专利名称：酸法结合酶法制备低分子量岩藻聚糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种岩藻聚糖的提取方法，特别是涉及利用酸法结合酶法制备低分子量岩藻聚糖的方法。
背景技术：
岩藻聚糖(Fucoidan)存在于海藻中具有较高生物活性的天然物质，具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、降血糖血脂、调节免疫力、清除活性氧自由基和体内外抗氧化等功效。岩藻聚糖为含有多种单糖和硫酸基的水溶性多糖，分子质量从几万至几十万不等。其特殊的结构和功能引起了不少专家学者的重视。随着多糖抗病毒作用机理研究的不断深入，发现影响多糖活性的因素很多，如多糖的高级结构、侧链的连接位置、分支密度及单糖间糖苷键的结合形式、多糖的聚合度、分子质量以及硫酸根的含量等，均与药理活性有关。
研究表明硫酸多糖的分子量在1000-50000Da，硫酸基在15～20％时生物活性较高。所以通过适当的方法将在减少硫酸基脱落量的同时降低岩藻聚糖的分子量，是岩藻聚糖及其产品开发急待解决的问题。目前报道的岩藻聚糖的降解方法主要有酸解和酶解两种。其中强酸水解反应条件剧烈，很难操作，并且产品需进行除盐操作；而专一性的海藻多糖硫酸酯水解酶价格昂贵，产量小。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、条件温和、产量高、硫酸根脱落率低、成本低的酸法结合酶法制备低分子量岩藻聚糖的方法，该方法可应用于工业化生产。
为实现上述目的，本发明的技术解决方案是本发明是一种酸法结合酶法制备低分子量岩藻聚糖的方法，它包括以下步骤(1)按干海藻与酸之比为1∶8-10的比例加酸，提取2-4小时后，离心收集上清液，加入乙醇溶液至30％-40％饱和度，收集上清液再加入乙醇溶液至70％-80％饱和度，搅拌均匀、静置20分钟沉淀，将溶液离心收集沉淀得岩藻聚糖，冷冻干燥；(2)提取过的岩藻聚糖利用蛋白酶在37℃-45℃和pH＝2～3下除蛋白；(3)加入果胶酶在30℃-45℃温度下加热水解2-3小时；用酸调节至pH值为4-5，放置2-4小时，过滤或离心除去杂质，取上清液；(4)选择截留分子量为1000-5000Da的膜进行超滤浓缩，将浓缩过的溶液装于烧杯中，预冻1-2小时，后放入真空干燥箱中，盖上盖子，调好真空度和温度，温度为-55℃，冷冻干燥一天左右，即得到分子量为1000-5000D的低分子量岩藻聚糖。
步骤(1)中加酸为0.1-0.2N盐酸。
步骤(2)中加蛋白酶为胃蛋白酶。
步骤(3)中所述的酶为果胶酶。
采用上述方案后，本发明采用了商业上的工具酶果胶酶水解粗岩藻聚糖，控制了酶解时间，温度和pH值，并采用截留分子量为1000-5000Da的超滤膜，获得低分子量的岩藻聚糖。具有操作简单、条件温和、产量高、硫酸根脱落率低、成本低等优点，易于工业化生产。
由于本发明采用酸法结合酶法从海藻直接提取低分子量的岩藻聚糖，使岩藻聚糖的提取及低分子量岩藻聚糖的制备能同时进行，简化了工艺流程，提高了生产效率，节约生产费用30％以上。与此同时，整个工艺避免使用有毒有害的化学试剂，制备的产品安全无毒，特别适合于应用于功能食品及药品的生产。
本发明制备的岩藻聚糖具有广阔的药用前景，可应用于治疗乙肝、抗病毒、抗凝血、降血糖血脂、调节免疫力、清除活性氧自由基和体内外抗氧化的海洋药物。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
具体实施例方式
实施例1一种酸法结合酶法制备低分子量岩藻聚糖的方法，包括以下步骤(1)取干海带1000kg按1∶9的比例加酸，提取2小时后，离心收集上清液加入乙醇溶液，至30％饱和度，收集上清液再加入乙醇溶液至70％饱和度搅拌均匀、静置20分钟沉淀，将溶液离心收集沉淀得岩藻聚糖，冷冻干燥。
(2)提取过的岩藻聚糖选择截留分子量为1000Da的膜进行超滤，并利用蛋白酶在37℃和pH＝2～3下除蛋白。得到21g粗岩藻聚糖产品。取岩藻聚糖粗品1g，利用蛋白酶在37℃和pH＝2～3下除蛋白。
(3)加入果胶酶在30℃温度下加热水解2小时；用酸调节至PH值为4，放置2小时，过滤或离心除去杂质，取上清液。
(4)选择截留分子量为5000Da的膜超滤浓缩后的多糖水溶液装于烧杯中，预冻1小时，后放入真空干燥箱中，盖上盖子，调好真空度和温度，温度为-55℃，干燥一天左右，使用冷冻干燥法除去水分得到低分子量岩藻聚糖0.70g。
