专利名称：一种灵芝脱氧核糖核酸酶及其提取纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种酶及其提取纯化方法，特别是一 种灵芝脱氧核糖核酸酶及其提取纯化方法，属于生物化学领域。
背景技术：
脱氧核糖核酸酶在核酸代谢过程和基础遗传机制中参
与DNA复制、修复、重组及突变；控制基因表达，参与基因的置换、转 座及重组；作为宿主系统中的重要组分，降解外源核酸分子，同时在免 疫方面也具有重要作用。脱氧核糖核酸酶主要有2种脱氧核糖核酸酶 I，简称DNaseI;脱氧核糖核酸酶II，简称DNaseII。 20世纪60年代末 首先在牛胰腺中发现DNaseI，随后在牛脾和胸腺中发现DNaseII。其中 DNaseI是一种降解双链或单链DNA的核酸内切酶，产生带5'-磷酸末端 的单核苷酸及寡核苷酸。其活性依赖二价金属阳离子，DNaseI的切割位 点是随机分布。另外DNaseI也是一种重要的分子生物学工具酶，如可用 于切口平移反应，.体外转录模板DNA的分解去除等。
目前己经从多种生物中分离纯化了 DNaseI。尤其是动物的脱 DNaseI研究较为广泛和深入。根据报道已经分离纯化的DNaseI的 分子量都在30-40KD，如入类DNaseI为38kD，牛DNaseI分子量 为31kD，猪DNaseI为34kD。老鼠DNaseI为36kD;蛇DNaseI 为40kD;鱼DNaseI为33kD。
目前用于分离脱氧核糖核酸酶的方法有多种。主要通过离子 交换层析，疏水柱层析和亲和层析。分离介质有DEAE-Sepharose， Phenyl Sepharose， Sephadex G-75, Con Aagarose resins。 其中较常 用的Phenyl Sepharose为疏水柱层析。近年来，发展了一些新的分 离介质用于脱氧核糖'核酸酶的分'离。例如采用.DEAE cellulose, Double-stranded DNA cellulose禾n AF扁Blue TOYOPEARL层析从C
"V7WM"'.中分离纯化了一种斬的脱氧核糖核酸酶；采用.
DEAE-cellulose， phenyl-Sepbar6se， Source 15Q从海星中分离了 一禾中脱氧核丰唐核酸酶；采用concanavalin A禾卩wheatgerm agglutinin
两种凝集素混合制备的亲和层析柱一步法纯化了兔子、鼠等的脱 氧核糖核酸酶I。发明内容本发明的目的是提供灵芝子实体中的一种脱氧核糖核 酸酶及其提取纯化方法。该酶的提取纯化方法也可用于分离提纯其它食 用菌、药用菌子实体中的脱氧核糖核酸酶。
本发明的一种灵芝脱氧核糖核酸酶的特征为
1) 采用美国ABI公司的MALDI-TOF， Voyager DE-STR测定，
其精确分子量为'13807Da。.
2) 将纯化的灵芝脱氧核糖核酸酶经电转印至PVDF膜上，采用 Edman降解法，在美国ABI公司的Procise491型蛋白测序仪上测定， 其N-端的氨基酸序列为PLDTGRYHIY。
3) 用胰蛋白酶酶解后，'采用美国ABI公司的4700串联飞行时间 质谱仪质谱分析结果表明，具有QVETVVDRLDELPIR和 ESPGLQGVSSVPLR商个肽段。
一种灵芝脱氧核糖核酸酶的提取纯化方法，以新鲜灵芝子实体为原 料，经干燥处理后粉碎，保存备用；具体提取方法经粗酶抽提、(NH4)2S04 盐析后，再由以下步骤完成
1) Blue-SepHarose 6 Fast Flow.亲和层析，以含有0 1moL.L"NaCl梯度 洗脱，流速为20-60mL/h;.
