的合适的时间点是通过显微镜下的检查，在数 天的时间内已观察到大量生长的时候。
在内细胞团细胞在步骤iv)中进行增殖的过程中，这些细胞中的 一些可能开始它们至胚泡源干(BS)细胞的转化。因此，步骤iv)中 获得的细胞群体可包括内细胞团细胞以及其衍生的细胞即BS细胞。
步骤v)和vi)
如上面所提及的，内细胞团细胞和来源于其的细胞可被残留的滋 养外胚层污染。如果情况是这样，那么滋养外胚层倾向于包围内细胞 团体细胞和其来源的细胞。可通过使用a)机械方法或b) —种或多种 重组酶从该过度生长的滋养外胚层中释放内细胞团细胞或来源于其的 细胞。
合适的机械方法是使用玻璃毛细管作为切削工具。基于显微镜下 的目检选择性地切出细胞团'细胞或来源于其的细胞，然后将其转移至
hBS细胞(步骤vi)。
可选择地，可在步骤v)中通过使用一种或多种重组酶(例如，一 种或多种重组蛋白水解酶，包括重组胰蛋白酶和TrypLETM Select)从 过度生长的滋养外胚层(如果有的话)中释放内细胞团细胞或来源于 其的细胞。如果在步骤v)中使用重組胰蛋白酶释放内细胞团细胞或来 源于其的细胞，通常将内细胞团细胞或来源于其的细胞与大约5. 000 U 至大约10.000 U的胰蛋白酶温育大约0. 5分钟至大约30分钟。如使 用TrypLE Select在步骤v)中释放内细胞团细胞或来源于其的细胞， 通常将内细胞团细胞或来源于其的细胞与未稀释的即用浓度的 TrypLE Select —起温育大约5至大约15分钟。
步骤(v)和(vi)中合适的细胞酶消化液(cell enzymatic solution)的另外的实例是重组的或无异源物质的、潜在地组合蛋白 K解和溶胶原活性的酶例如Accutase (Chemicon)和为重组的或无异
源物质的潜在地组合蛋白水解、溶胶原和DNA酶活性的酶消化液例如 Accumax (Innovative Cell Technologies)。
在已从滋养外胚层(如果有的话)中释放内细胞团细胞或来源于 其的细胞后，基于显微镜下的目检选择内细胞团细胞或来源于其的细 胞，然后将其转移至无异源物质的培养中的新鲜人祠养细胞层以获得 无异源物质的hBS细胞(步骤vi)。
步骤vii)
在步骤vii)中，通过与人铜养细胞共培养来增殖无异源物质的 hBS细胞，从而获得无异源物质的hBS细胞系。在步骤vii)中在无异 源物质的hBS的增殖期间可进行一代或更多代传代，其中根据显微镜 下的目检选择性传代hBS细胞。可使用玻璃毛细管作为切削工具来进 行这些传代。可选择地，可使用一种或多种重组酶例如TrypLE Select、重组胰蛋白酶和/或重组胶原酶在步骤vii)中进行一代或更 多代传代。
如果使用TrypLE Select,通常通过使用未稀释的即用浓度的 TrypLE Select进行大约0. 5分钟至大约15分钟来进行步骤vii)。
如果使用重组胰蛋白酶，通常通过使用大约5.000 U至大约 10. 000 U的重组胰蛋白酶进行大约0. 5分钟至大约30分钟来进行步 骤vii)。
如果使用重组胶原酶，通常通过使用大约200 U/ml的重组胶原 酶进行大约1分钟至大约40分钟来进行步骤vii)。
步骤(vii)中合适的细胞酶消化液的另外的实例是重组的或无异 源物质的且潜在地组合蛋白水解和溶胶原活性的酶例如Accutase (Chemicon)和为重组的或无异源物质的且潜在地组合蛋白水解活性、 溶胶原活性和DM酶活性的酶消化液例如Accumax (Innovative Cell Technologies)。
用于个体传代的培养基可以相同或可以不同。
步骤viii)
无异源物质的hBS细胞系的增殖与步骤vii)中描述的增殖一致。 在本发明的一个实施方案中，可通过机械分割例如使用玻璃毛细 管作为切削工具来进行步骤viii)中的细胞传代。可选择地，可通过 使用一种或多种重组酶例如TrypLE Select、重组胰蛋白酶和/或重 组胶原酶来进行步骤viii)中的细胞传代。使用TrypLE Select、重 组胰蛋白酶和重组胶原酶的浓度和温育时间分别与对于步骤vi i)所 描述的一样。
步骤(viii)中的合适的细胞酶消化液的另外的实例是重组的或
无异源物质的且潜在地组合蛋白水解活性和溶胶原活性的酶例如 Accutase (Chemicon)和为重组的或无异源物质的且潜在地组合蛋白 水解活性、溶胶原活性和DNA酶活性的酶消化液例如Accumax (Innovative Cell Technologies)。
步骤ix)
在本发明的特定实施方案中，在步骤iX)中将获得的hBS细胞系 转移至无异源物质的、无伺养者的培养系统中，所述培养系统包含合 适的无异源物质的支持基质例如重组人明胶、重组人纤连蛋白、人胎 盘细胞外基质和合适的无异源物质的培养基，所述无异源物质的培养 基可以与用于hBS细胞系的建立(步骤iii)、 iv)、 vi)、 vii))或用于 在人饲养细胞上的维持(步骤viii))的无异源物质的培养基相同或不 同。为了维持hBS细胞系的未分化的生长，可使用人飼养细胞条件化 无异源物质的培养基或可用合适的因子例如高浓度的重組bFGF和/或 WNT途径的激活剂补充该培养基。
人飼养者的制备 '
在无异源物质的条件下获得步骤iii)、 vi)、 vii)和viii)中的 任一步骤中使用的人铜养细胞。人饲养细胞来源于健康人组织和可通 过活体组织检查获得。
可从其产生人飼养细胞的人组织包括胚胎、胎儿、新生儿、青少 年或成人的组织，其还包括来源于皮肤包括包皮、脐带、肌肉、肺、
上皮、胎盘、输卵管、腺(glandula)、基质或乳腺的组织。人饲养 细胞可来源于与人成纤维细胞、纤维细胞(fibrocyte)、肌细胞、角 质细胞、内皮细胞和上皮细胞相关的细胞类型。可用于产生人饲养细 胞的特定细胞类型的实例包括胚胎成纤维细胞、胚外内胚层细胞、胚 外中胚层细胞、胎儿成纤维细胞和/或纤维细胞、胎儿肌细胞、胎儿皮 肤细胞、胎儿肺细胞、胎儿内皮细胞、胎儿上皮细胞、脐带间充质细 胞(umbilical chord mesenchymal cell)、月台盘成纤维细胞和/或 纤维细胞、胎盘内皮细胞、出生后人包皮成纤维细胞和/或纤维细胞、 出生后肌细胞、出生后皮肤细胞、出生后内皮细胞、成人皮肤成纤维 细胞和/或纤维细胞、成人肌细胞、成人输卵管内皮细胞、成人子宫内 膜腺细胞(adult glandular endometrial cell)、成人子宫内膜基 质细胞(adult stromal endometrial cells)、成人乳腺癌实质细 胞、成人内皮细胞、成人上皮细胞或成人角质细胞。
可永生化或基因改造用于本发明的祠养细胞。饲养细胞的永生化 意指在培养中生长通过理论上无限的分裂次数的能力的获得。存在用 于进行永生化的几种方法， 一个方法是用例如病毒、逆转录病毒转化 细胞和/或通过端粒酶逆转录酶蛋白(TERT )的表达来实现永生化。TERT 在大多数细胞中是无活性的，但当外源性表达hTERT时，细胞能够保 持足以避免复制性衰老的端粒长度。
此外，可对飼养细胞进行基因改造，将特定的基因整合入基因组。 这些基因可编码目的标记或用于已知对hBS细胞有益的生物分子例如 生长因子(例如bFGF (基本的成纤维细胞生长因子)的合成。
当人饲养细胞来源于hBS细胞时，来源于hBS细胞的细胞可以是 成纤维细胞。
在本发明的一个实施方案中，人飼养细胞来源于新生儿人包皮。 在本发明的特定实施方案中，人饲养细胞是成纤维细胞，优选来 源于人新生儿包皮成纤维细胞。
可从环切的男婴得人包皮样品。可在无菌的合适的培养基中例如
在包含2X庆大霉素(Invitrogen)的无菌IMDM培养基中无菌地选择样 品。将皮肤外植体置于组织培养瓶例如25cm2的心包膜(primaria) 组织培养瓶(Becton Dickinson)中，该培养瓶装有IMDM培养基 (Invitrogen) 、 "/o青霉素-链霉素(Gibco Invitrogen Corporation) 和1(^的人血清(Tallheden等人，2005)。在大约10天后，汇合的单 层建立。使用TrypLE Select (Invi trogen)连续传代细胞。本发明 者已发现各个传代之间的合适的时间期限是大约2至大约20天，通常 至少15次传代是合适的例如最大20次传代。在扩增后，就人病原体 的名单(包括支原体、1型和2型HIV、乙型肝炎和丙型肝炎、巨细胞 病毒、1型和2型单纯疱渗病毒、Epstein-Barr病毒和人乳头瘤病毒) 对它们进行检测。
