专利名称：一种高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫学和乳品制备技术领域，特别是涉及高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法。
背景技术：
免疫球蛋白(immunoglobulin，简称Ig)是人类及高等动物受抗原刺激后体内产生的能与抗原特异性相互作用的一类蛋白质，又称为抗体，普遍存在于哺乳动物的血液、组织液、淋巴液及外分泌物中，是机体免疫系统的一个重要组成部分。免疫球蛋白是所有蛋白质中最不均一的一类蛋白质，根据其理化性质尤其是免疫学性质，可将其分为五类，即IgG，IgA，IgM，IgD及IgE，牛体内以IgG为主。
牛初乳及其功能成分的商品开发可追朔到1958年，芬兰Immuno.Dynami c.Inc与其他公司开始合作研究牛初乳及其组分的生理功能、用量及安全性。在青霉素及其它抗生素出现以前，美国一直将牛初乳作为一种抗病食品。之后随着生物技术的发展，人们发现了牛初乳的许多生理功能(大谷元等，1987；C enturyLabsinev spa tent50 13569)。在美国医学界，明确提出牛初乳是“天然神秘的痊愈剂”。
牛初乳营养成份与人乳相似，免疫因子含量比人初乳更高，免疫球蛋白含量是人初乳的50-100倍，除抗病毒及外来致病原外，还可促进有益菌群生长和营养消化吸收，提高免疫力。牛初乳适用的人群婴幼儿、孕产妇、年长者、糖尿病患者、心血管病人、手术后烧伤患者、亚健康状态人群、爱美一族等(白雪2002)。
90年代以来，我国也陆续开发了一些强化牛初乳免疫球蛋白IgG的食品，如黑龙江完达山食品厂的添加IgG的婴儿配方奶粉，1998年北京牛奶公司利用牛初乳生产的具有IgG活性的巴氏消毒奶“来福乳”和初乳粉。现有的乳品制备中，初乳产品中IgG含量层次差异较大，一般都在3％-20％之间，而且是否具有活性尚值得商榷。
本实验测定了市售脱脂乳粉，加糖乳粉、乳清粉等各种乳粉中IgG的含量，但结果发现用单向免疫扩散法无法测出它们中的IgG的含量，即他们均不含IgG或含量至微，发明内容本发明的目的是提供一种高含量的免疫球蛋白乳清粉制品的制备方法，有效的提高人体的免疫功能，预防疾病的发生。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是一种高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法，包含以下步骤(1)选取原料牛初乳；(2)往上述的牛初乳中添加抗热变性物质；(3)将上述的牛初乳脱脂，再对脱脂后的牛初乳进行沉淀，得到一次乳清液；(4)将上述的一次乳清液进行浓缩，得到二次乳清液；(5)将上述的二次乳清液进行干燥，即得乳清粉；步骤(4)中的浓缩采用等度洗脱超滤浓缩法进行浓缩，即将所述的一次乳清液先进行超滤浓缩，再进行等度洗脱；步骤(5)中的干燥经如下工序，先一次干燥、冻结，再升华二次干燥，最后在真空条件下解析。
在所述的步骤(1)中的牛初乳为健康乳牛分娩后72小时内分泌的乳汁。
所述的牛初乳是在-15℃--25℃中保存的，加工时取出并在室温下融解。
所述的抗热变性物质为蔗糖、磷酸盐，柠檬酸盐中的一种或其任意组合的混合物。
在步骤(3)中的脱脂是在高速冷冻离心机上进行的，该离心机的转速为8000-12000转/分，温度为2℃～5℃，离心时间为10分钟-20分钟。
在步骤(3)中的沉淀为对脱脂后的牛初乳中的酪蛋白进行沉淀，该沉淀包括如下工序将脱脂后的牛初乳的pH值调节为5-6后，再在高速冷冻离心机上完成沉淀工序， 该离心机的转速为8000-12000转/分，温度为2℃-5℃，离心时间为15分钟-25分钟。
在步骤(4)中的超滤浓缩是在超滤仪上完成的，其过程分为两步，首先选择40-60kDa膜进行超滤，然后用5-15kDa膜对滤出液进行截留。
在步骤(4)和步骤(5)还设有检测所述的二次乳清液中免疫球蛋白的分离纯度的步骤。
所述的检测免疫球蛋白的分离纯度是用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术来检测的。