2) SP Sephorose Fast Flow柱层析，.以0 0.3MNaCl梯度洗脱，流速为 20-40mL/h;
该灵芝脱氧核糖核酸酶是一种非限制性内切酶，.可作用于超螺旋 DNA，线状DNA， ssDNA利dsDNA，是一种非限制性内切酶。其酶活 性依赖于二价金属阳离子Mg、 lOmmoL丄.1 EDTA可完全抑制其酶活 性。最适pH值范围为pH,7.5 pH9.0，在15'C条件下，就具有酶活性， 可以将超螺旋DNA切割成环状DNA，并进一步切割成线状DNA形式。 其活性随温度增高，酶活性增加，4CTC时相对活性最高。在75'C条件下 加热15min后完全丧失活性。灵芝脱氧核糖核酸酶水解DNA的产物末 端的基团为3' -OH， 5'-磷酸。
本发明的优点与'积极效果
,1)首次从灵芝中分离纯化出一种新的脱氧核糖核酸酶，该方 法具有快速提纯脱氧核糖核酸酶的特点，纯度高，能保持较高的 酶活性。2)通过本发明方法所提取'的具有酶活性的脱氧核糖核酸酶， 有良好的应用前景，其一，依据此氨基酸序列进行人工合成和进
一步开发利用。其二'，依据氨基酸序列设计引物，克隆其cDNA，
进一步在原核细胞或真核细胞中表达该酶。其三，用于分子生物 学研究。
图1为灵芝脱氧核糖核酸酶经SP Sephorose Fast Flow柱层析后 的电泳检测图。
其中，l为灵芝脱氧核糖核酸酶；2为蛋白标准分子量。
具体实施例 为充分公开本发明的一种灵芝脱氧核糖核酸酶及 其提取纯化方法，现结合具体实施例加以说明。
实施例"种灵芝脱氧核糖核酸酶的提取纯化方法，包括以下歩骤:
(1) 样品前处理鲜灵芝经冷冻干燥后粉碎，'取冻干粉加入15倍
体积的0.02moL'L"pH6.2的磷酸缓冲液，4。C浸提16h，然后离心12000 Xg， 20min，获得上清液A;
(2) 硫酸铵盐析在上清液A中加入(NH4)2S04粉末，0。C条件下 边加边搅拌至80%饱和度，，待全部溶解后，4"C静置6h， 12000Xg， 4 °C离心20 min，收集沉淀，并用蒸熘水透析除盐后再用0.02moL丄" pH7.5的Tris-HCl进行充分透析平衡，12000Xg， 4"C离心5min，得到溶
液B;
(3) Blue-SepHarose 6FastFlow层析将所述的溶液B，通过蠕动 泵使流速为0.2mL/min;上到预先用0.02moL'L-1 pH7.5的Tris-HC1 缓冲液平衡好的亲和层析介质中；洗脱至A達0.002，用含0 1 moL'U'NaCl的O.OSmoL'L-1 pH7.5的Tris-HCl梯度洗脱,，洗脱体积为 10倍的柱体积，流速为20-60mL/h，测定OD，，收集洗脱峰；经PEG20000 浓縮至l/5体积，然后再用0.02moLL"pH5.8的磷酸缓冲液平衡，得 到溶液C;
(4) SP Sephorose Fast Flow层析将所述的溶液C加入用 0.02moL丄"pH5.8的磷酸缓冲液平衡好的SP Sephorose Fast Flow中，洗 脱至A280<0.02;然后，以含0 0.3 moL'L"NaCl的0.02moL丄"pH5.8的
磷酸缓冲液梯度洗脱，j先脱体积为10倍的柱体积，流速40mL/h;测定OD28。，收集有酶活性的洗脱液，即洗脱液D;
(5) 超滤浓縮所述洗脱液D至所需的酶活性，即可获得灵芝脱氧核
糖核酸纯酶。
(6) 活性检测其酶反应体系如下表
试剂名称_上样量
^物DNA (ljig卞i;1)
脱氧核糖核酸酶 '10)LiL
10XTris-HCl(0.2M ,pH8.0) 2pL
Mg2+(0.2mM) 12. 5|iL
蒸馏水_____71. 5|iL
H雨 f^j57—
37卩水浴30min。加入等体积的10%的三氯乙酸终止反应，冰上10min,12 OOOrpm， 20min。测定上清液体在260nm的吸收值。
酶活单位是在上述条件下，以小牛胸腺DNA为底物，在37。C、pH8.0 的条件下，1分钟内使反应液的260nm吸光度增加0.001所需要的酶量 定义为1个活性单位。