无异源物质的培养基
培养基可以是适合用于人内细胞团细胞增殖的任何基本培养基。 一种合适的培养基是补充有1-30% v/v的人血清和2-100 ng/ml的重 组bFGF的Dulbecco， s Modified Eagle， s培养基(DMEM)。在一个 实施方案中，基本培养基包含20 U/v的人血清。在另一个实施方案 中，基本培养基包含10ng/ml的重组bFGF。可使用其他基本培养基， 只要它们以液体形式为内鈿胞团细胞基质提供营养成分(即无机成分 例如微量元素和有机成分例如氨基酸、盐、维生素、能量供应者、碳 水化合物包括糖等)。重要地，培养基是无异源物质的。
用于步骤iii)、 iv)、 vi)、 vii)和/或viii)中任一步骤的无异 源物质的培养基包含适合用于人内细胞团细胞的增殖的基本培养基。 一种合适的基本培养基是Dulbecco， s Modified Eagle， s培养基 (DMEM)。然而，其他基本培养基也同样可以工作。除了无异源物质的 基本培养基外，无异源物质的培养基可进一步包含人血清、重组bFGF、 L-谷氨酰胺或glutamax、非必需氨基酸、p-巯基乙醇、青霉素和/或 链霉素。
无异源物质的培养基中人血清的浓度优选是大约1% v/v至大约 30% v/v的人血清，例如大约10% v/v至大约30% v/v的人血清，大 约15% v/v至大约25。/。 v/v的人血清，和更优选20°/。 v/v的人血清。
无异源物质的培养基中重组bFGF的浓度优选是大约2 ng/ml至 大约100 ng/ml的重组bFGF，例如大约5 ng/ml至大约50 ng/ml的 重组bFGF，大约5ng/ml至大约25ng/ml的重组bFGF,大约5 ng/ml 至大约15 ng/ml的重组bFGF，例如10 ng/ml的重组bFGF。
无异源物质的培养基中卜谷氨酰胺或011^&1^《 的浓度优选是大 约0. 5 mM至大约20 mM，例如大约0. 75 mM至大约10 mM，大约1 mM 至大约5 mM例如2 mM。
无异源物质的培养基中非必需氨基酸的浓度优选是大约0.01 mM 至大约1 mM，例如大约0， 03 mM至大约0. 8 mM，大约0. 05 mM至大约 0. 6 mM，大约0. 07 mM至大约0. 4 mM，大约0. 09 mM至大约0. 2 mM， 例如0. 1 mM。
无异源物质的培养基中p-巯基乙醇的浓度优选是大约10 pM至大 约200 例如大约25 nM至大约175 ^M，大约50 pM至大约150 pM， 大约75 pM至大约125 pM，例如100 pM。
无异源物质的培养基中青霉素的浓度优选是大约5个单位/ml至 大约200个单位/ml ，例如大约10个单位/ml至大约150个单位/ml ， 大约25个单位/ml至大约100个单位/ml，例如大约25个单位/ml至 大约75个单位/ml，例如50个单位/ml。
无异源物质的培养基中链霉素的浓度优选是大约5 pg/ml至大约 200 pg/ml，例如大约10ng/ml至大约150 pg/ml,大约25 ng/迈l 至大约100 |ig/ml，大约25 pg/ml至大约75 pg/ml，例如50 pg/ml。
同样其他无异源物质的培养基也可用于本发明的一个或更多个 单个步骤，例如用于增殖步骤(vii)和(viii)。该培养基可包含盐、维 生素、能量来源(例如葡萄糖)、矿物质(mineral)和氨基酸。向培 养基中加入的合适的生长因子可以是例如GABA、哌啶酸、氯化锂和转 化生长因子P (TGFp)和bFGF。此外，可化学限定该培养基。因此，
可在除了包含血清的培养基外的培养基中传代或增殖本发明中衍生的
无异源物质的hBS细胞系。 人血清的制备
在我们的实验室中反复生产质量良好的人血清(Tallheden等人, 2005)。在医院的血液中心就许多标准的病原体(乙型肝炎、丙型肝炎、 HIV、 HTLV和梅毒)检测血液。
因此，通过下列步骤制备步骤iii)、 iv)、 vi)、 vii)和viii)中 的任一步骤中使用的人血清
a) 在未涂铺肝素的袋子中收集健康人血液，
b) 摇动所述未涂铺肝素的袋子，进行大约0. 5小时至大约5小时，例 如大约0. 5小时至大约2小时的时间期限，
c) 在至多5"C的温度下温育未涂铺肝素的袋子，进行至少10小时的 时间期限
d) 任选地，基于凝固质量例如未凝固血纤蛋白(non-clotted fibrin)的不存在、液相的不透明度的选择
e) 将血清与凝固的材料分离
f) 无菌过滤步骤d)中获得的血清
g) 汇集来自至少15个供者的血清
h) 使用前冷冻血清。
在本发明的特定的实施方案中，用于获得无异源物质的hBS细胞 系的方法包括步骤
1) 通过在室温下用酸性蒂罗德溶液温育胚泡大约10秒至大约10 分钟，优选大约30秒至大约60秒的时间期限从胚泡除去透明带和至 少部分滋养外胚层，从而获得分离的内细胞团细胞，
2) 将内细胞团细胞置于在包含DMEM、人血清、重组bFGF、 L-谷氨 酰胺或glutamax、非必需氨基酸、p-巯基乙醇、青霉素和链霉素的无 异源物质的培养基中的人包皮成纤维细胞饲养细胞层上
3) 在无异源物质的培养基中将内细胞团细胞与人包皮成纤维细胞
饲养细胞共培养大约5天至大约15天的时间期限，其中每3至5天更 换至少50。/。的无异源物质的培养基。
4) 如果有的话，通过使用TrypLE Select (Invitrogen)作为酶处
理从过度生长的滋养外胚层中释放内细胞团细胞或来源于其的细胞，
5) 选择性地，通过将内细胞团细胞或来源于其的细胞转移至在无
源物质的hBS细胞，
6) 通过在无异源物质的培养基中与人包皮成纤维细胞伺养细胞共 培养来增殖无异源物质的hBS细胞，从而获得无异源物质的hBS细胞系。
在特定的实施方案中，本发明提供了获得上述无异源物质的hBS 细胞系的方法，但方法中的起始点可以是上述步骤中的任一步骤，即， 本发明的方法可包括步骤2)至步骤6)、步骤3)至步骤6)、步骤4)至 步骤6)、步骤5)至步骤6)或步骤6)(或步骤7 (如下面提及的))。
可通过如下进一步的步骤进行步骤6 )中获得的无异源物质的hBS 细胞系的维持，即
7) 通过在无异源物质的培养基中与人包皮成纤维细胞饲养细胞共 培养，每3至5天更换至少50%的无异源物质的培养基和以适当的时 间间隔，例如每3至8天对细胞进行传代来增殖无异源物质的hBS细 胞系。
可通过显微镜下的目检在步骤l)中进行透明带的去除。
关于单个组分在上述无异源物质的培养基中的优选浓度的详情 和细节，参照步骤2)、 3)， 5)、 6)和7)中使用的无异源物质的培养基。
在步骤3)中，可以定期进行目检以看滋养外胚层是否干扰内细胞 团细胞或来源于其的细胞的生长。
在本发明的一个实施方案中，通过根据显微镜下的目检使用玻璃 毛细管作为切削工具在步骤5)中选择性转移内细胞团细胞或来源于 其的细胞。
适合用于步骤7)中的无异源物质的hBS细胞系的增殖的传代间
隔依赖于细胞的生长，且传代通过使用玻璃毛细管进行人工转移来进 行。
其他方面
在下面描述的本发明的其他方面，应当参照应用在上面的主要方 面下讨论的详情和细节。
本发明的另 一个方面涉及用于获得无异源物质的hBS细胞系的方 法，其包括步骤
i) 通过无异源物质的操作至少部分地从不具有透明带的胚泡除去 滋养外胚层以获得分离的内细胞团细胞，
ii) 将内细胞团细胞置于在无异源物质的培养基中的人饲养细胞层 上，
iii) 在无异源物质的培养基中将内细胞团细胞与人飼养细胞共培 养，进行大约5天至大约50天的时间期限，
iv) 如果有的话，通过无异源物质的操作从过度生长的滋养外胚层 中释放内细胞团细胞或来源于其的细胞，
v) 选择性地，通过将内细胞团细胞或来源于其的细胞转移至在无 异源物质的培养基中的新鲜人祠养细胞层上，以获得无异源物质的 hBS细胞，
vi) 通过在无异源物质的培养基中与人饲养细胞共培养来增殖无异 源物质的hBS细胞以获得无异源物质的hBS细胞系.
