专利名称：泛酸激酶药物筛选模型及其应用的制作方法
泛酸激酶药物筛选模型及其应用
所属领域
本发明涉及大肠杆菌泛酸激酶药物筛选模型，特别是涉及以不同的外源性泛酸激酶取代 大肠杆菌自身泛酸激酶的模型，以及利用该模型筛选泛酸激酶靶向药物中的应用。
背景技术：
辅酶A (CoA)是所有生物有机体维持生命活动的一个重要辅助因子，在生命代谢中主 要参与酰基化反应。具体地说，辅酶A参与体内糖分解、脂肪酸氧化与合成、氨基酸分解、 丙酮酸降解及柠檬酸循环等一百多种合成与降解的代谢反应。在大肠杆菌(￡. co//)内的辅酶 A的生物合成途径中,泛酸激酶(PanK)催化的泛酸磷酸化步骤是整个合成途径的限速步骤。
在酰基转移过程中，辅酶A可循环使用，但新分化的细胞则需要有新的辅酶A参与。因此， 如果抑制了辅酶A的合成途径，便可能阻碍细胞分化、抑制新细胞生成，或者完全阻止细胞 生长，并导致细胞死亡。因此，这一特性为开发针对某种生物体的特异性抑制性药物提供了 可能性。
泛酸(也称为维生素Bs)是一种自然界广泛存在的B族维生素。泛酸在发酵、呼吸、糖 原储存等代谢中也起重要作用(Williams R J, Mosher W A and Rohrmann E. ， The Importance of Pantothenic Acid in Fermentation, Respiration and Glycogen Storage. Biochem丄1936,30:2036-9)。
据目前所知，几乎所有的生物体都能够利用泛酸来合成辅酶A。从泛酸到辅酶A的合成途径是 普遍存在的，而在这一途径中，泛酸激酶催化的反应是关键性调控歩骤。
目前已克隆、鉴定并纯化了许多物种的泛酸激酶基因。已知泛酸激酶基因的突变或缺失
将使生物体遭受严重后果，例如大肠杆菌ts9的突变菌株可使细胞对温度敏感而停止生长 (Vallari D S and Rock C O. Isolation and characterization of temperature-sensitive pantothenate kinase (coaA) mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol, 1987, 169: 5795-800);小鼠pank2基因的 敲除可引起视网膜的退化和精子缺乏(Brand L A and Strauss E. Characterization of anew pantothenate kinase isoform from Helicobacter pylori. J. Biol. Chem. 2005, 280: 20185-8 );人的 pank2基因突变可弓l发神经退行性疾病(Pantothenate kinase-associated neurodegeneration ， PKAN) (Zhou B, Westaway S K, Levinson B, et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defectiveinHallervorden陽Spatzsyndrome.Nat. Genet. 2001,28: 345-9)。在生物体内，辅酶A合 成途径的通畅是能量持续供应的保证。如果切断了这条途径，生物体就会停止增生甚至死亡。 体外研究发现，辅酶A类似物能够有效地抑制那些需要辅酶A参与反应的酶的活性。但这 些类似物往往不能够被跨膜转运吸收，因此不能被用做抑制类药物。泛酸激酶是辅酶A合成途径中的第一个酶，也是对该途径的调控酶，它的底物泛酸分子量很小，而且很容易被跨膜 吸收。另外，泛酸激酶在进化上功能保守，而且序列高度分化，原核和真核的基因序列几乎 没有同源性。因此，泛酸激酶有可能作为一个潜在的药物靶点。我们有可能利用泛酸的结构 类似物与泛酸激酶直接作用(竞争性或非竞争性)，抑制其催化活性，从而直接阻断辅酶A 合成途径；也可以筛选那些进入辅酶A合成途径后生成辅酶A的类似物的化合物，使它们抑制 辅酶A参与的各种代谢反应，进而达到抑制细胞生长的目的。