在步骤(5)中的冻结时，冻结温度为-30℃---40℃，冻结时间为1.5～2.5个小时。
在步骤(5)中对二次乳清液的升华干燥是在冷冻干燥设备中进行，所述的升华干燥包括如下工序，首先将冷冻干燥设备降温至并维持在-35℃--40℃之间，再对设备的干燥室抽真空，使真空度达40-50Pa，然后加热升华6-7小时。
在步骤(5)中的解析是在热解析装置中进行，该热解析装置的解析温度为35℃～45℃，解析时间为6.5～7.5个小时。
本发明与现有技术相比具有如下优点1.本发明的乳品中免疫球蛋白的含量显著高于其他乳粉，因此有更强的提高免疫力的功能。
2.本发明的方法中，用等度洗脱超滤浓缩法分离免疫球蛋白IgG，确保了乳品中免疫球蛋白IgG的高含量和高纯度。
3.本发明的实用性强，操作简单，步骤清楚，能适应大批量的生产的需要为表明用本发明方法制备的高含量免疫球蛋白乳清粉制品有显著的提高免疫力的功能，进行动物实验，过程如下取615近交系雌性小鼠27只(购自中国医科大学动物实验中心)。称重后，取体重在21-24克的小鼠，随机分成9组，每组3只，使各组之间体重差异不显著。然后随机放到9个位置上，随机抽出3组作为饮用组(I)，之后再随机抽出3组作为注射组(II)，剩余的3组作为对照组(III)，这样可以使环境无差异。饮用组小鼠每天每只饮用1ml乳清粉末溶液(0.2克乳清粉末，免疫球蛋白IgG的含量在40％左右)，注射组小鼠每天腹腔注射0.1ml乳清粉末溶液，每天下午3:00给小鼠饮用和注射IgG乳清粉末溶液。实验时间为30天。实验期间，小鼠自由进食和饮水。
实验30天后，立即开始免疫力测试实验，包括小鼠外周T淋巴细胞酶标记染色法(影响细胞免疫功能的实验方法)，鸡红细胞作免疫原的溶血素(摘眼球取血)测定法，腹腔巨噬细胞功能测定法(影响体液免疫功能的实验方法)，免疫器官(脾脏)称重共四项试验。
实验结果分析如下，(一)对小鼠细胞免疫功能的影响结果见表19，给小鼠饮用IgG后，T淋巴细胞所占的百分率明显提高，注射组与对照组比较差异极显著(P≤0.01)，说明口服牛初乳中的IgG可以明显促进小鼠细胞免疫功能。注射组与对照组比较差异也极显著(P≤0.01)，说明注射IgG也可以促进小鼠细胞免疫功能。
表19IgG对小鼠T淋巴细胞百分含量的影响Table 19 effect of IgG on the percemtage coaleat of Tlymphocyte of mice
(二)对小鼠体液免疫功能的影响结果见表20，给小鼠饮用IgG后，光密度值明显提高，说明血清溶血素明显提高，注射组与对照组比较差异极显著(P≤0.01)，说明口服液牛初乳中的IgG可以明显促进小鼠体液免疫功能。注射组与对照组比较差异也极显著(P≤0.01)，说明注射IgG也可以促进小鼠体液免疫功能。
表20Igc对小鼠溶血素生成量的影响Table 20 effect of IgG on productiom of hemoly sin of mlce
(三)对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响结果见表21，给小鼠饮用IgG后，镜检发现，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率明显提高，注射组与对照组比较差异极显著(P≤0.01)，说明口服牛初乳中的IgG可以有效促进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。注射组与对照组比较差异也极显著(P≤0.01)，说明注射IgG也可以促进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。
表21IgG对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响Table 21effect of IgG on phaging function of abdominal in mice
