专利名称：：蛋白功能的体外分子进化方法
技术领域：
：本发明涉及蛋白功能的体外分子进化方法，其允许控制引入选择的母蛋白质区域的变异性。
背景技术：
：可通过包括定点诱变(Alber&a/.,Nature,5;330(6143):41-46,1987)、组合克隆(Huse&a/.,Science,246:1275-1281,1989;Marksd"/.,Biotechnology,10:779-783,1992)以及同适当的选择系统组合的随机诱变(Barbasda/.,PNAS.USA,89:4457-4461,1992)的多种体外方法修饰和改善蛋白功能。已经在许多情况下使用了同选择共同使用的随机诱变方法以改善蛋白功能，且存在两个不同的策略。首先，随机化整条基因序列并结合选择具有期望特性的变体(突变)蛋白，然后是新一轮的随机诱变和选择。然后可重复该方法直至发现认为是优化的蛋白变体(SchierR."《J.Mol.Biol.1996263(4):551-567)。在这里，引入突变的传统途径是通过具有大约0.7呢突变率的易错PCR(LeungWW.，Technique,1:11-15,1989)。其次，可使用允许高达100%突变率的简并引物诱变基因的确定区域(GriffithsEMBO.J，13:3245-3260,1994;Yang"aZ"J.Mol.Biol.254:392-403，1995)。在抗体工程领域广泛使用了随机突变。可在体外克隆体内形成的抗体基因(LarrickdBiochem.Biophys.Res.Commun.160:1250-1256，1989)并且可将编码可变重链和轻链基因的基因的随机组合置于选择中(Marks"a/.,Biotechnology,10:779-783，1992)。可使用随机诱变和额外的多轮选择进一步改善通过这些方法选择的功能抗体片段(SchierR."W.，J.Mol.Biol.1996263(4):551-567)。典型地，随机诱变策略后进行选择。可选择具有目标特性的变体并且可将来源于每一种均具有目标特性的不同变体的突变DNA区域组合成一条编码序列(Yang"aZ.，J.Mol.Biol.254:392-403，1995)。也已经使用了基因的组合配对来改善蛋白功能，如抗体亲和性(Marks"Biotechnology,10:779-783，1992)。另一种己知的用于蛋白功能体外突变的也称为"DNA改组"(DNAshuffling)的方法利用了DNA的随机片段化和片段组装成功能编码序列(Stemmer,Nature370:389-391，1994)。DNA改组方法通过重组组合来源于单个基因的有用突变而产生多样性。不同蛋白，如酶和细胞因子的人工进化已经成功使用了该方法(Chang"NatureBiotech.17,793-797,1999;Zhang"a/.Pro"Natl.Acad.Sci.USA94，4504-4509,1997;Christians"NatureBiotech.17，259-264，1999)。使用DNA酶I将基因随机片段化，然后通过彼此间重组进行重新组合。起始材料能是单个基因(使用易错PCR第一个随机突变的)或天然发生的同源序列(所谓的家族改组)。DNA酶I优先在靠近嘧啶核苷酸的位点水解DNA，因此，它是DNA随机片段化的合适选择。然而，该活性依赖于Mg或Mn离子，Mg离子限制了片段大小到50bp，而Mn离子将给出低于50bp的片段大小。因此，为了拥有用于重组的所有可能的大小，上述基因需要用DNA酶I在存在两种不同离子之一的情况下处理至少两次，然后除去这些非常相同的离子。尽管，在理论上，在任何克隆间改组DNA是可能的，假如产生的改组的基因关于表达和活性是有功能的，优选地，除了低水平的随机突变，待改组的克隆必须是相关的或甚至是相同的。遗传上不同的克隆间的DNA改组通常生产非功能性基因。
发明内容本发明寻求提供体外蛋白进化的改善方法。特别地，本发明的目标是提供允许控制引入选择的母多核苷酸序列的区域内的变异性程度的方法。因此，根据本发明的第一方面提供的是用于从母多核苷酸分子产生变体多核苷酸分子或其群体的方法，该方法包括下述步骤(a)提供多核苷酸分子的第一群体和多核苷酸分子的第二群体，第一和第二群体共同组成母多核苷酸分子的正链和负链；(b)用核酸酶消化多核苷酸分子的第一和第二群体以产生多核苷酸片段；(c)将所述产生自正链的多核苷酸片段同产生自负链的片段接触(在允许片段退火的条件下)；和(d)扩增退火到彼此的片段以产生至少一条其序列与母多核苷酸分子不同的多核苷酸分子其中通过加入一条或更多条具有预决的变异性的寡核苷酸控制在歩骤(d)中产生的至少一条多核苷酸分子的选择区域内的序列变异性程度，该寡核苷酸退火到位于母多核苷酸分子3'和5'末端核苷酸之间但排除该3'和5'末端核苷酸的序列。本发明的方法提供的主要优点是，它们允许控制通过加入一条或更多条具有预决的变异性的寡核苷酸引入到母多核苷酸序列内的序列变异性的程度。这样的寡核苷酸能退火(优选在高严谨条件下)到存在于一条或更多条母多核苷酸序列内的内部目标序列。具有预决的变异性的寡核苷酸能退火到位于母多核苷酸分子的3'或5'末端核苷酸间但排除该3'或5'末端核苷酸的内部序列(使得寡核苷酸不能退火到3'或5'末端核苷酸)。因此，术语'具有预决的变异性的寡核苷酸'未预期包围3'或5'端引物序列或全长模板。然而，最好是步骤(c)额外地包括加入在退火条件下退火到至少一条母多核苷酸的3'和/或5'端的引物序列。在本发明的方法的优选实施方案中，其中多核苷酸的第一和第二群体是单链的，在步骤(b)前或步骤(b)中加入具有预决的变异性的寡核苷酸，并且用来消化母多核苷酸的核酸酶对单链多核苷酸特异(例如，Sl核酸酶、Exol、ExoT和绿豆核酸酶)。当被这样加上时，寡核苷酸退火/杂交到单链母多核苷酸的第一和第二群体，借此产生其因此免受单链特异性核酸酶消化的双链区域(参见图2)。作为结果，该受保护序列内的变异性在步骤(d)中生产的因而发生的多核苷酸内是受控制的。在可选的优选实施方案中，在步骤(b)后歩骤(c)前或步骤(c)中加入具有预决的变异性的寡核苷酸。在该实施方案中，通过核酸酶消化生产的多核苷酸片段同寡核苷酸钉在一块，其然后在再退火/杂交过程中被整合入在歩骤(d)中生产的变体多核苷酸中(参见图3)。再一次地，优选地，在该实施方案中的多核苷酸的第一和第二群体是单链的。通过使用具有预决的变异性的寡核苷酸完成引入通过使用本发明的方法生产的变体多核苷酸内的变异性控制。例如，可通过使用本领域公知的方法，如易错PCR或通过使用寡核苷酸合成(如那些能从德国埃伯斯贝格MWGBiotech商业购得的)生产整合变化的核苷酸序列变异性程度(从没有变异性到高变异性)的寡核苷酸。因此，最好是具有预决的变异性的寡核苷酸序列的知识不是基本的；重要的是，寡核苷酸内的变异性程度是已知的(假如不是绝对的了解，至少是相对的了解)。有利地，具有预决的变异性的寡核苷酸同母多核苷酸序列的内部序列分享至少90%的序列同一性，例如至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。可通过使用合适的计算机程序测定两条多核苷酸间的序列同一性百分比，许多这样的程序可在线获得(例如参见www.hgmp.mrc.ac.uk/GenomeWeb/nuc-mult.html)。例如，可通过使用ClustalW程序分析序列同一性(Thompsone/a/.，(1994)7VMc/e/c^c/A22，4673-80)。使用的参数可以如下快速配对比对参数K-字长(字)大小；1，窗口大小；5，空位罚分；3，顶对角线数目；5.打分方法X百分比。多比对参数起始空位罚分；10，延伸空位罚分；0.05。打分矩阵BLOSUM。在优选的实施方案中，具有预决的变异性的寡核苷酸同母多核苷酸序列的内部序列分析了100%的序列同一性。因此，寡核苷酸可能全部具有相同的核苷酸序列。在可选的实施方案中，具有预决的变异性的寡核苷酸具有至少两条不同的序列。优选地，寡核苷酸是具有母多核苷酸序列的相同内部序列的变体。最好地，可将具有预决的变异性的寡核苷酸靶向母多核苷酸的相同内部序列或不同内部序列。在优选的实施方案中，具有预决的变异性的寡核苷酸同母多核苷酸的至少两个不同区域分析100%序列同一性，或是母多核苷酸的至少两个不同区域的变体。最好地，具有预决的变异性的寡核苷酸可能具有任何长度，只要它们不组成全长模板。然而，优选地，寡核苷酸的长度在10和500个核苷酸之间。更优选地，寡核苷酸的长度在50和200个核苷酸之间，例如长度为大约100个核苷酸。本发明提供产生母多核苷酸序列的变体形式的方法。最好地，可在任何编码包括具有结合或催化性质的任何蛋白质，例如抗体或抗体的部分、酶或受体的多肽产物的多核苷酸上进行本发明的方法。此外，可依照本发明突变具有可能改变的功能的多核苷酸，如催化RNA。优选地，编码一条或更多条蛋白基序的母多核苷酸长度至少是12个核苷酸，更优选地，长度至少为20个核苷酸，更优选地，长度超过50个核苷酸。可使用长度为至少100个核苷酸或长度甚至至少200个核苷酸的多核苷酸。