因此，泛酸激酶是一个很好的药物靶点，有可能用来开发某些抑制不同细胞或生物体生 长的药物，例如，可以筛选抑制微生物，寄生虫，有害昆虫的药物。另外，由于泛酸会被跨 膜转运吸收，所以也有可能方便地利用泛酸的结构类似物(如N-戊基泛酸胺等)参与辅酶A 合成反应，生成辅酶A的衍生物，竞争性地抑制辅酶A的合成。
发明内容
本发明涉及大肠杆菌药物筛选模型，特别是涉及不同物种的外源泛酸激酶表达模型，以 及该模型在药物筛选泛酸激酶靶向药物中的应用。
发明的一个目的是提供一个方便有效的药物筛选模型，从而为大规模的寻找特异性泛酸 激酶抑制剂或抗代谢物(antimetabolite)提供可能性。
本发明中所指特异性泛酸激酶抑制剂包括泛酸激酶抑制剂以及泛酸激酶抗代谢物。
大肠杆菌是我们建立快速筛选模型的首选模式生物。为了制备本发明的模型，我们利 用遗传学的方法，构建携带不同物种泛酸激酶基因的质粒，转入大肠杆菌宿主中以互补替代 大肠杆菌中有缺陷的泛酸激酶基因(coa4/)。这样我们就可以使它们成为具有相同背景(都 来自于大肠杆菌，并分别携带来源于不同物种的泛酸激酶基因)的一系列菌株。用所得到的 这些模型菌株筛选化合物，那么筛选到的有特异性的抑制性化合物便是泛酸激酶靶向的，即 作用于辅酶A合成途径的。
由于泛酸激酶是一个不可缺少的代谢关键酶，因此该基因的敲除将是致死的。在大肠 杆菌中，有一类突变型菌株，它们在30'C下能正常生长，但在37'C或者42"C下表现为温度敏 感(Temperature Sensitive)而不能生长。1987年，Vallari等人测定了温度敏感型突变菌株 DV53(coaA15)的细胞粗提物中泛酸激酶的活性，并且与带有正常coaA基因的菌株DV5进 行了比较。结果发现，在30'C下，DV53 (coaA15)的粗提物与正常的DV5粗提物相比，只 有少于20%的泛酸激酶活性，但这些活性仍然可以使DV53 (coaA15)正常生长；当温度升 至42。C时，DV53 (coaA15)的粗提物的泛酸激酶活性只有不到l % (Vallari D S and Rock C O. Isolation and characterization of temperature-sensitive pantothenate kinase (coaA) mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol, 1987, 169: 5795-800)。由此我们得到了一个启示可以在温度敏感型的大肠杆菌突变株中转入携带外源泛酸激 酶的质粒，然后在37。C或42。C下进行化合物的筛选。这样我们就可以免去敲除以及验证的步 骤，达到快速筛选有用化合物的目的。
在我们的实验中，将用已知的泛酸激酶基因，通过序列比对，寻找一些有研究价值的潜 在的泛酸激酶。将这些已知的或未知的泛酸激酶基因一起，应用于我们的模型。
一方面，我 们可以通过基因的功能互补证明我们所找到的潜在的泛酸激酶是真的泛酸激酶；另一方面， 也可以检测大肠杆菌快速筛选模型设想的可行性以及实用性。
大肠杆菌的泛酸激酶是目前研究最多的，它的结构和功能也都已知。我们用它的蛋白
序列(GenBank Accession No. NP—418405，为方便起见，我们将其命名为&PanK )在NCBI 数据库中进行BLAST检索，以寻找同源泛酸激酶。BLAST得到的结果大部分是原核生物的 泛酸激酶，我们从中选取流感嗜血杆菌的泛酸激酶(///PanK)和结核分枝杆菌的泛酸激酶 (MfPanK)两种泛酸激酶进行下一步的研究，它们与&PanK分别具有77%和70%的相似性。 在所得的结果中，我们没有发现面包酵母(S. "^WW"e )泛酸激酶。这说明原核生物