本发明的另一个方面涉及用于获得无异源物质的hBS细胞的方 法，其包括步骤
i) 将至少部分不含滋养外胚层的内细胞团细胞置于在无异源物质 的培养基中的人饲养细胞层上，
ii) 将内细胞层细胞与人饲养细胞在无异源物质的培养基中共培 养，进行大约5天至大约50天的时间期限，
iii) 如果有的话，通过无异源物质的操作从过度生长的滋养外胚层
中释放内细胞团细胞或来源于其的细胞，
iv) 选择性地，通过将内细胞团细胞或来源于其的细胞转移至在无 异源物质的培养基中的新鲜人饲养细胞上以获得无异源物质的hBS细 胞，
v) 通过在无异源物质的培养基中与人饲养细胞共培养来增殖无异 源物质的hBS，以获得无异源物质的hBS细胞系。
本发明的另一个方面涉及用于获得无异源物质的hBS细胞系的方 法，其包括步骤
i) 将至少部分不含滋养外胚层的内细胞团细胞与人饲养细胞在无 异源物质的中共培养，进4亍大约5天至大约50天的时间期限，
ii) 如果有的话，通过无异源物质的操作从过度生长的滋养外胚层 中释放内细胞团细胞或来源于其的细胞，
iii) 选择性地，通过将内细胞团细胞或来源于其的细胞转移至在无 异源物质的培养基中的新鲜人饲养细胞层上，以获得无异源物质的 hBS细胞，
iv) 通过在无异源物质的培养基中与人饲养细胞共培养来增殖无异 源物质的hBS细胞以获得无异源物质的hBS细胞系。
本发明还涉及不依赖于用于获得所述无异源物质的hBS细胞系 的方法的无异源物质的hBS细胞系的增殖和维持培养。基于人血清的 培养基和此处描述的人饲养细胞可作必要改变以适应增殖方法。更详 细内容在步骤vii)和viii)下呈现于本说明书中。
无异源物质的hBS细胞系的表征
本发明还涉及通过本发明的方法获得的无异源物质的hBS细胞 系。未将此类细胞无异源物质的hBS细胞直接或间接暴露于任何非人 动物材料，意指在方法的所有步骤中的所有组分未暴露于任何非人动 物材料，例如任何来源于非人哺乳动物的材料。因此，已在对任何非 人动物材料没有任何暴露的情况下衍生根据本发明使用的人飼养细 胞。无异源物质的hBS细胞系的建立和维持期间使用的任何有机材料
是人来源的或是合成的、半合成的或重组的材料。
本发明的无异源物质的hBS细胞系在适当的时间期限内保持自我 更新和多能性，因此在适当的时间期限内其是稳定的。在本说明书中， 术语"稳定的"旨在表示当在本发明的人饲养细胞层上生长时，超过 50周，例如超过40周，超过30周，超过20周，超过15周在未分化 的状态中增殖的能力。因此本发明的无异源物质的hBS细胞系在理论 上是永生的。
通过根据本发明的方法获得的无异源物质的hBS细胞系可用于分 化细胞的制备。因此本发明还涉及此类分化的细胞。
此外，本发明的无异源物质的hBS细胞或细胞系能够经历冷冻和 融解。在特定的实施方案中，可按照之前由Cellartis在W02004098285 (其通过引用合并入本文)提供的玻璃化方法冷冻和融解本发明中获 得的无异源物质的hBS细胞系。
为了增加hBS细胞培养物的均一性，可将本发明中获得的细胞经 历W02005059116 (其通过引用合并入本文)中描述的克隆衍生。
通过本发明获得的无异源物质的hBS细胞系满足了一般要求。细 胞系具有下列特征中的一个或多个特征，特别地具有下列特征中的至 少4、 5、 6、 7或8个特征。因此，该细胞系
i) 当在有丝分裂灭活的饲养细胞(mitotically inactivated feeder cell)上生长时，展示超过15周的在未分化状态中增殖的能 力，和/或
ii) 展示正常的整倍体染色体核型，和/或
iii) 在培养期间展示稳定的染色体核型和/或
i v)保持在体外和体内发展成所有类型的胚层的衍生物的潜能， 和/或
v)展示下列分子标记0CT-4、碱性砩酸酶、糖类表位 (carbohydrate epitope) SSEA-3、 SSEA-4、 TRA 1-60、 TRA 1-81和 由单克隆抗体GCTM-2识别的硫酸角质素/硫酸软骨素细胞外周基质蛋 白聚糖(proteinglycan)的蛋白核心中的至少两个分子标记，和/或
vi) 不展示分子标记SSEA-1或其他分化标记，和/或
vii) 保持其多能性和当注射入免疫受损的老鼠时在体内形成畸 胎瘤，和/或
viii) 能够分化。
本发明的无异源物质的hBS细胞系展示下列标准对于0ct-4、 TRA-l-60、 TRA-1-81、 SSEA-3和SSEA-4为阳性反应和对于SSEA-1为 阴性反应中的至少l个，例如至少2个、至少3个、至少4个、至少 5个、或至少6个标准。
在下面，描述了用于就分化阶段、多能性和核型表征无异源物质 的hBS的方法。此类方法可用于调查根据本发明获得的hBS细胞是否 满足上述标准。
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可就未分化细胞的免疫组织化学标记Oct-4、 TRA-l-60、 TRA-1-81、 SSEA-1、 SSEA-3和SSEA-4分析无异源物质的hBS细胞系 以监控其分化状态。
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碱性磷酸酶和端粒酶活性通常被当作未分化hBS细胞的标记。可 通过现有的任何商购试剂盒测量活性。
体外多能性
可通过让集落在培养亚中自发分化而进行大约3至4周的培养来 检测无异源物质的hBS细胞系的多能性，每2至7天更换一次培养基。 为了鉴定来自3个不同胚层的细胞，使用免疫组织化学分析集落。合 适的抗体可以是针对外胚层的P微管蛋白、针对中胚层的ASMA (oc平 滑肌肌动蛋白)和针对内胚层的HNF3p (肝nucleofactor 3P)。
体内多能性—畸胎瘤
分析人BS细胞系是否保持多能性的一个方法是将细胞异种移植 至免疫缺陷小鼠以获得肿瘤、畸胎瘤。肿瘤中发现的不同类型的组织 应当代表所有3个胚层。
可将重度组合性免疫缺陷(SCID)-小鼠(缺乏B淋巴细胞和T淋 巴细胞的品系)用于畸胎瘤形成的分析。可通过手术将人BS细胞置于 睾丸中或置于肾囊下。在睾丸或肾中，可以在10 000-100 OOO个细胞 的范围内移植BS细胞。在大约l个月后，通常可触摸到肿瘤。然后在 l至4个月后杀死小鼠，切割肿瘤，将其固定以用于石蜡或冷冻切片 分析。然后通过免疫组织化学方法分析肿瘤组织。可使用针对所有3 个胚层的特异性标记。
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使用胰蛋白酶-吉姆萨或DAPI染色显现受试无异源物质的hBS细 胞系的染色体。对于荧光原位杂交(FISH)分析，可按照具有稍许改进 的厂商说明书使用包含染色体12、 13、 17、 18、 20、 21和性染色体(X 和Y)的探针的商购可获得的试剂盒。在配备合适的滤光片和软件的倒 置显微镜中进一步分析载玻片。
可就其端粒酶活性进一步表征干细胞和胚泡源干细胞，其中可使 用例如称为Telomerase PCR ELISA试剂盒(Roche)的试剂盒检测所述 端粒酶的活性。试剂盒通过使用聚合酶链式反应(PCR)进行产物的扩
同样可通过QPCR测量端粒酶的活性,
基因表征QPCR
可通过针对特定基因的QPCR进一步检测本发明中的细胞的分化 状态。在下面，简要地描述如何进行该检测可以以完整集落的形式 机械地从培养亚分离未分化的或分化的hBS细胞集落，用PBS洗涤， 然后在-80° C下贮存。可按照厂商说明书使用例如Qiagen RNeasy Mini试剂盒进一步提取RAN,从而使用合适的试剂盒例如Rotorgene
3000 (Corbett Research)中的 Bio-Rad iScript First Strand Synthes i s试剂盒(按照厂商说明书)进行反转录和在合适的条件下进 行QPCR。如果可能，可在相同的反应中定量所有基因和可通过计算基 于基因标记的个体样品的量化指数(mathematical indices)比较几 个样品的分化状态。(更详细的方案描述于W02006094798)。