当使用的母多核苷酸编码巨大蛋白如酶或抗体时，其长度可能是好几百或数千个碱基。可在任何大小的母多核苷酸上进行本发明。有利地，在步骤(d)中生产的至少一条多核苷酸分子的改变的序列与该多核苷酸或借此编码的多肽的改变的性质或特性相关。通过本发明的方法产生的多核苷酸或多肽的改变的性质或特性可能是野生型(母)多核苷酸或其编码的多肽、蛋白或蛋白基序的正常活性中的任何变异或改变。例如，可按下述方式应用本发明的方法(i)或正向或负向地调整酶的催化活性；(ii)调整抗体的结合特异性和/或亲和性；(iii)调整配体-受体相互作用的结合特异性和/或亲和性，如白介素和它的受体间的(通过生产配体和/或受体的变体)；(iv)调整多肽单体形成多体形式的能力，如在用于疫苗的病毒衣壳蛋白中；(v)调整免疫原刺激抵抗它的特异抗体的生产能力；和(vi)调整蛋白的稳定性(如激素和生长因子的血清稳定性)。因此，最有利地，可使用本发明的方法改变任何蛋白、多肽或多核苷酸的性质/功能。本领域公知检测通过本发明的方法产生的变体多核苷酸或多肽的改变的性质的方法。例如，噬菌体展示技术的发展已经彻底改变了分子文库中功能蛋白的选择(Parmley"Gene,73:305-3911988;McCafferty"Nature,348:552-554,1990;Barbas"PNAS.USA,88:7978-7982,1991)。在该方法中，表型(蛋白)与它相应的基因型(DNA)直接连接并且这允许有遗传物质的直接克隆的余地，其然后能被进一步修饰以改善蛋白功能。已使用噬菌体展示来从具有高达1011个转化体大小的多种分子文库中克隆功能结合剂(Griffiths"d.，EMBO.J.13:3245-3260，1994)。因此，能使用噬菌体展示来从分子文库中直接克隆功能结合剂，也能使用噬菌体展示来进一步改善最初选择的克隆。已经用于蛋白文库的表面表达及其选择的其它类型病毒是杆状病毒(Boublik"Biotechnol13:1079-1084.1995;Mottershead"BiochemBiophysResCom238:717-722,1997;Grabherr"ZBiotechniques22:730-735，1997)禾口反转录病毒(Buchholz"dNatureBiotechnoll6:951-954,1998)。也可使用细胞表面展示从分子文库中选择功能蛋白。此处也是如此，表型同它相应的基因型直接相连。已使用细菌细胞表面展示进行例如改善的羧甲基纤维素酶(CMCase)变体的筛选(KimWApplEnvironMicrobiol66:788-93，2000)。其它能用于该目的的细胞是酵母细胞(BoderandWittrupNat.Biotechnol15:553-557，1997)、COS细胞(HiguchiadJImmunolMeth202:193-204，1997)和昆虫细胞(Granzerio"JImmunolMeth203:131-139,1997;Ernst"NucleicAcidsRes26:1718-1723，1998)。母多核苷酸优选地编码一个或更多个蛋白基序。将这些基序定义为编码具有独特蛋白功能的多肽(即氨基酸)序列的多核苷酸序列的区域或元件。例如，蛋白基序可能定义了完整蛋白的一部分，如表位、切割位点或催化位点等。数个可搜索蛋白基序和潜在蛋白基序的数据库是可提供的，如MOTIF、PROSITE、SMART和BLOCKS(www.blocks.fhcrc.org)。优选地，选择的变异性程度受控的母多核苷酸分子的区域相应于(即编码)一个或更多个这样的蛋白基序。因此，可使具有预决的变异性的寡核苷酸针对编码蛋白基序的母多核苷酸分子的内部序列。本领域技术人员认为通过使用作为母多核苷酸的能杂交以形成双链互补核苷酸序列的任何核酸起始物质，如基因组DNA(gDNA)或互补DNA(cDNA)进行本发明的方法是有利的。优选地，多核苷酸的第一和第二群体是cDNA。在优选的实施方案中，多核苷酸的第一和第二群体是单链的。合宜地，多核苷酸的第一群体由母多核苷酸分子的正链组成，多核苷酸的第二群体由母多核苷酸的负链组成。可选地，多核苷酸的第一和/或第二群体可能包含母多核苷酸分子的正链和负链。如上所述，可使用本发明的方法生产任何母多核苷酸序列的变体形式。有利地，利用单条母多核苷酸序列的诱变获得母多核苷酸序列，即母多核苷酸序列组成单条多核苷酸序列的变体形式。可利用上面公开的任何常规方法，如易错PCR完成母多核苷酸序列的随机突变。在优选的本发明的方法的实施方案中，母多核苷酸序列编码配体多肽。通过"配体多肽"，我们包括了任何在体内或体外同其它生物分子(例如另一种多肽或多核苷酸)相互作用的多肽。优选地，具有预决的变异性的寡核苷酸同编码与生物分子，如结合位点或调控位点直接或间接相互作用的氨基酸序列的母多核苷酸序列的区域分享序列同一性，或是所述母多核苷酸序列的区域的变体。在进一步优选的实施方案中，母多核苷酸序列编码抗体或抗体片段，如Fab-样分子(Better"a/(1988)5Wewce240,1041)、Fv分子(Skerra"a/(1988)Sc/e膨240，1038)、单链Fv(ScFv)分子(Birdda/(1988)Sc/ertce242,423;Huston&a/(1988)尸裂淑/.Jcad园85,5879)和单结构域抗体(dAbs)(Wardda/(1989)Atowm341，544)。在该实施方案中，具有预决的变异性的寡核苷酸优选地同编码互补性决定区(CDR)的母多核苷酸序列的区域分享序列同一性，或是所述母多核苷酸序列的区域的变体。可选地，具有预决的变异性的寡核苷酸可能同编码框架(framework)多肽的母多核苷酸序列的区域分享序列同一性，或是所述母多核苷酸序列的区域的变体。在进一步优选的实施方案中，母多核苷酸序列编码酶或其催化活性片段。尽管使用的是术语"酶"，也将其解释为包括任何具有酶样活性，即催化功能的多肽。例如，是酶的部分的多肽可能仍然具有催化功能。此外，也包括蛋白如干扰素和细胞因子。在该实施方案中，具有预决的变异性的寡核苷酸优选地同编码活性位点或调控位点(如变构调控位点，如辅因子结合位点)或涉及到酶稳定性中的区域(如蛋白酶切割位点)的母多核苷酸序列的区域分享序列同一性，或是所述母多核苷酸序列的区域的变体。-在进一步优选的实施方案中，母多核苷酸序列编码抗原。通过"抗原"，我们包括了当将其给予到哺乳动物宿主时能急性地或慢性地诱导免疫反应的抗原肽。在该实施方案中，具有预决的变异性的寡核苷酸优选地同编码表位的母多核苷酸序列的区域分享序列同一性，或是所述母多核苷酸序列的区域的变体。本领域的技术人员认为在消化步骤(b)中使用任何核酸酶以产生多核苷酸片段，如外切核酸酶、内切核酸酶或限制酶或其组合是有利的。纯化并混合单个消化的片段并用PCR技术进行重新组合。然后将组合的(再造的)基因克隆入表达蛋白的表达载体中。然后分析蛋白的改变的特性。通过"核酸酶"，我们指具有溶核酸活性的多肽，如酶或其片段。优选地，核酸酶是外切核酸酶。更优选地，多肽的外切核酸酶活性大于多肽的内切核酸酶活性。更优选地，多肽具有外切核酸酶活性但基本没有内切核酸酶活性。合适的外切核酸酶包括BAL31、外切核酸酶I、外切核酸酶V、外切核酸酶VII、外切核酸酶T7基因6、细菌噬菌体A外切核酸酶和外切核酸酶RecJf。优选地，在步骤(b)中单独地消化多核苷酸的第一和第二群体。通过控制核酸酶消化反应的参数，可控制多核苷酸片段的大小。以该方式测定多核苷酸片段的长度避免了必须提供如从凝胶中纯化目标长度的片段的进一步步骤的必需性。有利地，用于消化多核苷酸分子的第一群体的反应的至少一个参数不同于在用于消化多核苷酸分子的第二群体的反应中使用的相当的参数。通过"相当的参数"，我们指，在用于消化单链多核苷酸分子的其它群体的反应中使用的相同的参数。其可能发生变化的合适反应参数包括核酸酶类型、核酸酶浓度、反应体积、消化反应的持续时间、反应混合物的温度、反应混合物的pH、母多核苷酸序列的长度、母多核苷酸分子的量和反应混合物的缓冲液组成。用于消化多核苷酸分子的第一和第二群体的反应的不同参数的使用提供了通过本发明的方法生产的变体多核苷酸的增加的变异性的优点。因此，本发明第一方面的优选实施方案提供组合多核苷酸片段以产生变体多核苷酸序列的方法，该方法包括以下歩骤(a)用核酸酶消化(优选线性的)母多核苷酸以产生具有不同长度的片段的群体；(b)从来源于步骤(a)的序列中组合多核苷酸序列其中使用具有预决的变异性的寡核苷酸来控制在产生的多核苷酸序列的选择区域中的变异性的程度。优选地，该方法进一步包括步骤(c)表达产生的被组合的多核苷酸序列编码的蛋白和步骤(d)筛选蛋白的改变的性质或特性。本发明也提供可通过上述方法获得的或可获得的具有改变的核苷酸序列(优选地编码具有改变的/目标特性的多肽)的多核苷酸序列。可将这些多核苷酸序列用于产生基因治疗载体和复制缺陷基因治疗构建物或用于基于DNA的疫苗接种的疫苗接种载体。此外，可将多核苷酸序列用做研究工具。本发明也提供具有通过上述方法产生的序列的多核苷酸文库，从该文库中可选择编码具有改变的/目标特性的蛋白的多核苷酸。