和真核生物的泛酸激酶氨基酸序列差别很大。于是，我们用已知的真核生物泛酸激酶蛋白序 歹ij，即人的泛酸激酶hPANK2 (GenBank Accession No. DAA00004)在NCBI的数据库中检索， 发现面包酵母的YDR531Wp(GenBank Accession No. NPJ)10820，命名为5"cPanK )与hPANK2 有很高的同源性。之后，我们用&PanK的序列进行BLAST，找到了果蝇(D. we/a"ogarfw) 的泛酸激酶AmWe (GenBank Accession No. NP—620550，我们命名为dPanK)。另外在疟原虫 尸/a雄o&画/a/c/pan/w3D7基因组数据库中做BLAST，进一步发现了恶性疟原虫(尸. /a/c^anw7)中的潜在泛酸激酶(GenBank Accession No. AAN36812,命名为户yPanK)。
我们对大肠杆菌(￡. co//)，流感嗜血杆菌(H /"/7we"加e)，结核分枝杆菌(M ft/6en:w/a '>s )，面包酵母(5". cwev^/ae )，恶性症原虫(尸./a/";paraw)、果虫虽(M Aosopfe7flf) 以及人(//. w/"'ew )等七种物种的泛酸激酶进行了进化关系和同源性分析(参见图1和2)。
结果可见，原核生物泛酸激酶在进化上相对比较接近，而真核生物泛酸激酶进化上则相 差较远。另外，真核生物之间也是高度分化的。这一特性为我们寻找特异性抑制剂提供了可 能性。例如，某化合物能够特异性地抑制某原核有害生物的生长，而对真核生物尤其是人无 害，那么它就有希望成为一种新的针对某原核生物体的抗生素。另外，如果某种化合物能够 抑制或杀死某生物体内的真菌，那么它就有可能成为该生物体的杀真菌药物。
此外，我们还进行了多序列的同源比较(图2)。序列同源性百分比表示为黑色100%，
深灰色80%，浅灰色60X。首先用CLUSTALXv1.83程序进行计算，然后导入GeneDoc v2.6.02
进行编辑调整。因此，经过以上的序列分析，我们选取了五个不同生物体的有代表性的泛酸
激酶，用于进一步的研究。它们是
五cPanK (已经被深入研究，可作为阳性对照)；历PanK和MWanK (这两者都是致病菌，比较有研究价值)； ScPanK (可作为真核生物泛酸激酶的代表)；
PyPanK (这是一个有争议的基因，恶性疟原虫作为一种寄生虫，是否带有泛酸激酶至 今还没有定论)。
如前所述，使用基因敲除的方法来建立模型会很繁琐的，但我们发现有某些温度敏感型 突变菌株的存在，并且它们的温度敏感型在丰富培养基的条件下是由EcPanK (coa4)的突变 引起的。这样就为我们当初设想的通过基因互补建立模型提供了现成的菌株。检测细胞粗提 物中的泛酸激酶的方法可参见Vallari et al., Isolation and characterization of temperature-sensitive pantothenate kinase (coaA) mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol. 1987, 169: 5795-800。
我们将选出的五个泛酸激酶基因分别构建到大肠杆菌的表达载体中。所有构建的质粒均 经过酶切验证，证明所有克隆的质粒都是正确的，并且均不带有突变位点。至此，我们成功 构建了5个质粒，分别命名为;xEcPanK， ； ///PanK， pM;fPanK， /AScPanK禾口;xP/PanK。