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此处用于本发明的个体组分，例如饲养细胞、血清、和胚泡可在 使用前，以及在无异源物质的hBS细胞系一建立后立即就人病原体对 其进行检测，所述人病原体是例如支原体、1型和2型人免疫缺陷病 毒、乙型肝炎和丙型肝炎、巨细胞病毒、1型和2型单纯疱渗病毒、 Epstein-Barr病毒和人乳头瘤病毒。
人病原体的不存在对于无异源物质的hBS细胞系和细胞或来源于 细胞系的其他生物学材料的任何临床应用当然是非常重要的。
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可就唾液酸Neu5Gc (其为膜结合糖分子)进一步检测根据本发明 产生的无异源物质的hBS细胞。该检测的阴性结果可视为没有发生对 非人动物材料的直接或间接暴露。
本发明的无异源物质的hBS细胞或细胞系的用途 本发明的无异源物质的hBS细胞系可用于其分化的衍生物例如所 有3个胚层的祖细胞和进一步分化的细胞的制备，所述进一步分化的 细胞展示不同的分化的细胞类型的特征，例如肝细胞样特征、心肌细 胞样特征、神经元样特征。
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本发明的无异源物质的hBS细胞系可进一步用于GMP生产，例 如hBS细胞和/或其分化的细胞的临床GMP生产。此外，可在GMP和/
或cGMP条件下进行此处描述的用于无异源物质的衍生的方法，以提供 可临床应用的细胞系和衍生物(Martin等人Nat. Med 2005).
屋賴途
本发明的无异源物质的hBS细胞或其分化的衍生物可用于医学 中。例如无异源物质的hBS细胞系或其分化的衍生物可用于医药产品 的制造，所述医药产品用于预防和/或治疗由组织变性(tissue degeneration)引起的病理学状况和/或疾病。此外，无异源物质的 hBS细胞或其分化的衍生物可用于医药产品的制造，所述医药产品用 于治疗和/或预防代谢病理学状况和/或疾病。
通过本发明的方法获得的hBS细胞可用于药物的制造，所述药物 用于将无异源物质的hBS细胞移植入哺乳动物中以预防或治疗疾病。 特定的方面是在自体移植中使用无异源物质的hBS细胞，即只有来自 所述的特定患者的人材料用于无异源物质的hBS细胞或细胞系的制备。
可设想许多不同种类的疾病，其中本发明的无异源物质的细胞或 细胞系可适合用于包括肝病、心血管疾病(包括心肌梗塞)、变性性 疾病(例如神经变性疾病，包括帕金森氏症和阿尔茨海默氏病)、糖 尿病的疾病。
这样的药物可包含分散在药学上可接受的媒介物例如水性媒介 物中的未分化的无异源物质的hBS细胞或分化的无异源物质的hBS细 胞。媒介物可包含一种或多种选自pH调节剂、稳定剂、防腐剂、渗透 压调节剂和生理可接受的盐的添加剂；和/或一种或多种选自治疗性活 性物质、预防性活性物质、移植物移入促进剂(engraftment improving agent)、活力增进剂(viability improving agent)、分化促进剂 (differentiation improving agent)和免疫抑制剂的试剂。
存J^逸夢^勿應；^法f W6^5"erflti76 /z/edic/fle 3/7d ce//归因于其分化成完全分化的组织细胞类型和/或祖细胞类型的多 潜能性和能力(向特定组织类型进行增殖的细胞类型)，通过此处提供 的无异源物质的方法产生的细胞可证明在再生医学中是极其有用的。 在沿某条朝向例如多能心脏祖细胞的生物学途径使细胞分化后，可想 象心脏相关疾病的治疗，或例如在使细胞朝向肝祖细胞分化(如例如
WO2006034873中提出的)后，可想象肝相关疾病的治疗，或在使细胞 朝向神经祖细胞分化后，可想象神经疾病例如多发性硬化、低氧损伤 (hypoxic injury )、局部缺血损伤、夕卜伤性损伤(traumatic injury )、 中白金森氏病和號勒'脱失疾病(demyelition disorder)的治疗。
来源于如此处所述获得的无异源物质的hBS细胞系的另外的祖细 胞类型可以是中胚层的细胞(具有产生除了心脏细胞类型外还产生骨 和软骨的潜能)，或可以是内胚层的细胞(具有还产生胰脏细胞类型 例如P细胞的潜能)。
为了在已遭受心脏梗塞(cardiac infarction)的心脏中恢复功 能，必需替换心肌细胞和新血管。当可获得临床顺从性hBS细胞系(例 如按照此处提供的方法产生的hBS细胞系)时，可能使用此类细胞衍 生随后可被移植和就在人中的潜在用途进行评估的祖细胞。此类祖细 胞可具有进一步原位分化成变性组织，例如心脏梗塞的部位的细胞类 型的潜能。
从无异源物质的hBS细胞系分化的细胞可另外用于治疗与例如坏 死、细胞凋亡、损伤、功能失调(dysfunctional)或形态学异常的心 肌相关的病症。此类病症包括，但不限于，缺血性心脏病、心脏梗塞、 风湿性心脏病、心内膜炎、自身免疫心脏病、瓣膜性心脏病、先天性 心脏病、心律失调和心机能不全(cardiac insufficiency)。因而此 类能够增殖和具有分化成心脏细胞类型(包括心肌细胞、内皮细胞和 平滑肌细胞)的潜能的分化的细胞可适合用于通过逆转、抑制或预防 由心肌梗塞导致的局部缺血引起的心肌损害来治疗大部分心脏病症和 疾病。
在其他方面，细胞分化自此处提供的无异源物质的细胞分化且可
用于治疗特征在于异常心律的心脏病症，例如心律失常。
优选通过对受试者的心脏施用(优选通过注射入心脏)治疗有效 剂量的细胞来进行治疗。治疗有效剂量是足以产生有益的或想要的临 床结果的量，可以以1次或更多次施用来施用该剂量。依赖于需要修 复的心脏组织类型，可对心脏的不同区域施用注射。可在打开胸腔或 通过任何合适的血管进入后使用基于导管的方法进行施用。细胞的有 效剂量可基于如下因素，例如体重、年龄、生理状况、医疗史、梗塞 面积和局部缺血发生后的流逝时间。细胞的施用包括优选在该施用之 前用免疫抑制方案治疗受试者，以抑制该排斥。
通过本发明的方法获得的无异源物质的hBS细胞系或其分化的衍 生物也可用于医学研究，因为它们非常适合用于研究人疾病例如人变 性性疾病的体外模型。
在例如制药工业中的药物发现和药物开发中以及在所有种类的 化学医药产品的毒性测试中发现无异源物质的hBS细胞本身和从其衍 生的细胞系和细胞群体的潜在应用。今天，药物候选物的大规模和高 通量筛选通常依赖于提供关于化合物结合亲和力和特异性的信息但极 少或不提供关于功能的信息的生物化学测定法。功能性筛选依赖于基 于细胞的筛选且通常使用临床关联性较弱的生物，例如可以以高容量 而经济和快速地产生的细菌或酵母。连续轮的筛选使用临床关联性更 大的模型物种，但这些物种更昂贵且筛选过程非耗费时。存在基于人 原代细胞或永生化的细胞类型,的筛选工具，但这些细胞由于因体外培 养和转化而丢失生命机能的原因在供给或有用性上受到限制。对在设 计的条件下分化的无异源物质的hBS细胞和hBS细胞的获得提供了进 行具有高容量但不削弱临床关联性的基于人细胞的测定的新的和独特 的能力。
通过将高容量与改进的临床意义结合可将无异源物质的hBS细胞 用于高通量筛选中。在hBS细胞中使用基因打靶精确地改造基因组的 能力(基因改造的细胞分化成或不分化成各种细胞类型)允许使用该
技术通过初步和二次筛选鉴定新的治疗活性物质。
因此，在其他方面本发明涉及通过本发明的方法获得的确定用于
U单克隆抗体的生产
ii) 体外毒性筛查，
iii) 潜在药物物质的体外筛选，或
iv) 潜在药物物质的鉴定 的hBS细胞的使用者。


图1显示40倍放大率下的在用酸性蒂罗德溶液处理以除去透明 带和滋养外胚层部分之前的胚泡。
图2显示40倍放大率下的在用酸性蒂罗德溶液处理以除去透明 带和滋养外胚层部分之后的胚泡。
图3显示10倍放大率下的A)第7代、第4天中的hBS细胞系 SA611。
图4显示对于未分化hBS细胞标记A) ALP的阳性反应。.