优选地，多核苷酸文库是DNA或cDNA文库。本发明也提供具有不同于野生型的特性的通过上述方法生产的蛋白如酶、抗体和受体。可单独地或在药学上可接受的载体中将这些蛋白用作疫苗或用于治疗的药物，例如，用作免疫原、抗原或用于获得特定的抗体。也可将它们用作研究工具。为了获得产生的多核苷酸序列的表达，可将多核苷酸整合入具有可操作地连接到多核苷酸序列的控制序列的载体以控制它的表达。载体可能包括其它的序列如启动子或增强子以驱动插入的多核苷酸序列的表达，进一步的多核苷酸序列以便被多核苷酸编码的蛋白以融合形式生产，和/或编码分泌信号的核酸以便使在宿主细胞中生产的蛋白从细胞中分泌出来。然后可通过将载体转化入载体在其中是有功能的宿主细胞中、培养宿主细胞以便生产蛋白并从宿主细胞或周围培养基中回收蛋白获得多核苷酸序列编码的蛋白。本领域中将原核和真核细胞用于该目的，包括大肠杆菌菌株、酵母菌和真核细胞如COS或CHO细胞。可使用宿主细胞的选择来控制在那些细胞中表达的蛋白的性质，如控制蛋白在宿主细胞中沉积的位置或影响其性质如它的糖基化。可通过本领域公知的方法表达被多核苷酸序列编码的蛋白。合宜地，可通过在培养基中在导致或允许蛋白表达的合适条件下培养含有这样的载体的宿主细胞获得表达。公知在各种不同的宿主细胞中克隆和表达蛋白的系统。合适的宿主细胞包括细菌、真核细胞如哺乳动物细胞和酵母菌和杆状病毒系统。并且，利用反转录病毒作为克隆和表达系统是良好的可选方案，因为可将该病毒同大量细胞类型共同使用。本领域中可获得的用于表达外源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、乳仓鼠肾细胞、COS细胞和许多其它细胞。通常，优选的细菌宿主是大肠杆菌。可选择或构建含有合适的包括启动子序列、终止子片段、多聚腺苷酸序列、增强子序列、标记基因的调控序列和其它合适序列的合适的载体。载体可以是合适的质粒、病毒如噬菌体或噬菌粒。如欲了解进一步的详情，可参见例如MolecularCloning:aLaboratoryManual:3rdedition,Sambrook禾口Russell，2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress。在CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel"Z.eds.,JohnWiley&Sons,1992中详细公开了许多著名的操作多核苷酸序列，如制备多核苷酸构建物、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达、分析蛋白的技术和规程。可将该系统用于创建包含可将其以大量方式筛选目标蛋白功能的可变序列的DNA文库。可用对实际的酶功能，如CMCase活性、P-葡糖苷酶活性和热稳定性特异的方法筛选酶功能。此外，可使用噬菌体展示和细胞表面展示筛选酶功能(CrameriA.WW.，Nature199815;391(6664):288-291;ZhangJ.H.dPNAS.USA199794(9):4504-4509;WarrenM.S."Biochemistry1996，9;35(27):8855-8862;Kim"W.，ApplEnvironMicrobiol66:788-93，2000)和筛选如抗体的改变的结合性质(Griffith"fl/.，EMBOJ.113:3245-3260，1994)。可在筛选影响或调控其活性或功能的分子中使用本发明提供的多肽。这样的分子在治疗性(可能包括预防性)环境中可能是有用的。本发明也提供包含通过上述方法产生的多核苷酸序列的载体。本发明也提供包含多核苷酸序列、包含多核苷酸序列的载体或通过上述方法产生的多肽和药学上可接受的载体或适用于研究目的的载体的组合物。本发明进一歩提供包含，在鉴定具有通过上述方法获得的目标特性的多核苷酸或多肽后，生产完整的或部分该多肽或多核苷酸，随意地与额外的多肽或多核苷酸连起来的方法。因此，本发明进一步的方面提供制备具有改变的/目标性质的多肽的方法，该方法包含下述步骤(a)通过使用根据本发明第一方面的方法产生母多核苷酸的变体形式；(b)表达步骤(a)中生产的变体多核苷酸以生产变体多肽；(C)筛选变体多肽的目标性质；和(d)从变体多肽中选择具有目标性质的多肽。本发明进一步提供通过上述方法获得的多肽。在鉴定了具有改变的/目标特性的多核苷酸或多肽后，能通过公知的技术如PCR、克隆和在宿主细胞内表达生产这些多核苷酸或多肽以提供更大的数目。可将产生的多肽或多核苷酸用于制备工业酶，如洗衣洗涤剂酶，其中在更低的温度下优选增加的活性。可选地，可将生产的多核苷酸或多肽用作研究工具，即可将抗体用于免疫分析，可将多核苷酸用作杂交探针或引物。可选地，可将产生的多肽或多核苷酸用于制备如下所述的用于诊断用途、药物用途、治疗等的药物。可将通过本发明的方法产生的并鉴定为具有改变的特性的多肽或多核苷酸在药物组合物中按配方制造。这些组合物可能包含，除上述物质之一外，药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其它物质。这样的物质应无毒且不应干扰活性成份的效力。载体或其它物质的准确的性质可能依赖于给药途径，如口服、静脉内、皮肤或皮下、鼻、肌内、腹腔途径。口服给药的药物组合物可能是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可能包括固体载体如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。也可包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖类溶液或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚丙二醇。对于静脉内、皮肤或皮下注射或在患病位点的注射，活性成分将处于胃肠外可接受的水溶液形式，其无热源且具有合适的pH、等张性和稳定性。本领域相关技术人员能通过使用，例如，等张赋形剂如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液容易地制备合适的溶液。如果需要，可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加物。因此，本发明进一歩提供通过本发明的方法生产的用于药物的多核苷酸或多肽以及通过本发明的方法生产的多核苷酸或多肽在制备用于处理(treament)、治疗和/或诊断疾病的药物中的用途。不管它是根据本发明产生后鉴定的并给予到个体的多肽，如抗体或其片段、酶、多核苷酸或核酸分子，优选以足以显示对个体的益处的"预防有效量"或"治疗有效量"给予它们(因为情况可能如此，尽管可将预防考虑为治疗)。给予的实际量和给予的速度和时程将依赖于待处理的状态的性质和严重性。处理的处方，如剂量的决定处于开业医生和其它医生的责任范围内并典型地考虑待处理的紊乱、个体病人的状况、给予的位点、给予的方法和开业医生已知的其它因素。可在Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Osol,A.(ed)，1980中发现上述技术和规程的例子。可选地，可通过使用靶向系统如抗体或细胞特异配体的靶向疗法更特异地传递活性剂到某些类型的细胞。由于各种原因靶向是可期望的；例如，假如试剂是不可接受的有毒，或假如它可能需要太高的剂量，或假如它可能不能进入目标细胞。代替直接给予这些试剂的是，可通过在目标细胞中从引入细胞的编码基因表达的方式生产它们，如在病毒载体中(VDEPT技术的变体，即在载体中通过从病毒载体中的编码DNA表达的形式生产激活剂，如酶)。可将载体靶向待处理的特定细胞，或它能包含可被目标细胞更多或更少选择性打开的调控元件。可选地，可以前体的形式给予试剂，通过在待处理细胞中生产的激活剂或靶向到待处理细胞的激活剂将前体转变成活性形式。有时该类型的方法称为ADEPT或VDEPT;前者涉及通过到特定细胞抗体的结合将激活剂靶向到细胞，而后者涉及在载体中通过从病毒载体中的编码DNA的表达生产激活剂，如酶(参见例如，EP-A-415731和WO90/07936)。依赖于待处理的状况，可单独给予或与其它处理组合给予组合物，同时地或连续地。作为进一步的可选项，可将通过本发明的方法产生后鉴定为具有目标特性的多核苷酸用于基因治疗的方法，以处理那些不能合成被多核苷酸编码的活性多肽或不能在正常水平合成它的病人，借此提供被相应的野生型蛋白提供的效力。在现有技术中已经使用了载体如病毒载体来将多核苷酸引入各种不同的目标细胞。典型地，将载体暴露到目标细胞以便转染能在足够比例的细胞中发生以从目标多肽的表达中提供有用的治疗或预防效果。转染的核酸可能被持久地整合入每一个靶向的肿瘤细胞的基因组，提供长期的效果，或可选地必须周期性地重复该处理。各种载体，病毒载体和质粒载体均是本领域公知的，参见美国专利No.5,252,479和WO93/07282。