本发明中所使用的即是大肠杆菌温度敏感型突变株ts9(/eW6yTwf toc}7 to-/ g/"r"^S」 ga/-6^4M-/^G7(7^」wgG6 r戸丄9 wa/77fZawi ; ;c_yW7w"S7 coaJ7 //w-7)(由耶鲁大学的 大肠杆菌遗传贮藏中心(E.co/;'Genetic Stock Center, Yale University)提供)。在丰富培养基的 条件下，ts9能够在3(TC下正常生长，但在37'C时则不能生长。测序结果发现，其突变是由coa4 基因内的一个点突变引起的(C706T)，该基因突变它引起的蛋白序列变化是L236F (ChenX, Shen D and Zhou B. Analysis of the temperature-sensitive mutation of Escherichia coli pantothenate kinase reveals YbjN as a possible protein stabilizer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006)。该等位基因被称为coa47。
我们将如上构建的质粒分别转入ts9突变株中，使外源泛酸激酶在ts9中表达，功能互补有 缺陷的okl47，使其在37'C下能够正常生长。由于ts9本身的co"7有缺陷，故所表达的蛋白质 在37'C时活性很差(体外实验证明在39'C时已完全没有活性)，因此，我们可以认为在37。C 时起作用的绝大部分是外源表达的泛酸激酶。
五cPanK，所PanK， MfPanK和&PanK能够功能互补ts9的缺陷型coa47，使其在37。C下能 够正常生长，说明我们所克隆的基因确实是泛酸激酶基因。
对流感嗜血杆菌泛酸激酶，实验中发现，ts9中转入p/Z/PanK后，菌株生长较差。这可能 有两种情况 一是流感嗜血杆菌的泛酸激酶和大肠杆菌的泛酸激酶互补不完全；二是与流感 嗜血杆菌泛酸激酶蛋白在ts9中产生毒性有关。
本发明人成功克隆了5个泛酸激酶基因,即p五cPanK、 p历PanK， pA^PanK， p&PanK禾口 p尸yPanK。将它们转入大肠杆菌突变株ts9后，前四者能够功能互补ts9的缺陷基因co^47 ，使 它能在37'C正常生长；但pPyPanK不能功能互补。经过进一步的研究证明，这可能和/yPanK 含有大量大肠杆菌的稀有密码子，在转入ts9后不能顺利表达有关。
为了证明本发明建立的模型是否成功，我们观察了大肠杆菌转入不同的外源泛酸激酶基因后，对不同的化合物产生的不同反应。结果证明，使用本发明的大肠杆菌模型，确实可 以通过分析某些对泛酸激酶途径具有不同作用的天然或合成化合物的活性，来寻找和筛选特 异性抑制药物。
建立模型后，我们研究了六种化合物(泛酸的类似物)对相应物种(大肠杆菌、流感 嗜血杆菌和面包酵母)模型的抑制情况。两组数据的比较和分析表明，该模型能够快速正确 地给出各种化合物的相对抑制效果。因此，我们的实验为今后克隆更多物种的泛酸激酶、合 成大量的化合物、进行大规模的筛选和研发有效的泛酸激酶靶药物提供了可能性。
为了验证本发明的泛酸激酶药物筛选模型的可应用性，我们选择下列泛酸的结构类似 物作为待试化合物D-泛酸(D-pantothenicacid) ， DL-泛磺酰胺(D-pantoyltaurylamide)， D隱泛酰醇(D-panthenol)和DL-泛酰醇(DL-panthenol)(以上化合物均购自Sigma公司)， 以及N-戊基泛酸酰胺(N-pentylpantothenamide， N5-Pan) 、 N-庚基泛酸酰胺
(N-heptylpantothenamide， N7-Pan)禾卩N-壬基泛酸酰月安(N-nonylpantothenamide， N9-Pan )
(以上化合物由本研究室合成)。
我们评价了同一化合物对不同ts9菌株的抑制效果，进行了横向和纵向比较在横向比较 中，对同一个菌株，它的一切背景都是均一的，所有的不同都是由化合物的不同引起的。而
在纵向比较中，虽然背景基本相同(都是ts9菌株)，但转入的表达质粒会因为携带基因的不
同而导致表达量的不同。