图5显示对于未分化hBS细胞标记SSEA-4的阳性反应和对于分 化hBS细胞标记SSEA-1的阴性反应，两者都处于第6代和在20倍放 大率下。
图6显示对于未分化hBS细胞标记Tra 1-60和Tra 1-81的阳性 反应，两者都处于第6代和在20倍放大率下
图7显示20倍放大率下的经历程21至28天的自发分化后第6 代中对于内胚层标记HNF-3 P和神经外胚层标记3微管蛋白的阳性反 应。
图8显示无异源物质的hBS细胞系SA611的额外的形态学和免 疫组织学特征。(A)显示胚泡(标尺条(scale-bar) 25 um)。 (B)显示 在无异源物质的条件下12次传代后的SA611的形态学(标尺条- 100 um)。 (C-H)显示在12次传代后使用Oct-4 (C) 、 SSEA-1 (D) 、 Tral-60 (E)、 Tral-81 (F) 、 SSEA-3 (G) 、 SSEA-4 (H)进行未分化的SA611的 免疫荧光。(请注意(C)和(E)中的图象是使用不同二抗产生的双染色的 图象。)在(C)、 (E)和(G)中标尺条为50um，在(F)和(H)中为100um。
图9显示第9代中的无异源物质的hBS细胞系SA611的遗传特征。 (A)显示染色体是二倍体和正常的。(B)和(C)显示从SA611选择的染色 体的原位杂交荧光，该原位杂交荧光证明细胞是XY且正常染色体12 和17为二倍体。(C)进一步显示了， X染色体显示蓝色，Y染色体 显示金黄色，染色体13显示红色，染色体18显示浅绿色和染色体21 显示绿色(这以黑色和白色来显现几乎是不可能的)。
图IO显示无异源物质的hBSC系SA611在体内)(在(A)、 (C)和 (E)中)和在体外(在(B) 、 (D)和(F)中)的多潜能性的确认在无异 源物质的条件下在ll次传代后来自SA611的畸胎瘤的组织学分析(A) 神经外胚层(外胚层)、(C)软骨(中胚层)、(E)分泌上皮(内胚层)。在 传代后2至4周使用免疫荧光分析体外分化的SA611: (B) p-III-微 管蛋白阳性神经元(外胚层)，(D) ASMA阳性平滑肌肌动蛋白(中胚层)， 和(F) HNF3 P (Foxa2)阳性细胞(内胚层)。标尺条50 Mm (A、 B、 D、 E、 F)，标尺条1G0 Mm (C)。
实施例
实施例1 —获得和培养无异源物质的hBS细胞 在征得G5teborg Univers ity的当地伦理委员会同意和批准后得 到捐赠的来自临床体外受精(IVF)处理的剩余人胚胎。将捐赠的胚胎在 常规用于IVF处理的培养基中培养成5天龄胚泡。按照Gardner将胚 泡分级为4AA和按照WO2003055992分级为质量为A(具有许多不同的 紧密填充的ICM细胞的扩展的胚泡和具有许多细胞的粘着的滋养外胚 层)。在将内细胞团细胞置于无异源物质的血清中的被丝裂霉素C失活 的人包皮成纤维细胞饲养细胞上之前，在室温下用酸性蒂罗德溶液 (Medicult)(即用浓度)处理胚泡15至30秒以除去透明带和滋养外 胚层的部分，所述无异源物质的血清包含具有大约270的渗透压、补 充有20% (v/v)人血清、4 ng/mL人重组bFGF、 1%青霉素-链霉素、 1% Glutamax、 0.5 mmol/1 0-巯基乙醇和1%非必需氨基酸(Gibco Invitrogen Corporation)的DMEM。(参见图1和2。)然后在37° C 下于空气中含有5%0)2的条件下温育胚泡。每2至3天更换50%的培 养基，在10天后，机械地将细胞传代至新鲜hFF饲养者。从第2代开 始，使用玻璃毛细管作为切削和转移工具机械地传代hBS细胞(细胞系 SA611)。大约每周一次对它们进行传代，且在优先权申请时(October, 2005)培养超过11代。(参见图3)。在PCT进入时(October, 2006) 无异源物质的SA611 hBS细胞系总共培养超过30代。
实施例2-人包皮成纤维细胞饲养细胞系(例如细胞系hFF003)
的建立
将来自环切的8周大的男孩的人包皮样品在无菌条件下收集在含 有2X庆大霉素的无菌IMDM (Invitrogen)中。将皮肤外植体置于25cm2 的装有IMDM培养基(Invitrogen) 、 1%青霉素-链霉素(Gibco Invitrogen Corporation)和10%人血清的原代组织培养瓶(primaria tissue culture flask) (Becton Dickinson)中。在大约10天后， 建立了汇合的单层。使用TrypLE Select (Invitrogen)将细胞连续 传代。在扩增后，就人病原体的名单(支原体、1型和2型HIV、乙型 肝炎和丙型肝炎、巨细胞病毒、l型和2型单纯疱渗病毒、Epstein-Barr 病毒和人乳头瘤病毒)对其进行检测。
实施例3 -飼养层的制备 在涂板无异源物质的人成纤维细胞飼养之前，在室温下用0.1% 的重组人明胶(Fibrogen)涂铺组织培养孔，进行1小时的最短时间。 然后用丝裂霉素C (Sigma)处理生长在IMDM、 10%人血清和1%青霉素-链霉素中的无异源物质的hFF003 (第5至8代)细胞的汇合单层，进 行2. 5个小时。将培养基(所述培养基基于补充有10% (v/v)人血清、 1%青霉素-链霉素、1% Glutamax、 0. 5 mmol/1 0-巯基乙醇和1%非必 需氨基酸(Gibco Invitrogen Corporation)的DMEM (如上))中，
将丝裂霉素C处理的饲养者以200 000个细胞/2. 89国2涂铺在IVF小 孔(Becton Dickinson)上。在放置具有其内细胞团细胞和从其产生的 细胞或hBS细胞的胚泡之前，将培养基更换为现改为补充有20% (v/v) 人血清、10 ng/mL人重组bFGF、 1%青霉素-链霉素、1% Glutamax、 0.5 mmo1/1 p-巯基乙醇和1%非必需氨基酸(Gibco Invitrogen Corporation)的DMEM (如上)。(实施例1中描述的相同培养基)。
实施例4 -基于血清的培养基的制备 通过在大约8 ° C下将血液收集在未涂铺肝素的塑料袋中过夜来 从至少 15个健康个体(Blodcentralen， Sahlgrenska University Hospital)的血液样品获得人血清，其中可将血清与凝固物质分开。将 血清进一步无菌过滤，以缘当的比例汇集和冷冻。(在Blodcentralen: Sahlgrenska University -Hospital就病原体包括乙型肝炎、丙型肝 炎、HIV、 HTLV和梅毒的标准组合对使用前的血液进行检测。)
通过向DMEM (如上)加入20% (v/v)的融解的血清和实施例1中 描述的其他组分来进一步制备培养基。
实施例5 -通过无异源物质的hBS细胞的玻璃化进行的冷冻和融
解
按照W02004098285中描述的方法在数代例如在第25代中冷冻和 融解hBS系细胞SA611,制备两种溶液A和B(溶液A:无菌过滤的10% 乙二醇、10%的Cryo-PBS中配制的DMSO;溶液B:无菌过滤的0. 3M 海藻糖、20%乙二醇、10%的Cryo-PBS中配制的DMS0)。以与当使用干 细胞切削工具(Swemed Labs International, Billdal， Sweden)切削 细胞以进行常规传代时相同的方式切削选择的hBS细胞系SA611的集 落。首先将细胞碎块在500 ml预热(37。 C)溶液A中温育1分钟，然 后转移至25 ml溶液B中，温育30秒，然后再转移至新配的溶液B 的液滴中，温育20至30秒。体积大约为40-50 pl。将细胞碎块抽 吸入制备用于玻璃化的吸管，然后用粘合剂(bond)封闭吸管。再将
吸管浸入液氮中。
几天后，如下所述融解装有冷冻的SA611的吸管 制备两种溶液C和D(溶液C:无菌过滤0. 2M的在Cryo-PBS中配 制的海藻糖；溶液D:无菌过滤0. 1M的在Cryo-PBS中配制的海藻糖)。 将溶液C和D以及hBS-培养基在37 ° C下预热。人液氮罐中取出装 有玻璃化的SA611的封闭的吸管。将吸管在室温下保持10秒，然后在 40 。 C水浴中快速融解(数秒内)。使用一把高压灭菌过的剪刀在堵塞 端剪开吸管，使用注射器将内容物从吸管推出进入溶液C。将hBS细 胞在500 pl溶液C中温育l分钟，然后转移至500 nl溶液D中， 温育5分钟。在立体显微镜下，在基于无异源物质的血清的培养基中 快速漂洗hBS细胞碎块，然后将其在培养皿中接种在基于血清的培养 基中的无异源物质的人成纤维细胞祠养细胞的上。然后培养细胞(在 37 。 C下温育)，计数建立的新集落数目，并进行传代以验证玻璃化 后hBS细胞的成活力。