特别地，已经将大量病毒用作基因转移载体，包括乳多泡病毒如SV40、痘苗病毒、疱疹病毒包括HSV和EBV以及反转录病毒。现有技术中许多基因治疗规程已经使用了丧失能力的鼠反转录病毒。作为使用病毒载体的可选项，其它已知的将核酸引入细胞的方法包括电穿孔、磷酸钙共沉淀、机械技术如微注射、脂质体介导的转移和直接的DNA摄取以及受体介导的DNA转移。如上所述，使用编码多肽或其活性部分的核酸的基因治疗的目的是增加细胞中核酸表达产物的量，在该细胞中野生型多肽的水平缺失或仅以降低水平存在。这样的处理在己经是癌化的细胞的处理中可能是治疗性的，或在已知的通过筛选具有易感性等位基因并从而对例如癌易感的方式处理个体中是预防性的。本发明也提供用于产生多核苷酸序列或具有目标特性的序列的群体的试剂盒，其包含用于制备SSDNA的试剂、外切核酸酶和进行PCR技术的组分，例如，热稳定DNA(核苷酸)和终止方法，如EGTA。如上所述，本发明合宜地提供创立具有目标特性的突变酶基因序列和它们到功能酶的随机组合。作为本发明这个方面的例子，通过导致大约0.7%突变率的易错PCR突变酶基因。然后用外切核酸酶如BAL31消化产生的突变酶基因的群，通过在不同时间点加入EGTA或热灭活抑制反应，产生一组具有不同大小的DNA片段。然后可将这些片段置于如上面公开的基于PCR的重新组装。然后克隆产生的重新组装的DNA片段并构建基因文库。然后从该文库选择克隆并测序。该技术进一歩的应用是产生可将其用于进一步选择和分析的可变DNA序列的群体。除了编码更大的蛋白，如抗体片段和酶，DNA可能编码可将其分子功能特性用于设计不同的选择系统的肽。先前已经公开了重组的编码肽的DNA序列的选择(Fisch"PNAS.USA1996Jul23;93(15):7761-7766)。此外，可使用可变的DNA群体生产具有例如催化活性的RNA分子群体。Vaish等人(PNAS.USA1998Mar3;95(5):2158-2162)证明了用于选择催化性RNA的功能系统的设计，EcksteinF(CibaFound.Symp.1997;209;207-212)已经描述了通过将催化性RNA引入细胞应用催化性RNA的要点。可使用该系统进一步通过序列空间寻找具有基于重组DNA序列的催化活性的功能肽/分子。现在，将通过实施例并参考附图解释本发明的方面和实施方案。进一步的方面和实施方案对本领域技术人员是显而易见的。图1:显示了使用AlligatorBioscience的FIND技术的体外分子进化的一般原理(如WO02/48351中公开的)。图2:显示了本发明的方法的优选实施方案，其中具有预决的变异性的寡核苷酸在步骤(b)中加入。图3:显示了本发明的方法的优选实施方案，其中具有预决的变异性的寡核苷酸在步骤(c)中加入。图4:显示了A.两条具有不同长度和极性的不同ssDNA的杂交。B.用ExoI从3'—5'消化杂交分子。C.用ExoVII从5,—3，和3，—5'消化杂交分子。图5:显示试验杂交的凝胶图像泳道1:1kbDNA梯度(Invitrogen)。泳道2:CT17760bp和CT17285bp在10mMTris中的杂交。泳道3:CT17760bp和CT17285bp在1xPCR缓冲液中的杂交。泳道4:ssDNACT17760bp。泳道5:ssDNACT17285bp。图6:显示了EXOI和EXOVII消化的凝胶图像泳道1:Exol缓冲液中未消化的CT17760bp/CT17285杂种。泳道2:用Exol消化10分钟的CT17760bp/CT17285杂种。泳道3:用Exol消化20分钟的CT17760bp/CT17285杂种。泳道4:ExoVII缓冲液中未消化的CT17760bp/CT17285杂种。泳道5:用ExoVII消化20分钟的CT17760bp/CT17285杂种。泳道6:用ExoVII消化30分钟的CT17760bp/CT17285杂种。泳道7:EZload精确分子量标准(Bio-RAD)。具体实施方式实施例在附图1到3中图解了本发明的方法。该方法在一条或更多条母多核苷酸序列的体外分子进化中利用如WO02/48351和WO03/097834公开的AlligatorBioscience的FINDTm技木。下面给出了本发明示例性实施方案的详细描述。实施例l-FINDTM技术在WO02/48351和WO03/097834中公开了FINDTm技木。试效AmpliTaq⑧聚合酶购自Perkin-ElmerCorp.,dNTPs购自BoehringerMannheimBiochemica(德国，曼海姆)，BAL31核酸酶购自NewEnglandBiolabsInc.(美国，贝弗利)。所有的限制酶购自NewEnglandBiolabsInc.(美国，贝弗利)。溴化乙锭购自Bio-RadLaboratories(Bio-RadLaboratories,美国加州Hercules)。T4DNA连接酶购自NewEnglandBiolabsInc.(美国，贝弗利)。EDTA和EGTA购自KeboLab(瑞典)。所有的引物均在实验室中设计并从LifeTechnologies(瑞典，泰比)和SGS-DNA(瑞典，K6ping)。所有的聚合酶链反应(PCR)均以自动热循环仪进行(Perkin-ElmerCetus480，Norwalk，CT和美国)。在美国专利No.4,683,195中公开了用于扩增核酸的PCR技术。涉及PCR技术一般使用的文献包括Mullis"a/.，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol"51:263,(1987),Ehrlich(ed),PCRtechnology,StocktonPress,NY，1989,EhrlichWa/.,Science,252:1643-1650，(1991),"PCRprotocols;AGuidetoMethodsandApplications",Eds.Innisda/.,AcademicPress,NewYork,(1990)。靜通过吏用BigDyeTerminatorCycle测序i式齐!j盒(Perkin-Elmer，美国加州Elmervill)将所有的构建物进行测序。在ABIPrism377DNA测序仪上进行测序。鄉籍微冶就用在Tris-乙酸缓冲液(TAE-缓冲液0.04MTris-乙酸、0.001MEDTA)中的2%的琼脂糖凝胶(AGAROSE(FMCBioproducts，美国缅因州Rockland))和0.25[ig/ml的溴化乙锭进行DNA的琼脂糖凝胶电泳。用由25%Ficoll和溴酚蓝组成的无菌过滤的上样缓冲液混合用于电泳的样品并上样到2%琼脂糖凝胶的孔中。电泳在90V跑胶45分钟，除非另外指明在具有0.25pg/ml溴化乙锭的Tris-乙酸缓冲液中。当需要时，使用Qiaquick凝胶抽提试剂盒(QiagenGmbH，德国希尔登)凝胶纯化具有合适大小的条带。作为分子量标准，使用了DNA分子量标记lkb梯度(GibcoBRL)。使用分光光度计估计凝胶抽提产物的DNA浓度。潘麟樣使用大肠杆菌菌株TOP10F'作为转化的细菌宿主。基本上按照Hanahan,D.1983.StudiesontransformationofEscherichiacoliwithplasmid.J.Mol.Biol.166:557-580公开的方法生产该菌株的化学感受态细胞。生产了该细菌菌株的电效能细胞(Dower,W.J.,J.F.Miller&C.W.Ragsdale.1988:Highefficiencytransformationofi^.co//byhighvoltageelectroporation.NucleicAcidsRes.16:6127)。微按Sambrook，Mo/ecwZarc/omVig，'Za/wrator^附朋做Z(SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中描述的方法在pFab5chis中进行所有的遗传操作。pFab5chis载体被设计来在Sfil和Notl位点间携带插入的任何scFv基因(参见Emgberg"W.，1995,MW/w^MoZ.51:355-376)。Sfil位点位于pdB前导区内，Notl位点恰好位于VL区域后，以使VH-接头-VL被插入。在该情况中，使用了定向到CD40的抗体。用包括指定的独特限制性位点的下述序列设计包围pFab5chis的抗体基因的两条生物素化的引物1736Sfil正向引物5'-ATTACTCGCGGCCCAGCTCGGCCATGGCCCACAGGTCAAGCTCGA和1735Notl反向引物5'-TTAGAGCCTGC，GGCCGCCTTGTCATCGTCGTCCTT(其中指定了切割位点)用包括指定的独特限制性位点的下述序列设计包围pFab5chis的抗体基因的两条非生物素化的引物1664Sfil正向引物5'-ATTACTCGCGGCCCAGCTCGGCCATGGCCCACAGGTCAAGCTCGA禾口1635Notl反向引物5'-TTAGAGCCTGCTGGCCGCCTTGTCATCGTCGTCCTT按下述轮廓进行25个循环的标准PCR反应变性(94。