(四)对小鼠免疫器官(脾)重量的影响结果见表22，给小鼠饮用和注射IgG都增加小鼠的免疫器官(脾)的重量，饮用组与对照组相比差异显著(P≤0.05)，但注射组与对照组相比差异不显著(P＞0.05)表22IgG对小鼠脾重的影响Table 22 effect of IgG on spleen weight of mice
注实验过程中注射组有一只小鼠死亡。
分析原因如下1、由于小鼠每天进行一次腹腔注射，对小鼠刺激较大，可能是应激过大而死。
2、小鼠购进时，由于条件有限，室内温度没有达到20度。
3、操作过程中可能不当，引起小鼠死亡。
(五)小结本实验用高含量免疫球蛋白IgG乳清粉喂养小鼠后，其T淋巴细胞、光密度值(能促进血清容血素)、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率均比在相同环境下不喂IgG乳清粉的小鼠明显增加，对小鼠的免疫器官(脾)也有增加但是效果不明显。这也充分证明了IgG乳清粉有促进小鼠的生长发育，增加小鼠的免疫功能。实验结果表明，实验II组的T淋巴细胞百分率、光密度腹巨噬细胞吞噬率、脾较实验III有比较显著的提高。IgG乳清粉的主要成分IgG能增强免疫作用。因其均含有增强免疫机能的有效活性成分。本实验中实验二组同对照组相比，T淋巴细胞百分率、光密度、腹腔巨噬细胞吞噬率均有极显著差异(p＜0.01)，说明该物质具有提高机体免疫作用。同时能促进脾细胞增生，这也许是提高机体免疫机能的途径之一。
具体实施例下面详述一个按照本发明方法制备高含量的免疫球蛋白乳清粉的具体过程(1)将健康乳牛分娩后72小时内分泌的新鲜乳汁置于-17℃冰箱中保存，加工时取出在室温下缓慢融解，以避免初乳丧失生物活性。
(2)在牛初乳中添加抗热变性物质-柠檬酸钠、磷酸钠、蔗糖其中，柠檬酸钠的摩尔浓度为200mmol/l，磷酸钠的摩尔浓度为100mmol/l，蔗糖的质量含量为15％，添加抗热变性物质以改善牛初乳的热稳定性；(3)将上述的牛初乳脱脂，整个脱脂过程采用高速冷冻离心机，在4℃，10000转/分情况下离心15分钟。离心后发现下层出现微红色沉淀物，考虑因为采样时间较早，最下层应为血红胞和大分子物质。接着对脱脂后的牛初乳进行加工以沉淀其中的酪蛋白，先将其pH值调至4.5，离心机的转速为10000转/分，温度为4℃，离心时间为20分钟，酪蛋白就可以离心下来，得到一次乳清液；(4)将上述的一次乳清液进行超滤浓缩，是在超滤仪上完成的，其过程分为两步，首先选择40-60kDa膜对乳清液进行超滤，然后用5-15kDa膜对滤出液进行截留，再对截留液等度洗脱，得到二次乳清夜；(5)用不连续垂直板状聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测试等度洗脱法超滤浓缩后二次乳清夜中免疫球蛋白的分离纯度，经测定，乳液中免疫球蛋白含量为50％；(6)将免疫球蛋白IgG乳液装入干燥瓶，于-35℃的温度下冻结2个小时后，再将补水器降温至并维持在-40℃之间，再对干燥室抽真空，使真空度达45Pa，然后供热，为乳液补进升华热，7小时后，大部分水会以冰晶的形式除去，接着40℃下高真空度解吸7小时后，出料封口，成品包装，入库。
权利要求
1.一种高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法，包含以下步骤(1)选取原料牛初乳；(2)往上述的牛初乳中添加抗热变性物质；(3)将上述的牛初乳脱脂，再对脱脂后的牛初乳进行沉淀，得到一次乳清液；(4)将上述的一次乳清液进行浓缩，得到二次乳清液；(5)将上述的二次乳清液进行干燥，即得乳清粉；其特征在于步骤(4)中的浓缩采用等度洗脱超滤浓缩法进行浓缩，即将所述的一次乳清液先进行超滤浓缩，再进行等度洗脱；步骤(5)中的干燥经如下工序，先一次干燥、冻结，再升华二次干燥，最后在真空条件下解析。
2.根据权利要求1所述的一种高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法，其特征在于在所述的步骤(1)中的牛初乳为健康乳牛分娩后72小时内分泌的乳汁。