(7)电泳检测电泳检测结果如附图l所示，所提取的灵芝脱氧核 糖核酸为单一 的蛋白质条带。说明经SP Sephorose Fast Flow层析后分 离得到的灵芝脱氧核糖核酸酶中已没有其他杂蛋白组分存在。
该灵芝脱氧核糖核酸酶可作用,于超螺旋DNA，线状DNA， ssDNA 和dsDNA，对ssDNA的活性略高于dsDNA，是一种非限制性内切酶。 其酶活性依赖于二价金属阳离子Mg2+， 10mmoL丄"EDTA可完全抑制其 酶活性。最适pH值范围为pH7.5 pH9.0，最适pH值为8.4。在15'C条 件下，就具有酶活性，4(TC时相对活性最高。在75。C条件下加热15min 后完全丧失活性。该酶水解DNA的产物末端的基团为,3' -OH， 5'-磷 酸。
本发明的一种灵芝脱氧核糖核酸酶具有DNaseI的性质，属于 DNaseI家族的一个成员。从灵芝中提取脱氧核糖核酸酶方法，具有 方法简单、成本低等优点，还可以从其他药用菌或食用菌中获得高纯度 的脱氧核糖核酸酶。从灵芝中提取脱氧核糖核酸酶可用于分子生物学 研究。
权利要求
1、一种灵芝脱氧核糖核酸酶，其特征在于(1)分子量为13807Da；(2)N-端的氨基酸序列为PLDTGRYHIY；(3)具有QVETVVDRLDELPIR和ESPGLQGVSSVPLR两个肽段。
2、 一种灵芝脱氧核糖核酸酶的提取纯化方法，其特征在于包括以下步骤(1) 样品前处理鲜灵芝经冷冻干燥后粉碎，'取冻干粉加入15倍体积的0.02moL丄"pH6.2的磷酸缓冲液，4'C浸提16h，然后离心12000 Xg， 20min，获得上清液A;(2) 硫酸铵盐析在上清液A中加入(NH4)2S04粉末，OX:条件下 边加边搅拌至80%饱和度，'待全部溶解后，4"C静置6h， 12000Xg， 4 °C离心20 min，收集沉淀，并用蒸馏水透析除盐后再用0.02moL-L—
pH7.5的Tris-HCl进行充分透析平衡，12000Xg， 4。C离心5min，得到溶液B;(3) Blue-SepHarose6FastFlow层析将所述的溶液B，通过蠕动 泵使流速为0.2mL/min;上到预先用O.OZmoL.L-1 pH7.5的Tris-HCl缓 冲液平衡好的亲和层析介质中；洗脱至A，0.002，用含0 1 moL丄"NaCl的0.02moL丄"pH7.5的Tris-HCl梯度洗脱，洗脱体积为 10倍的柱体积，流速为20-60mL/h，测定OD28Q，收集洗脱峰；经PEG20000 浓縮至l/5体积，然后再用0.02moL丄"pH5.8的磷酸缓冲液平衡，得 到溶液C;(4) SP Sephorose Fast Flow层析将所述的溶液C加入用 0.02moL'U1 pH5.8的磷酸缓冲液平衡好的SP Sephorose Fast Flow中，洗 脱至A280<0.02;然后，以含0 0.3 moL丄"NaCl的0.02moL丄"pH5.8的磷酸缓冲液梯度洗脱，洗脱体积为IO倍的柱体积，流速40mL/h;测定 OD28Q，收集有酶活性的洗脱液,，即洗脱液D;(5) 超滤浓缩所述洗脱液D至所需的酶活性。
全文摘要
灵芝脱氧核糖核酸酶的分子量为13807Da、N-端氨基酸序列为PLDTGRYHIY、具有QVETVVDRLDELPIR和ESPGLQGVSSVPLR两个肽段。该酶可作用于超螺旋DNA，线状DNA，ssDNA和dsDNA，是一种依赖于二价金属阳离子Mg<sup>2+</sup>的非限制性内切酶，水解DNA的产物末端的基团为3′-OH，5′-磷酸。该酶的提取纯化方法，以新鲜灵芝子实体为原料，经干燥处理后粉碎、粗酶抽提、硫酸铵盐析、亲和层析，梯度洗脱，再用SP Sephorose Fast Flow柱层析，以0～0.3M NaCl梯度洗脱，即可获得灵芝脱氧核糖核酸酶。
文档编号C12N9/22GK101294150SQ20071000891
公开日2008年10月29日 申请日期2007年4月28日 优先权日2007年4月28日
发明者吴祖建, 林奇英, 雯 祝, 谢东扬, 谢联辉 申请人:福建农林大学