C，1分钟)、引物退火(55°C，l分钟)和延伸(72°C，3分钟)。每一个PCR反应包含10mMTris-HClpH8.3、50mMKC1、1.5mMMgCl2、200jiMdNTP、1.nM正向引物、1pM反向引物、1.25UAmpliTaq⑧热稳定DNA聚合酶(Perkin-ElmerCorp.)和50ng模板，总体积为100jil。在包含500mMNaCl、100mMTris-HClpH8.8、5mMMgCl2100Hg明胶(根据Kuipers"fl/.，NucleicAcidsRes.1991，Aug25;19(16):4558但将MgCl2浓度从2mM增加到5mM)的10x缓冲液中进行易错PCR反应。对于每一个lOOpl反应，混合下述成份dATP5mM5jaldGTP5mM5pidTTP10mM10pidCTP10mMlOjal20|aM3，引物1.5)il20|iM5，-引物1.5}il10xKuipers缓冲液10jal灭菌mpH2046.3jal以50ng的量加入pFab5chis载体中的模板。加入lO(il10mM的MnCb并检査试管没有发生Mn02的沉淀。最后，加入5单位Taq酶。在没有热启动下在下述温度进行25个循环的易错PCR:94°Cl'、45°C1，、72°C1，、十72。C7分钟。产生的产物是易错的(即突变的)750bp的插入物。用GibcoPCR纯化试剂盒在进一步处理前纯化该插入物。^^主象素众游歹/激产f卓链Zm4利用两个单独的PCR反应扩增目标片段。这些反应能是上述的标准PCR或上述的易错PCR。应设计引物以使在一个反应中，正向引物是生物素化的且在另一个反应中，反向引物是生物素化的。例如，用pFab5chis-抗体作为模板进行25个循环的使用A)引物1736和1635和B)引物1664和1735的具有上述轮廓的PCR反应。这产生了大约750bp的PCR产物在A中上链是生物素化的；在B中，下链是生物素化的。通过使用用抗生蛋白链菌素包被的固体基体如免疫磁珠进行的纯化恢复非生物素化的链。洗涤磁珠并用PBS/1%BSA和包含5mMTrispH7.5、1MNaCl和0.5mMEGTA的B&W缓冲液平衡磁珠。用溶解在2xB&W缓冲液中的100(il磁珠混合100(il的每一种PCR产物并在室温下旋转孵育15分钟。通过用B&W小心地洗涤两次将未结合的PCR产物移除。通过在室温下用25pl0.1MNaOH孵育DNA10分钟的碱变性法洗脱捕获的DNA的非生物素化链。从磁珠上分离溶液并用7.5pl0.33MHC1禾口2.5jil1MTrispH8中和。,麼離产主微細使用Pstl/Hindlll限制酶将目标片段克隆入细菌噬菌体M13载体M13mpl8和M13mpl9。使用大肠杆菌菌株TOP10F根据常规技术繁殖细菌噬菌体。从细菌噬菌体载体M13mpl8制备针对上链的单链DNA，从细菌噬菌体载体M13mpl9制备针对下链的单链DNA。简言之，在4°C12000g离心1.5ml感染的细菌培养物5分钟。用200pi20%PEG8000/2.5MNaCl沉淀上清。将沉淀的细菌噬菌体重悬在lOOplTE中。加入5(^1用Tris-Cl(pH8.0)平衡的酚并将样品涡旋。在RT下12000g离心1分钟后，转移包含DNA的上相并用乙醇沉淀。在50^1TE(pH8.0)中溶解DNA沉淀并在-20。C保存。(Sambrooka"/.MolecularCloning,Alaboratorymanual2ndedition.ColdSpringHaborLaboratoryPress.1989，第4章)。从噬菌体制备的单链DNA是环状的并且必须在BAL31处理前打开。可用能切割单链DNA的内切酶进行该步骤。使用离心柱纯化PCR产物以从早先的PCR中去除多余的引物。将150ng的纯化产物用作在含1.5mMMgCl2(AppliedBiosystems)、200)iM每种dNTP(NewEnglandBioLabs)、1.25UAmpliTaqDNA聚合酶(AppliedBiosystems)和l.OjiM单条引物的100|ilIxGeneAmp10xPCR缓冲液中进行的线性扩增的模板。PCR循环条件是94"C变性1分钟，94°C30秒、55°C30秒、72°C1分钟循环35个循环，72。C延伸7分钟。不对称PCR产物是从在1%琼脂糖凝胶上的双链模板分离并使用Qiaquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen)纯化的大小。2//效提廢，f/^生卓链DA^最初，使用创制在5，和3，端分别具有独特限制酶(RE)位点的DNA的标准PCR反应生产dsDNA片段。将PCR反应分别分成两个并RE消化以优选地用创制3'突出端或平末端的限制酶创制5'磷酸化。在合适的缓冲液中并过夜进行消化以彻底进行消化。假如必须使用创制5'突出端的酶，可使用DNA聚合酶填上该突出端。在纯化后用10U入外切核酸酶在配套的特定缓冲液中37。C处理1-4吗dsDNA(例如购自Novagen的Strandase或购自NEB的A外切核酸酶)30分钟，在75°CIO分钟终止反应。使用标准凝胶抽提方法将ssDNA从琼脂糖凝胶上的任何dsDNA残留中进一歩分离出。伊^5AL"产主卓錄^皮众游DA^将ssDNA链(分别含有上链和下链)进行使用如BAL31(即上链从下链单独地消化)的单独酶学处理。每一个消化反应包含0.02pg/VlssDNA、600mMNaCl、20mMTris画HC1、12mMCaCl2、12mMMgCl2,1mMEDTApH8.0和从0.1到5U/ml的各种酶浓度的BAL31。在30"C孵育反应并在10、30、60和120秒或更长的时间连续收集消化的ssDNA的部分。通过加入EDTA和在65"C热处理10分钟终止反应。通过酚/氯仿抽提和乙醇沉淀纯化ssDNA片段。将ssDNA重悬在10mMTrispH8.0中。通过1%琼脂糖凝胶电泳评价消化图谱。微主产敝虔鹏必通过酚/氯仿/异戊醇抽提纯化消化的DNA片段。将50|il缓冲的酚加到每一管100(il样品和50^il氯仿和异戊醇混合物(24:1)中。将试管涡旋30秒，然后在微量离心机中以14000r.p.m.离心1分钟。然后收集上相并用2.5倍体积的99.5%乙醇(其1/10是3M的乙酸钠，pH5.2)混合。在-80。C沉淀DNAl小时。然后，通过在微量离心机中以14.000r.p.m.离心30分钟沉淀DNA。用70%乙醇洗涤沉淀一次，然后将其重溶在10(il无菌水中。絲微微_/:分腳/姓产氛绩众#皮将5pl来源于每一个时间点和空白的溶解的沉淀同2.5(ll上样缓冲液(25%蔗聚糖和溴酚蓝)混合并上样到2%琼脂糖凝胶的孔中。按上述方法进行不同时间点的电泳。全长A皮舰髓发通过两个连续的PCR反应获得ssDNA片段的重新组装。第一个PCR反应应包含全部处于25|il总体积中的10mMTris-HClpH8.3、50mMKC1、1.5mMMgCl2、200jiMdNTP、0.3UTaq聚合酶和2)ilBAL31处理的样品，并按下述轮廓进行5个循环94°Cl分钟、50°Cl分钟和72°C2分钟+72°C5分钟。第二个PCR反应应包含全部处于50jil总体积中的10mMTris-HC1pH8.3、50mMKCl、1.5mMMgCl2、200jiMdNTP、0.6UTaq聚合酶、ljiM正向引物，l(iM反向引物和来源于第一个PCR反应的5^1样品，并按下述轮廓进行15个循环94°C1分钟、55°C1分钟和72。C2分钟+72t:7分钟。可通过琼脂糖凝胶电泳评价产生的产物。^胡/,7VW/銜劍教众羞箭资麥游#虔浙廣*首先用Sfil通过使用包括BSA和11U酶/吗DNA的NEB缓冲液2切割重新组装的片段和质粒pFab5chis。在50'C进行该反应4小时。在此之后，用Notl通过加入转化缓冲液和6U酶/吗DNA切割DNA。在37'C过夜进行该反应。卿微麟,層潜，置微麥縱虔層麟众在1%琼脂糖凝胶上分析切割反应。限制消化的插入物显示了大约750bp的切割产物。这同预期的大小良好对应。将切割的插入物和质粒的条带切下并按上述方法进行凝胶抽提。墓,发嫌劍/靴縱虔離麟歸p認c/^離麥在12"C水浴槽中将纯化的切割的pFab5chis同纯化的重新组装的限制消化的片段连接16小时。将50|11载体与5(^1插入物和15|^110x缓冲液(同酶一块提供的)、7.5pl连接酶(5U/pl)和无菌水混合，使终体积为150(il。也以相同方式进行没有任何插入物的限制消化的pFab5chis的连接。通过上述的酚/氯仿抽提纯化连接反应物。从抽提收集上相并将其与2.5倍体积的99.5%乙醇(其1/10为3M乙酸钠，pH5.2)混合。在-8(TC沉淀DNA1小时。然后，通过在微量离心机中以14.000r.p.m.离心30分钟沉淀DNA。用70%乙醇洗涤沉淀一次并将其重溶与10^1的无菌水中。