实施例6 无异源物质的hBS细胞系的表征 免疫组织化学和组织化学分析
将hBS细胞集落培养物在4y。的多聚甲醛中固定，然后进行透化。 在连续的洗涤和封闭步骤后，将细胞与一抗在4 ° C下一起温育过夜。 使用的 一抗对于0ct-4 、 TRA-l-6 0、 TRA-1-81 、 SSEA-1 、 SSEA-3和SSBA-4 (Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz， CAj http: 〃丽.southernbiotech. com)是特异性的。FITC-或Cy3-缀合的 二抗用于检领'J。 用 DAPI (Vectashield; Vector Laboratories, Burlingame， CA; hup: //www, vectorlabs. com)复染细胞核。按照厂 商的方案 (Sigma-Aldrich Stockholm, Sweden;
http: 〃丽.sigmaaldrich. com)确定碱'性磷酸酶(ALP)的活性。
为了鉴定来自3种不同胚层的细胞，如上所述使用下列抗体进行 免疫组织化学分析对于内胚层细胞使用HNF3 p (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz; http: //www.southernbiotech.com)。
使用ASMA (company)检测中胚层细胞，和使用P -微管蛋白-III mAb (Sigma-Aldrich)鉴定神经外胚层细胞。
使用商购可获得的试剂盒和按照厂商的方案(Sigma-Aldrich)检 测碱性磷酸酶(ALP)反应。
在未分化的集落中检测针对ALP (参见图4) 、 Oct-4、 Tral-60、 Tra 1-81、SSEA-3和SSEA-4是阳性的反应，以及检测到针对SSEA-1 (参 见图5、 6、 8)是阴性的反应。(参见图4-6)。
染悉沐裙^为V^f和尸/S^
将设计用于基因表征的hBS细胞再转移至小鼠胚胎成纤维细胞， 进行两次传K或转移至基质胶板(Matrigel plate) (Becton Dickinson)，然后再进一步培养大约10天。然后在花萼海绵体诱癌 素A (Calyculin A)存在的情况下温育细胞，通过离心收集细胞， 通过低渗处理裂解细胞，然后使用乙醇和冻醋酸固定。使用胰蛋白酶-吉姆萨或DAPI染色显现舉色体。对于荧光原位杂交(FISH)分析，按照 具有稍许改进的厂商说明书使用包舍针对染色体12、 13、 17、 18、 20、 H和性染色体(X和Y)的探针的商购可获得性试剂盒。在配备合适的 滤光片和软件(CytoVision; Applied Imaging; Santa Clara CA; http: 〃www. appliedimagingcorp. com)的倒置显微镜下分才斤载玻片。 在第9至10代对hBS细胞系SA611进行基因表征。hBS细胞系SA611 具有通过核型分析证明的二倍体正常核型。核型是46 XY。对选择的 染色体的FISH分析验证了该发现。
已确认SA611的核型正常。(参见图9)。
最初通过使hBS细胞集落在飼养者上自发分化或通过将未分化 的hBS细胞集落转移至^其上允许它们自发分化的MatrigerM涂铺的 板(Becton Dickinson)上来检测SA611的多能性。在两种情况下，当 分化被诱导时，将培养基转换为VitroHESTM (Vitrolife， Kungsbacka,
Sweden)。在3至4周的培养后，通过免疫组织化学分析集落以鉴定来
自3个不同胚层的细胞。
鉴定了就早期内胚层标记HN3P (有时也称为Foxal)、外胚层标 记P-微管蛋白和ASMA (oc-平滑肌肌动蛋白)的阳性反应。(关于HNF3
P和P-微管蛋白反应参见图7，关于所有3个标记参见图10 (B、 D、 F))。
为了在体内探测无异源物质的hBS细胞系SA611的多能性性质， 将未分化的hBS细胞簇移植在SCID小鼠的肾嚢下面。畸胚瘤内的外 胚层(神经外胚层，图10A)、中胚层(软骨，图10C)和内胚层(肠 样上皮，图10E)组织的出现证明SA611展示了多能hBS细胞的特征 性体内分化能力。
总之，无异源物质的hBS细胞系SA611稳定地表达未分化的多能 人BS细胞的遗传和表型特征。
参考文献
W02004098285-Cryopreservation of human blastocyst—derived stem cells by a closed straw vitrification method.
WO2003055992-A method for the establishment of a pluripotent human blastocyst—derived stem cell line.
WO2005059116 Methods for clonal derivation of human blastocyst—derived stem (hBS) cell lines.
W02006094798 Use of panel of pairs of primers complementary
to reporter genes of cell differentiation.
WO2006034873 Improved methods for the generation of hepatocyte-like cells from human blastocyst-derived stem (hBS) eel Is.
Martin JM, Muotri A， Gage F等人Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Medicin. 2005; 11 (2): 228-232.
Xu C， Inokuma MS, Denham J 等人 Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2001;19:971-974.
Richards M， Fong C-Y， Chan W-K等人Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2002;20:933-936.
Inzunza J, Gertow K， Str5mberg MA等人Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. STEM CELLS; 23: 544-549.
Richards M， Tan S， Fong CY等人Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. STEM CELLS 2003;21:546-556.
Heins N, Englund MC0， Sj5blom C 等人 Derivation, characterization, and differentiation of human embryonic stem
cells. STEM CELLS 2004; 22:367-376.
Richards, M， Fong， C. Y， Chan, W. K， Wong, P. C， Bongso， A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of inner cell masses and embryonic stem cells. Nature Biotechn 2002; 20: 933-936.
Richards, M， Tan, S， Fong, C. Y， Biswas, A， Chan, W. K， Bongso, A. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells, STEMCELLS 2003; 546-556.