实施例2一种酸法结合酶法制备低分子量岩藻聚糖的方法，包括以下步骤(1)取干海带1000按1∶10的比例加酸，提取4小时后，离心收集上清液加入乙醇溶液，至40％饱和度，收集上清液再加入乙醇溶液至80％饱和度搅拌均匀、静置20分钟沉淀，将溶液离心收集沉淀得岩藻聚糖，冷冻干燥。
(2)提取过的岩藻聚糖选择截留分子量为5000Da的膜进行超滤，并利用蛋白酶在45℃和pH＝2下除蛋白，得到21g粗岩藻聚糖产品。取岩藻聚糖粗品1g，利用蛋白酶在45℃和pH＝2下除蛋白。
(3)加入果胶酶在45℃温度下加热水解3小时；用酸调节至PH值为5，放置3小时，过滤或离心除去杂质，取上清液。
(4)选择截留分子量为5000Da的膜超滤浓缩后的多糖水溶液装于烧杯中，预冻2小时，后放入真空干燥箱中，盖上盖子，调好真空度和温度，温度为-55℃，干燥一天左右，使用冷冻干燥法除去水分得到低分子量岩藻聚糖。
实施例3(1)取干海带1000kg按1∶8的比例加酸，提取3小时后，离心收集上清液加入乙醇溶液，至35％饱和度，收集上清液再加入乙醇溶液至75％饱和度搅拌均匀、静置20分钟沉淀，将溶液离心收集沉淀得岩藻聚糖，冷冻干燥。
(2)提取过的岩藻聚糖选择截留分子量为1000Da的膜进行超滤，并利用酶在40℃和pH＝2.5下除蛋白，得到粗的岩藻聚糖产品。取岩藻聚糖粗品，利用蛋白酶在40℃和pH＝2.5下除蛋白。
(3)加入果胶酶在35℃温度下加热水解2.5小时；用酸调节至PH值为4.5，放置2.5小时，过滤或离心除去杂质，取上清液。
(4)选择截留分子量为5000Da的膜超滤浓缩后的多糖水溶液装于烧杯中，预冻1.5小时，后放入真空干燥箱中，盖上盖子，调好真空度和温度，温度为-55℃，干燥一天左右，使用冷冻干燥法除去水分得到低分子量岩藻聚糖。
本发明所采用的果胶酶为市售果胶酶(Pectinase)pH4.0，40℃，≥1.0u/mg)。
本发明所用的酸为0.1-0.2N盐酸。所用的蛋白酶为胃蛋白酶。
本发明从海藻中提取制备的低分子量岩藻聚糖产品，经权威部门检验，低分子量岩藻聚糖的含量达到98％以上，采用硫酸钡重量法测得硫酸基含量为20.83％，并保留原有的天然结构及生物活性。
权利要求
1.一种酸法结合酶法制备低分子量岩藻聚糖的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)按干海藻与酸之比为1∶8-10的比例加酸，提取2-4小时后，离心收集上清液，加入乙醇溶液至30％-40％饱和度，收集上清液再加入乙醇溶液至70％-80％饱和度，搅拌均匀、静置20分钟沉淀，将溶液离心收集沉淀得岩藻聚糖，冷冻干燥；(2)提取过的岩藻聚糖利用蛋白酶在37℃-45℃和pH＝2～3下除蛋白；(3)加入果胶酶在30℃-45℃温度下加热水解2-3小时；用酸调节至pH值为4-5，放置2-4小时，过滤或离心除去杂质，取上清液；(4)选择截留分子量为1000-5000Da的膜进行超滤浓缩，将浓缩过的溶液装于烧杯中，预冻1-2小时，后放入真空干燥箱中，盖上盖子，调好真空度和温度，温度为-55℃，冷冻干燥一天左右，即得到分子量为1000-5000D的低分子量岩藻聚糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤(1)中加酸为0.1-0.2N盐酸。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤(2)中加蛋白酶为胃蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的利用海藻制造低分子量岩藻聚糖的方法，其特征在于步骤(3)中所述的酶为果胶酶。
全文摘要
本发明公开了一种酸法结合酶法制造低分子量岩藻聚糖的方法，它采用了商业上的工具酶果胶酶水解粗岩藻聚糖，控制酶解时间，温度和pH值，并采用截留分子量为1000－5000Da的超滤膜，获得低分子量的岩藻聚糖。具有操作简单、条件温和、产量高、硫酸根脱落率低、成本低等优点，易于工业化生产。由于本发明采用酸法结合酶法从海藻直接提取低分子量的岩藻聚糖，使岩藻聚糖的提取及低分子量岩藻聚糖的制备能同时进行，简化了工艺流程，提高了生产效率，节约生产费用30％以上。与此同时，整个工艺避免使用有毒有害的化学试剂，制备的产品安全无毒，特别适合于应用于功能食品及药品的生产。
文档编号C12P19/00GK101020914SQ20071000867
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月7日 优先权日2007年3月7日
发明者吴永沛, 刘明 申请人:集美大学