将5^1每一种连接物单独同95|il在冰上孵育1小时的化学感受态大肠杆菌TOP10F，混合，然后将其转化(SambrookWa/.MolecularCloning,Alaboratorymanual2ndedition.ColdSpringHaborLaboratoryPress,1989)。在培养一小时后，将来源于两个转化的细菌涂布到含氨苄西林的琼脂平板上(100(ig/ml)。将平板在37'C倒置培养14小时。实施例2-使用具有预决的变异性I的寡核苷酸控制变异性说明这套实验的原理是，在许多情况中，感兴趣的是特定突变目标区域如抗体的CDR区域中的并保持该框架^^改变或加入抑制该区域中的重组事件的非突变的区域如酶的活性位点。此处使用的试验基因是A2.30和A2.54(Ellmark"2002Mo^CM^r/附mM朋^gy39:349-356)、两个具有针对CD40的特异性的scFv克隆。材料和方法棘織游顆飾驗微縱产按下述方法生产相应于A2.30的CDR2的突变形式的具有预决的变异性的寡核苷酸。使用创制覆盖A2.30从bp56到bp352的突变的PCR产物的引物#137和#138(参见表lc)对A2.30克隆进行使用易错条件的(参见表la和lb)的两轮连续的PCR。使用创制覆盖A2.30克隆从bpl04到bp221的内部序列的CDR2片段的引物#351禾口#357*或#354*和#350(*表明了5，-生物素标记)进行使用易错条件的第三个PCR。使用GeneMorphPCR诱变试剂盒(Stmtagene)并使用相同的引物进一步突变这些PCR产物。使用(iMACSStrepatavidin试齐lj盒(MiltenyiBiotec)将ssDNA从生物素化的PCR产物中纯化出，在琼脂糖凝胶上进行进一步的纯化，其中使用Recochips(TaKaRa)恢复ssDNA。用NaAc/乙醇沉淀ssDNA，然后将其重溶在iomMTris-HClpH8.0中。表1(a)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>354*BIO-GACTCTCCTGTGCAGCCTCT357*BIO-TTGTCTCTGGAGATGGTGAA226CTCACTATAGGGCGAATTGG415TTCAGATCTCGAGGTGCAGCTGTTGGAG224CCTATTGCCTACGGCAGCC332*BIO-CCTATTGCCTACGGCAGCC333*BIO-CTCACTATAGGGCGAATTGG卓链母多凝-,^^游主产f,覆"用引物#224和#333*或#332*和#226(*表明5，-生物素标记)对A2.30和A2.54克隆进行标准的PCR反应(表2a和2b)。按上述方法纯化充当母多核苷酸的ssDNA。卓遂母多^,麼游教众C谬》？将显示在表3中的单独的正义链和反义链在生产商标明的缓冲液系统中进行外切核酸酶处理。表2a<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表2(b)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>,银多孩微游产主淑f'c,/〃W"在两个阶段中获得重新组装。在第一个重新组装反应中(PCRl，表4a和4b)，7.5ng外切核酸酶片段化的来源于A2-30和A2-54的正义和反义ssDNA分别与5ngCDR2正义片段(后者组成了具有预决的变异性的寡核苷酸；参见上述内容)混合。在PCR1的25个循环后，将整个反应混合物加到用于扩增的第二个PCR反应中，其中将引物加入以能形成全长的多核苷酸(PCR2表4a和4b)。将产生的PCR产物连接入pGEM-T载体系统(Promega)并测序。表4(a)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>结果和结论将使用本发明的方法按上述方法生产的二十个克隆进行测序并与A.2-30和A.2-54比较分析突变。总突变率是1个突变/1000bp，其与使用标准PCR扩增获得的正常突变率相一致(即不是易错PCR)。然而，二十个克隆中的七个(35%)在内部的78bpCDR2区域具有一个或两个突变。这显然高于单独PCR诱导的突变的几率，因此，仅能将其解释为被步骤(c)中加入的预突变的CDR2寡核苷酸(即具有预决的变异性的寡核苷酸)所诱导。所有在CDR2区域中具有突变的克隆显示了在两个最初克隆A2.30和A2.54间的重组。在这些克隆中的突变的数目在一到四间变动。文库的总重组率是每序列1.4个重组。结论，该实验证明，可使用具有预决的变异性的寡核苷酸来选择性地增加编码scFc分子的母多核苷酸的选择的区域(CDR2)内的变异性。实施例3-使用具有预决的变异性II的寡核苷酸控制变异性说明也使用A2.30和A2.54scFv克隆进行下述实验。材料和方法棘微舰雜游寡孩微鹏产按下述方法生产相应于突变的CDR1、CDR2、CDR3和CDR1+2ssDNA片段的具有预决的变异性的寡核苷酸。使用创制覆盖A2.30的bp56到bp352的突变PCR产物的引物M37和#138(参见表5c)对A2.30克隆进行使用易错条件(表5a和5b)的连续两轮PCR。使用创制显示在表6中的片段的引物进行使用易错条件的第三个PCR。使用与上述以及在表6中标明的引物相同的引物并使用GeneMorphPCR诱变试剂盒(Stratagene)将这些PCR产物进在pGEM-T载体系统(Promega)中连接并测序后，计算了与A2-30相比较的如表7所示的突变率。表5(a)<table>complextableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表5(b)<table>complextableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>引物#序列137CGCGAATTGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAG138AGATGGGGGACTAGTGCTGCTCACGGTGAC349GACTCTCCTGTGCAGCCTCT350CCTGGAGCCTGGCGGACCCA351GCTGGGTCCGCCAGGCTCCA352TTGTCTCTGGAGATGGTGAA354*BIO-GACTCTCCTGTGCAGCCTCT355*BIO-CCTGGAGCCTGGCGGACCCA356*BIO-GCTGGGTCCGCCAGGCTCCA357*BIO-TTGTCTCTGGAGATGGTGAA226CTCACTATAGGGCGAATTGG415TTCAGATCTCGAGGTGCAGCTGTTGGAG224CCTATTGCCTACGGCAGCC332*—BIO-CCTATTGCCTACGGCAGCC333*BIO-CTCACTATAGGGCGAATTGG384CACTGCCGTGTATTACTGT386*BIO-CAGTGTACCTTGGCCCCA表6<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表明寡核苷酸的5'-生物素标记7<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>根据在表6中表明的生物素化的PCR产物，使用pMACSStrepatavidin试剂盒(MiltenyiBiotec)纯化ssDNA。在琼脂糖凝胶上进行进一步的纯化，由此使用Recochips(TaKaRa)恢复ssDNA。用NaAc/乙醇沉淀在后续实验中用作具有预决的变异性的寡核苷酸的ssDNA，然后重溶在10mMTris-HClpH8.0中。够凝微》姓产御f^"用表明的引物(表9)对A2.30和A2.54进行标准的PCR反应(表8)。按上述方法纯化用作母多核苷酸的ssDNA。卓慈母多凝,麼游將众》"如表IO所示，对单独的正义和反义链进行外切核酸酶处理。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>制备了一套文库。在两个阶段中制备重新组装的PCR。在第一个阶段，PCRl中，将分别来源于A2-30和A2-54的外切核酸酶片段化的正义和反义ssDNA与相应于如表lla和13b中表明的CDRl、CDR2和/或CDR3的突变形式('具有预决的变异性的寡核苷酸')的寡核苷酸混合。在PCR1的25个循环后(表12a和12b)，将整个反应混合物加到第二个反应(PCR2;表12a和12b)中，其也包含末端特异性引物，并进行20个循环。在pGEM-T载体系统(Promega)中连接PCR产物并测序。表ll(a)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表11(b)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表12(a)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>结果和结论总突变率是1个突变/1000bp，其相应于标准PCR扩增的正常突变率(即不是易错PCR)。