Tallheden T， van der Lee J， Brantsing C， Mansson JE，
Sjogren-Jansson E， Lindahl A. Human serum for culture of articular chondrocytes. Cell Transplant. 2005; 14 (7): 469-79.
Martin MJ， Muotri A， Gage F， Varki A.
Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid.
Nat Med. 2005 Feb; 11 (2): 228—32. Epub 2005 Jan 30.
权利要求
1. 获得无异源物质的hBS细胞系的方法，所述方法包括步骤:i)通过无异源物质的操作从胚泡除去透明带以获得滋养外胚层包围的内细胞团，ii)通过无异源物质的操作至少部分地除去滋养外胚层以获得分离的内细胞团细胞，iii)将内细胞团细胞置于在无异源物质的培养基中的人饲养细胞层上，iv)将内细胞团细胞与人饲养细胞在无异源物质的培养基中共培养大约5天至大约50天的时间期限，v)如果有的话，通过无异源物质的操作从过度生长的滋养外胚层中释放内细胞团细胞或来源于其的细胞，vi)选择性地，将内细胞团细胞或来源于其的细胞转移至在无异源物质的培养基中的新鲜人饲养细胞层上，从而获得无异源物质的hBS细胞，vii)通过在无异源物质的培养基中与人饲养细胞共培养来增殖无异源物质的hBS细胞，从而获得无异源物质的hBS细胞系。
2. 权利要求l的方法，其还包括步骤viii) 通过下述方式来增殖无异源物质的细胞系在无异源物 质的培养基中与人伺养细胞共培养，和以大约2天至大约20天，例如 大约4天至大约12天的合适的时间间隔使细胞进行传代。
3. 权利要求1或2的方法，其还包括步骤ix)将无异源物质的hBS细胞系转移至包含合适的无异源物质的 支持基质和无异源物质的培养基的无异源物质的和无伺养者培养系 统。
4. 前述权利要求中任一项的方法，其中通过使用a)酸性溶液， b)—种或多种重组酶例如透明质酸酶或链霉蛋白酶，或c)机械方法进 行步骤i)。
5. 权利要求4的方法，其中通过使用酸性溶液进行步骤i)。
6. 权利要求5的方法，其中通过将胚泡经历酸性溶液大约5秒至 大约180秒，例如大约IO秒至大约120秒，大约15秒至大约90秒， 大约20秒至大约60秒，大约30秒至大约50秒来进行步骤i)。
7. 权利要求5或6的方法，其中酸性溶液的pH是大约2至大约 3,例如大约2.5至大约2. 8，例如2. 5。
8. 权利要求5至7中任一项的方法，其中酸性溶液是酸性蒂罗德 溶液。
9. 前述权利要求中任一项的方法，其中通过使用a)酸性溶液， b)—种或多种重组酶，或c)机械方法进行步骤ii)。
10. 权利要求9的方法，其中通过使用酸性溶液进行步骤ii)。
11. 权利要求10的方法，其中通过将步骤i)中获得的滋养外胚 层包围的内细胞团经历酸性溶液来进行步骤ii),其中经历酸性溶液 的时间为大约5秒至大约180秒，例如大约IO秒至大约120秒，大约 15秒至大约90秒，大约20秒至大约60秒，大约30秒至大约50秒。
12. 权利要求IO或11的方法，其中酸性溶液的pH是大约2至大 约3，例如大约2. 5至大约2. 8，例如2. 5。
13. 权利要求10至l2中任一项的方法，其中酸性溶液是酸性蒂 罗德溶液。
14. 权利要求9的方法，其中通过使用一种或多种重组酶进行步 骤ii)。
15. 权利要求14的方法，其中所述的一种或多种重组酶是重组蛋 白水解酶。
16. 权利要求15的方法，其中所述的一种或多种重组蛋白水解酶 选自重组胰蛋白酶和TrypLETMSe 1 ect 。
17. 权利要求14-16中任一项的方法，其中通过将步骤i)中获得 的滋养外胚层包围的内细胞团经历大约5.000 U至大约IO.OOOU的重 组胰蛋白酶大约0. 5分钟至大约30分钟来进行步骤ii)。
18. 权利要求14-17中任一项的方法，其中通过将步骤i)中获得 TM的滋养外胚层包围的内细胞团经历未稀释的即用浓度的TrypLE Select大约0. 5至大约10分钟，例如大约0. 5至大约8分钟，大约 0. 5至大约5分钟，大约1至大约3分钟，例如1. 5分钟来进行步骤
19. 前述权利要求中任一项的方法，其中步骤iv)中的时间期限 是在步骤iv)中大约5天至大约30天，例如大约5天至大约20天或 大约5天至大约15天。
20. 前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤iv)中的内细胞 团细胞的共培养期间通过更换大约20%至大约100%，例如大约30%至 大约80%，大约40°/。至大约60%的培养基来进行一次或更多次培养基的 更换。
21. 前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤iv)中的内细胞 团细胞的共培养期间通过更换大约50%的培养基来进行一次或更多次 培养基的更换。
22. 权利要求20或21的方法，其中以大约2天至大约14天，例 如大约4天至大约7天的时间间隔进行一次或更多次培养基的更换。
23. 前述权利要求中任一项的方法，其中，如果有的话，在步骤或来源于其的细胞。
24. 权利要求23的方法，其中机械方法包括使用玻璃毛细管作为 切削工具。
25. 前述权利要求中任一项的方法，其中，如果有的话，步骤v) 中通过使用一种或多种重组酶从过度生长的滋养外胚层中释放内细胞 团细胞或来源于其的细胞。
26. 权利要求25的方法，其中所述的一种或多种重组酶是重组蛋 白水解酶。
27. 权利要求26的方法，其中所述的一种或多种重组蛋白水解酶 选自重组胰蛋白酶和TrypLETM Select,
28. 权利要求25至27中任一项的方法，其中通过将内细胞团细 胞或来源于其的细胞与大约5. OOOU至大约10.000 U的重组胰蛋白酶 温育大约0. 5分钟至大约30分钟来进行步骤v)。
29. 权利要求25至28中任一项的方法，其中通过将内细胞团细 胞或来源于其的细胞与未稀释的即用浓度的TrypLETM Select—起温育 大约0. 5分钟至大约15分钟来进行步骤v)。
30. 前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤vii)中的无异源 物质的hBS细胞的增殖期间进行一次或更多次传代。
31. 权利要求30的方法，其中对hBS细胞进行选择性传代。
32. 权利要求30或31的方法，其中通过使用机械方法进行传代。
33. 权利要求30或31的方法，其中通过使用一种或多种重组酶 进行传代。
34. 权利要求33的方法，其中所述的一种或多种重组酶选自 TrypLE Select、重组胰蛋白酶和重组胶原酶。
35. 权利要求33至34中任一项的方法，其中通过使用大约5. 000 U至大约10. 000 U的重组胰蛋白酶温育大约0. 5分钟至大约30分钟 来进行步骤vii)。
36. 权利要求33至34中任一项的方法，其中通过使用未稀释的 即用浓度的TrypLE Select温育大约0. 5至大约15分钟来进行步骤 vii)。
37. 权利要求33至？4中任一项的方法，其中通过使用大约200 U/ml重组胶原酶温育大约1分钟至大约40分钟来进行步骤vii),
38. 前述权利要求中任一项的方法，其中通过机械分割来进行步 骤viii)中的细胞的传代。
39. 权利要求38的方法，其中通过使用玻璃毛细管作为切削工具 来进行机械分割。
40. 前述权利要求中任一项的方法，其中通过使用一种或多种重 组蛋白来进行步骤viii)中的细胞传代。
41. 权利要求40的方法，其中所述的一种或多种重组酶选自 TrypLE Select、重组胰蛋白酶和重組胶原酶。
42. 权利要求40至41中任一项的方法，其中通过使用大约5. 000 U至大约10. 000 U的重组胰蛋白酶温育大约0. 5分钟至大约30分钟 来进行步骤viii)。
43. 权利要求40至41中任一项的方法，其中通过使用未稀释的 即用浓度的TrypLE Select温育大约0. 5至大约15分钟来进行步骤 viii)。