3.根据权利要求2所述的一种高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法，其特征在于所述的牛初乳是在-15℃--25℃中保存的，加工时取出并在室温下融解。
4.根据权利要求1所述的一种高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法，其特征在于所述的抗热变性物质为蔗糖、磷酸盐，柠檬酸盐中的一种或其任意组合的混合物。
5.根据权利要求1所述的一种高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法，其特征在于在步骤(3)中的脱脂是在高速冷冻离心机上进行的，该离心机的转速为8000-12000转/分，温度为2℃～5℃，离心时间为10分钟-20分钟。
6.根据权利要求1所述的一种高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法，其特征在于在步骤(3)中的沉淀为对脱脂后的牛初乳中的酪蛋白进行沉淀，该沉淀包括如下工序将脱脂后的牛初乳的pH值调节为5-6后，再在高速冷冻离心机上完成沉淀工序，该离心机的转速为8000-12000转/分，温度为2℃-5℃，离心时间为15分钟-25分钟。
7.根据权利要求1所述的一种高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法，其特征在于在步骤(4)中的超滤浓缩是在超滤仪上完成的，其过程分为两步，首先选择40-60kDa膜进行超滤，然后用5-15kDa膜对滤出液进行截留。
8.根据权利要求1所述的一种高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法，其特征在于在步骤(4)和步骤(5)还设有检测所述的二次乳清液中免疫球蛋白的分离纯度的步骤。
9.根据权利要求8所述的一种高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法，其特征在于所述的检测免疫球蛋白的分离纯度是用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术来检测的。
10.根据权利要求1所述的一种高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法，其特征在于在步骤(5)中的冻结时，冻结温度为-30℃-- -40℃，冻结时间为1.5～2.5个小时。
11.根据权利要求1所述的一种高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法，其特征在于在步骤(5)中对二次乳清液的升华干燥是在冷冻干燥设备中进行，所述的升华干燥包括如下工序，首先将冷冻干燥设备降温至并维持在-35℃--40℃之间，再对设备的干燥室抽真空，使真空度达40-50Pa，然后加热升华6-7小时。
12.根据权利要求1所述的一种高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法，其特征在于在步骤(5)中的解析是在热解析装置中进行，该热解析装置的解析温度为35℃～45℃，解析时间为6.5～7.5个小时。
全文摘要
本发明涉及一种高含量免疫球蛋白乳清粉的制备方法，其具体步骤为首先将牛初乳进行热稳定性的改善，然后脱脂，再沉淀酪蛋白后，用等度洗脱法超滤浓缩乳清中的免疫球蛋白，确立工艺条件，接着用电泳技术测试超滤浓缩后的免疫球蛋白的分离纯度，然后用真空冷冻干燥方法使免疫球蛋白IgG乳清变成乳粉，即可包装入库。高含量免疫球蛋白乳清粉的免疫力测试是对小鼠进行的，测试结果分析得出，采用本发明制备得乳清粉中免疫球蛋白的有效含量达50％以上，能有效的提高免疫功能，预防疾病的发生。
文档编号A23L1/29GK101019580SQ20071002027
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月12日 优先权日2007年3月12日
发明者张志成 申请人:苏州科牧动物药品有限公司