在不同文库中11%和56%间的克隆在它们的相应于加上的具有预决的变异性的寡核苷酸的CDR区域显示了突变(表13)。突变的序列对于CDR1、CDR2和CDR3分别是30bp、78bp和46bp。在加上CDR片段后在这些区域中的突变的发生率显然高于单独PCR诱导产生的突变的概率并因此仅能将其原因解释为预突变的寡核苷酸的加载。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>na:不适用a具有CDR2和CDR3突变的一个克隆"具有CDR1禾nCDR3突变的一个克隆结论，该实验证明，可将具有预决的变异性的寡核苷酸用于选择性增加编码scFv分子的母多核苷酸的多个选择的区域(CDR1、CDR2和CDR3)中的变异性。实施例4-使用具有预决的变异性III的寡核苷酸控制变异性说明进行下述实验以证明保护核苷酸序列的一个区域/多个区域免于外切核酸酶的降解。原理是能通过保持这些区域中的原始序列未被外切核酸酶消化而保护在FINDTM反应中基因中的区域免于重组。在下述FINDTM反应中，这些未消化的区域总具有母类型，从而是未重组的。用一条生物素化的引物和一条未修饰的引物进行两个独立的PCR以创制用作用于ssDNA制备的模板的两种不同的PCR产物(参见表14和15)。在制备ssDNA后，将产生的具有不同大小和极性的ssDNA杂交。然后分别用外切核酸酶I和外切核酸酶VII处理产生的杂交分子，将消化产物跑琼脂糖凝胶以评价实验结果(参见图4)。表14用于制备相应的ssDNA的产物和极性的引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表15引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>材料和方法表16CT17760bp的PCR扩增。(a)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>DNA聚合酶Amplitaq(5U/(il)，AppliedBiosystems用JetQuickPCR纯化系统(Genomed)纯化PCR产物。总收率52.5昭，浓度132.6ng/|al表17CT17285bp的PCR扩增。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>(b)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>*100u1珠子结合上X吗DNA(X=bpx0.066数目。**珠子加到5x过量中。*用"针对核酸应用的平衡缓冲液"平衡柱子，然后使2XlOOpl的lXB&W(5mMTrispH7.5、0.5mMEDTA、lMNaCl)流过柱子。*将dsDNA和珠子混合并应用。*用lOOjil的1XB&W洗涤柱子4次，用150(il的O.lMNaOH(存于-2(TC，新鲜解冻的)洗脱ssDNA，然后向洗脱物加入45^1的0.33MHC1和15|il的1MTris-HClpH8.0以中和ssDNA。在1。/。琼脂糖/lxTAE凝胶上在100V将65filssDNA/孔跑胶60分钟。插入Recochip并用反极性在100V跑胶10+2分钟。用UV证实recochip中的DNA含量。将recochip移到管(提供的)中，然后将管在5000rpm离心5秒。在用2.5倍体积的乙醇和0.1体积的3MNaAcpH4.6沉淀后，将CT17760和CT17285分别溶解于50^1和35^110mMTrispH8.0中。表19<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>在PCR机器中在95。C将样品杂交5分钟，然后进行异源双链步骤，该步骤由每个i分钟的45个循环组成，其中每个循环的温度降低rc，然后将样品在1.5%琼脂糖凝胶上跑胶。表20<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>样品中的DNA终浓度是44ng/pl。在PCR机器中在95。C将样品杂交5分钟，然后进行异源双链步骤，该歩骤由每个1分钟的45个循环组成，其中每个循环的温度降低rc。按上述方法进行沉淀并将沉淀溶解在40^110mMTrispH8中。，xo/搭染充游CJ7776,-C7772S5一#皮众。表21<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>将Exol和杂交的DNA加到37'C预热的水/缓冲液混合物中。对于样品1，在10分钟和15分钟时分别移出17.5^1并在96。C热灭活10分钟。对于样品2，将全部体积移出并在15分钟后在96'C热灭活10分钟。将全部的对照反应(60ng)和来源于IO分钟和15分钟时的2.8^1(60ng)跑1.2%琼脂糖凝胶。表23<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表24<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>*10xExoVII缓冲液500mMTrisHClpH7.9、500mM磷酸钾pH7.6、83mMEDTA、lOOmMB-巯基乙醇參在37。C将H20和缓冲液预热10分钟。參力口入ExoVII。*加入杂交的DNA。对于样品l，在20分钟和30分钟分别取出17.5^1，并在96。C热灭活10分钟。*对于样品2，在30分钟时将全部体积取出，并在96'C热灭活IO分钟。*将全部的对照反应(60ng)和来源于20分钟和30分钟的2.8^1(60ng)跑1.2%琼脂糖凝胶。结果M藩J游縦进行两个单独的PCR反应以生产下述PCR-产物CT17760bp(3'生物素化的)禾t]CT17285bp(5'生物素化的)。从这些dsDNA模板制备了ssDNA(参见上述材料和方法)。C77776,浙CT772S5游试毅染文评价了两种不同的杂交缓冲液10mMTrispH8.0和lxPCR缓冲液(AppliedBiosystems)(参见材料和方法)。将全部的反应物跑琼脂糖凝胶(参见图5)。CJ7776,浙C7772S56p游染效鄉五xo/狗jC//微以摩尔比率1:5在lxPCR缓冲液中将CT17760bp和CT17285bp杂交，然后用Exol和ExoVII在两个单独的反应中将它们消化(参见材料和方法)。将60ng每种消化产物跑琼脂糖凝胶(参见图6)。讨论两个片段的试验杂交清楚地显示，在PCR缓冲液中杂交的样品中发生了杂交，其中我们看到了相应于具有dsDNA区域和在其末端具有ssDNA突出端的杂交物的条带。该条带比预测的大小760bp小，但这可能是由于ssDNA突出端导致的改变的迁移性。在琼脂糖凝胶中ssDNA的迁移不同于dsDNA，其经常迁移在相应于dsDNA的大约一半大小的地方。在其它样品中没有发生任何杂交，其中我们仅看到相应于两条原始ssDNA的条带。这证实，PCR缓冲液的离子强度是足够的，但10mMTris不足以使杂交发生。所有进一歩的杂交均在PCR缓冲液中进行。用ExoI和ExoVII进行的消化给出了预期的结果仅能从3'—5'消化的Exol留下了悬于5'端的ssDNA仍然存在但在3'端的ssDNA被移除的条带。再一次地，该条带小于预期的大小(558bp)但悬于5'端的ssDNA可能改变了在凝胶中的移动模式。从5'—3'和3'—5'进行消化的ExoVII移除了所有的突出ssDNA并仅留下285bp的dsDNA。这些实验清楚地显示，通过用互补ssDNA进行杂交，在核苷酸序列中选择的区域可免受外切核酸酶的消化。权利要求1、用于从母多核苷酸序列产生多核苷酸序列或序列的群体的方法，该方法包括下述步骤(a)提供多核苷酸分子的第一群体和多核苷酸分子的第二群体，第一和第二群体共同组成母多核苷酸分子的正链和负链；(b)用核酸酶消化多核苷酸分子的第一和第二群体以生产多核苷酸片段；(c)将产生自正链的所述多核苷酸片段与产生自负链的片段接触(在允许片段退火的条件下)；和(d)扩增退火到彼此的片段以产生至少一条其序列不同于母多核苷酸分子的多核苷酸分子其中通过加入一条或更多条具有预决的变异性的寡核苷酸控制在步骤(d)中生产的至少一条多核苷酸分子的选择区域内的序列变异性程度，该寡核苷酸退火到位于母多核苷酸分子的3’和5’末端核苷酸间但排除3’和5’末端核苷酸的序列上。2、根据权利要求1所述的方法，其中母多核苷酸编码一个或更多个蛋白基序。3、根据权利要求1或2所述的方法，其中多核苷酸的第一和第二群体是cDNA。4、根据权利要求l、2或3所述的方法，其中多核苷酸的第一和第二群体是单链的。5、根据上述权利要求的任一项所述的方法，其中多核苷酸的第一群体由母多核苷酸序列的正链组成，多核苷酸的第二群体由母多核苷酸序列的负链组成。