44. 权利要求40至41中任一项的方法，其中通过使用大约200 U/ml重组胶原酶温育大约1分钟至大约40分钟来进行步骤viii)。
45. 前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤ix)中使用的无 异源物质的支持基质可选自重组人明胶、重组人纤连蛋白、人胎盘细 胞外基质。
46. 前述权利要求中任一项的方法，其中步骤ix)中使用的无异 源物质的培养基可以与在步骤iii)、 iv)、 vi)、 vii)和viii)中的任 一步骤中使用的无异源物质的培养基相同或不同。
47. 前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤ix)中使用的无 异源物质的培养基可用人伺养细胞进行条件化，或其可补充合适的因 子以维持未分化的生长。
48. 权利要求47的方法，其中合适的因子可选自重组bFGF和WNT 途径的激活剂。
49. 前述权利要求中任一项的方法，其中在无异源物质的条件下 获得在步骤iii)、 iv)、 vi)、 vii)和viii)中的任一步骤中使用的人 祠养细胞。
50. 权利要求49的方法，其中人飼养细胞来源于健康人组织。
51. 权利要求49或50的方法，其中人祠养细胞是来源于新生儿 人包皮的皮肤成纤维细胞。
52. 前述权利要求中伊一项的方法，其中在步骤iii)、 iv)、 vi)、 vii)和/或viii)中的任一步骤中使用的无异源物质的培养基包括适 合用于人内细胞团细胞增殖的基本培养基。
53. 权利要求52的方法，其中基本培养基是DMEM。
54. 权利要求52或53的方法，其中无异源物质的培养基还包含 大约2 ng/ml至大约100 ng/ml重组bFGF，例如大约5 ng/ml至大约 50 ng/ml重组bFGF，大约5 ng/ml至大约25 ng/ml重组bFGF，大约 5 ng/ml至大约15 ng/ml重组bFGF。
55. 权利要求52至54中任一项的方法，其中无异源物质的培养 基还包含10 ng/ml重组bFGF。
56. 权利要求52至55中任一项的方法，其中无异源物质的培养 基还包含大约1% v/v至大约30% v/v人血清，例如大约10% v/v至大 约30% v/v人血清，大约15% v/v至大约25% v/v人血清。
57. 权利要求52至56中任一项的方法，其中无异源物质的培养 基还包含20% v/v人血清。
58. 前述权利要求中任一项的方法，其中通过下列步骤制备在步 骤iii)、 iv)、 vi)、 vii)和viii)中的任一步骤中使用的人血清a) 在未涂铺肝素的袋子中收集健康人血液，b) 摇动所述未涂铺肝素的袋子，进行大约0. 5小时至大约5小 时，例如大约0. 5小时至大约2小时的时间期限，c) 在至多5X:的温度下温育所述未涂铺肝素的袋子，进行至少 10小时的时间期限，d) 任选地，基于凝固质量例如不存在未凝固血纤蛋白、液相的 不透明度来进行选择，将血清与凝固的材料分离，f)无菌过滤步骤d)中获得的血清，g)汇集来自至少15个供者的血清，h)使用前冷冻血清。
59.获得无异源物质的hBS细胞系的方法，该方法包括步骤通过在室温下用酸性蒂罗德溶液温育胚泡大约10秒至大约io分钟，优选大约30秒至大约60秒的时间期限来从胚泡除去透明带和至少部分滋养外胚层，从而获得分离的内细胞团细胞，2)将内细胞团细胞在包含DMEM、人血清、重组bFGF、 L-谷氨酰 胺或glutamax、非必需氨基酸、p-巯基乙醇、青霉素和链霉素的无异源物质的培养基中置于人包皮成纤维细胞伺养细胞层上，3) 在无异源物质的培养基中将内细胞团细胞与人包皮成纤维细 胞饲养细胞共培养，进行大约5天至大约15天的时间期限，每3至5 天更换至少50°/。的无异源物质的培养基，4) 如果有的话，通过使用TrypLE Select (Invitrogen)作为 酶处理从过度生长的滋养外胚层中释放内细胞团细胞或来源于其的细 胞，5) 选择性地，将内细胞团细胞或来源于其的细胞转移至无异源物质的培养基中的新鲜人包皮成纤维细胞伺养细胞层上，从而获得无 异源物质的hBS细胞，6) 通过在无异源物质的培养基中与人包皮成纤维细胞饲养细胞 共培养来增殖无异源物质的hBS细胞，从而获得无异源物质的hBS细 胞系。
60. 权利要求59的方法，其进一步包括步骤7) 通过下述方式来增殖无异源物质的hBS细胞系在无异源物质 的培养基中与人包皮成纤维细胞饲养细胞共培养，每3至5天更换至 少50%的无异源物质的培养基，和以适当的时间间隔，例如每3至8 天对细胞进行传代。
61. 通过前述权利要求中任一项的方法获得的无异源物质的hBS 细胞系。
62. 权利要求61的无异源物质的hBS细胞系，其未直接或间接地 暴露于任何非人动物材料。
63. 权利要求61或62的无异源物质的hBS细胞系，其中使用的 任何有机材料是人来源的或是合成的、半合成的或重组的材料。
64. 权利要求61至63中任一项的无异源物质的hBS细胞系，其 中动物是哺乳动物。
65. 权利要求61至64中任一项的无异源物质的hBS细胞系，其 展示下列标准中的至少1个，例如至少2个、至少3个、至少4个、 至少5个、或至少6个标准对于Oct-4、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3 和/或SSEA-4为阳性反应和对于SSEA-1为阴性反应。
66. 权利要求61至65中任一项的无异源物质的hBS细胞系用于 制备其分化的衍生物的用途。
67. 通过权利要求1至60中任一项的方法获得的无异源物质的 hBS细胞系或其分化的衍生物在医学中的用途。
68. 通过权利要求1至60中任一项的方法获得的无异源物质的 hBS细胞系或其分化的衍生物用于医药产品的制造的用途，所述医药 产品用于预防和/或治疗由组织变性引起的病理学状况和/或疾病。
69. 通过权利要求1至60中任一项的方法获得的无异源物质的 hBS细胞系或其分化的衍生物用于医药产品的制造的用途，所述医药 产品用于治疗和/或预防代谢性病理学状况和/或疾病。
70. 通过权利要求1至60中任一项的方法获得的无异源物质的 hBS细胞系或其分化的衍生物用于医学研究的用途。
71. 通过权利要求1至60中任一项的方法获得的无异源物质的 hBS细胞系或其分化的衍生物在用于研究人疾病例如人变性性疾病的 体外模型中的用途。
72. 通过权利要求1至60中任一项的方法获得的无异源物质的 hBS细胞系或其分化的衍生物用于药物发现方法的用途。
73. 通过权利要求1至60中任一项的方法获得的无异源物质的 hBS细胞系或其分化的衍i物用于体外毒性测试的用途。
74. 通过权利要求1至60中任一项的方法获得的无异源物质的 hBS细胞系或其分化的衍生物用于筛选目的的用途。
全文摘要
用于获得稳定的无异源物质的hBS细胞系的方法，按照所述方法获得的无异源物质的hBS细胞系和其用途。方法包括步骤i)通过无异源物质的操作从胚泡除去透明带以获得滋养外胚层包围的内细胞团，ii)通过无异源物质的操作至少部分地除去滋养外胚层以获得分离的内细胞团细胞，iii)将内细胞团细胞在无异源物质的培养基中置于人饲养细胞层上，iv)将内细胞团细胞与人饲养细胞在无异源物质的培养基中共培养大约5天至大约10天的时间期限，v)如果有的话，通过无异源物质的操作从过度生长的滋养外胚层中释放内细胞团细胞或来源于其的细胞，vi)通过选择将内细胞团细胞或来源于其的细胞在无异源物质的培养基中转移至新鲜人饲养细胞层上以获得无异源物质的hBS细胞，vii)通过在无异源物质的培养基中与人饲养细胞共培养来增殖无异源物质的hBS细胞，从而获得无异源物质的hBS细胞系。无异源物质的hBS细胞系适合用于药物和体外检测。
文档编号C12N5/08GK101384703SQ200680046004
公开日2009年3月11日 申请日期2006年10月6日 优先权日2005年10月7日
发明者C·埃勒斯特罗姆, E·K·克尔玛丽, H·塞姆, K·弗雷吉, K·莫亚, R·斯特雷赫尔, S·J·许尔纳 申请人:塞拉提斯股份公司