6、根据上述权利要求的任一项所述的方法，其中将多核苷酸的第一和第二群体单独地在步骤(b)中进行消化。7、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(b)中的核苷酸酶是外切核酸酶。8、根据权利要求7所述的方法，其中外切核酸酶选自BAL31、外切核酸酶I、外切核酸酶V、外切核酸酶VII、外切核酸酶T7基因6、细菌噬菌体A外切核酸酶或外切核酸酶RecJf。9、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤(d)中生产的至少一条多核苷酸序列的改变的氨基酸序列与编码的多肽的改变的性质相关。10、根据权利要求4到9任一项所述的方法，其中在步骤(b)之前或在步骤(b)中加入具有预决的变异性的寡核苷酸，且其中核酸酶特异于单链多核苷酸。11、根据权利要求1到9任一项所述的方法，其中在步骤(b)后步骤(c)前加入具有预决的变异性的寡核苷酸。12、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸与母多核苷酸序列的内部序列分享至少90%的序列同一性，例如至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。13、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸与母多核苷酸序列的内部序列分享100%的序列同一性。14、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸具有单条核苷酸序列。15、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸具有至少两条不同的序列。16、根据权利要求15所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸是母多核苷酸序列的相同内部序列的变体。17、根据权利要求15所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸与母多核苷酸的至少两个不同区域分享100%序列同一性或是其变体。18、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中通过易错PCR或使用寡核苷酸合成仪生产具有预决的变异性的寡核苷酸。19、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸的长度介于10和500个核苷酸间。20、根据权利要求19所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸的长度介于50和200个核苷酸间。21、根据权利要求1到20任一项所述的方法，其中母多核苷酸序列编码配体。22、根据权利要求21所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸同编码与生物分子直接或间接作用的氨基酸序列的母多核苷酸序列的区域分享序列同一性，或是所述母多核苷酸序列的区域的变体。23、根据权利要求l到20任一项所述的方法，其中母多核苷酸序列编码抗体或抗体片段。24、根据权利要求23所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸同编码框架多肽的母多核苷酸序列的区域分享序列同一性或是所述母多核苷酸序列的区域的变体。25、根据权利要求23所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸同编码CDR的母多核苷酸序列的区域分享序列同一性或是所述母多核苷酸序列的区域的变体。26、根据权利要求l到20任一项所述的方法，其中母多核苷酸序列编码酶或其催化活性片段。27、根据权利要求26所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸同编码活性位点、调控位点或涉及到酶稳定性中的区域的母多核苷酸序列的区域分享序列同一性或是所述母多核苷酸序列的区域的变体。28、根据权利要求l到20任一项所述的方法，其中母多核苷酸序列编码抗原。29、根据权利要求28所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸同编码表位的母多核苷酸序列的区域分享序列同一性或是所述母多核苷酸序列的区域的变体。30、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(c)进一步包含加入在退火条件下退火到至少母多核苷酸之一的3，和/或5'端的引物序列。31、根据权利要求1到30任一项所述的方法，其中，在步骤(b)，用于消化多核苷酸分子的第一群体的至少一个反应参数不同于用于消化多核苷酸分子的第二群体的反应的同等的参数。32、根据权利要求31所述的方法，其中反应参数选自核酸酶类型、核酸酶浓度、反应体积、消化反应的持续时间、反应混合物的温度、反应混合物的pH、母多核苷酸序列的长度、母多核苷酸分子的量或反应混合物的缓冲液成分。33、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中将母多核苷酸序列进行诱变。34、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中将在歩骤(b)中产生的片段的一个或两个群体进行诱变。35、根据权利要求33或34所述的方法，其中诱变是易错PCR。36、根据上述权利要求任一项所述的方法，其中进行步骤(b)以产生长度不同的单链片段的群体。37、根据权利要求36所述的方法，其中控制步骤(b)以产生具有超过大约50个核苷酸的平均长度的单链片段的群体。38、根据上述权利要求任一项所述的方法，进一步包括表达步骤(d)中产生的至少一条多核苷酸序列的步骤以生产编码的多肽。39、根据权利要求28所述的方法，进一步包括检测编码的多肽的改变的特性的步骤。40、通过根据权利要求1到39任一项所述的方法获得的或可获得的多核苷酸。41、包含根据权利要求40所述的多个多核苷酸的多核苷酸文库。42、包含根据权利要求40所述的多核苷酸的载体。43、用于制备具有改变的性质的多肽的方法，该方法包含下述步骤(a)使用如权利要求1到39任一项所述的方法产生母多核苷酸的变体形式;(b)表达步骤(a)中生产的变体多核苷酸以生产变体多肽；(c)筛选变体多肽的改变的性质；禾口(d)从变体多肽中选择具有改变的性质的多肽。44、通过根据权利要求43所述的方法获得的或可获得的多肽。45、药物组合物，其包含根据权利要求40所述的多核苷酸或根据权利要求44所述的多肽以及药学上可接受的载体。46、用做药物的如权利要求40所述的多核苷酸或如权利要求44所述的多肽。47、根据权利要求40所述的多核苷酸或根据权利要求44所述的多肽在制备用于处理、治疗和/或诊断疾病的药物中的用途。48、用于制备药物组合物的方法，其包括，经如权利要求1到39任一项所述的方法鉴定具有改变的序列或特性的多核苷酸和/或编码的多肽后，将所述多核苷酸和/或编码的多肽加到药学上可接受的载体中。49、一种方法，其包括，经如权利要求1到39任一项所述的方法鉴定具有改变的序列或特性的多核苷酸和/或编码的多肽后，将该多核苷酸和/或编码的多肽全部或部分用于药物。50、根据权利要求49所述的方法，其中所述的用于药物是用于处理、治疗和/或诊断疾病。51、一种方法，其包括，经如权利要求1到39任一项所述的方法鉴定具有改变的序列的多核苷酸后，将该多核苷酸用于检测和/或扩增样品中的目标多核苷酸。52、基本上如实施例中产生多核苷酸序列或序列群体的方法。53、基本上如实施例中制备具有改变的性质的多肽的方法。全文摘要本发明提供用于从母多核苷酸序列产生多核苷酸序列或序列的群体的方法，该方法包括步骤(a)提供多核苷酸分子的第一群体和多核苷酸分子的第二群体，第一和第二群体共同组成了母多核苷酸序列的正链和负链，(b)用核酸酶消化多核苷酸分子的第一和第二群体以产生多核苷酸片段，(c)将产生自正链的所述多核苷酸片段与产生自负链的片段接触和(d)扩增退火到彼此的片段以产生与母多核苷酸编码的那些氨基酸序列相比较，具有改变的氨基酸序列的一个或更多个蛋白基序，其中通过加入一个或更多个具有预决的变异性的寡核苷酸控制在步骤(d)中生产的至少一条多核苷酸分子的选择区域内的序列变异性程度，该寡核苷酸退火到位于母多核苷酸分子的3′或5′末端核苷酸间但排除3′或5′末端核苷酸的序列。本发明也提供通过本发明的方法获得的多核苷酸及被相同的多核苷酸编码的多肽。文档编号C12N15/10GK101351553SQ200680050127公开日2009年1月21日申请日期2006年11月17日优先权日2005年11月19日发明者A-C·M·哈格尔,C·菲雷布林,F·卡尔松,K·哈拉尔德松,M·卡尔松,P·埃尔马克申请人:鳄鱼生物科学公司