我们建立了泛酸激酶靶向药物快速筛选模型，并且随机选择六种化合物应用于该模型，
得到了关于不同化合物对各个ts9菌株的抑制情况的信息。为了进一歩证实从该模型中得到 的数据是否能真实地反映原物种的真实情况，我们选取了三个物种大肠杆菌DH5a，流感嗜 血杆菌以及面包酵母BY4742分别进行实验，测定添加不同浓度化合物后重组体细胞的生长情 况，并与得自模型的数据进行比较。
结果发现，对于大肠杆菌泛酸激酶而言，模型中所得抑制浓度普遍高于大肠杆菌DH5a， 这可能与p五cPanK在细胞内的表达水平较高有关。但从这两个独立的系统中得出的信息是相 同的，即各种化合物对大肠杆菌的抑制效果为N5-Pan> N7-Pan-N9-Pan> pantoyltaurine= D-panthenol= DL-panthenol 。
对于流感嗜血杆菌泛酸激酶，由于N7-Pan和N9-Pan的溶解性比N5-Pan差，因此对 N7-Pan和N9-Pan而言，从模型中(在平板上操作)得到的抑制浓度比相应物种中(在液体 培养基中操作)得到的抑制浓度稍高。综合考虑这些影响因素，我们认为模型和相应物种得 到的数据仍然是吻合的，即各种化合物对流感嗜血杆菌的抑制效果为N5-Par^ N7-Pan-N9-Pan〉 pantoyltaurine=D-panthenol = DL-panthenol 。
对面包酵母的泛酸激酶，虽然从模型和相应物种得到的数据相对排序相同，即各种化合
物对面包酵母的抑制效果为N5-Pan> N7-Pa论N9-Pan>
D-panthenol-DL-panthenol>pantoyltaurine。但它们的绝对数值差别很大在模型中，N5-Pan对带有pQE-Sc/^"/:的ts9菌株抑制是最强的(5pM时完全抑制)。但在相应的物种面包酵母 BY4742中，浓度到2.5mM以上才发挥抑制作用。我们注意到，酵母的最适生长温度是30'C， 但我们的模型是在37i:下操作的，温度对酶的活性的影响是很大的，因此我们认为，在模型 中，ScPanK足以功能互补ts9中有缺陷的coa47，但由于在37'C是时&PanK处于很不稳定的脆 弱状态， 一旦遇到抑制剂，活性便很容易被阻抑。
由以上的分析可见，本发明的模型能够准确地分析和检测各种化合物的相对抑制效果， 并且这些抑制水平上的区别都是由于所转入的泛酸激酶的不同导致的，这就确保所筛选到的 泛酸激酶抗代谢物或抑制剂，在与泛酸激酶的相互作用后发挥其抑制细胞生长的作用。
本发明的基于泛酸激酶途径的大肠杆菌模型，作为一种药物筛选模型，其使用方便、而 且筛选实验快捷并可靠。特别是，大肠杆菌生长快速，操作简单，使用ts9之后也免除了基 因敲除的步骤。在化合物筛选的过程中，我们往往更关注一些有害病原菌被抑制的情况，比 如我们实验中提到的结核分枝杆菌和恶性疟原虫。作为体外筛选实验，本发明的体内比体外 模型更接近实际情况，所得的数据更加可靠。
因此，如果我们有条件合成大规模的化合物(比如一次合成96种或更多种化合物)，就 可以在96孔板上进行初筛，选用一个浓度(比如5mM )，在这个浓度下能够抑制细胞生长 的候选化合物。例如我们想要寻找抗结核药物，就可以用携带p^^PanK的ts9菌株进行筛选， 测定培养后的细胞OD值，对抑制活最强的化合物进行结核分枝杆菌抑制实验，同时检测这些 化合物对哺乳动物的毒副作用。如果某种化合物能够特异性的抑制结核分枝杆菌，而对哺乳 动物没有任何伤害，那么该化合物便可能成为抗结核菌的候选药物。
图l显示图七种泛酸激酶蛋白的系统进化树。 图2显示七种泛酸激酶序列的同源性比较。
图3显示四种泛酸激酶在大肠杆菌中的表达。A: EcPanK; B:州PanK; C: MfPanK; D: 5bPanK 。其中泳道l:分子量标记，泳道2:诱导前，泳道3:诱导后。 图4显示外源泛酸激酶基因转入ts9突变株后的功能互补试验。 图5显示实验中所用化合物的结构示意图。
图6显示不同化合物对带有不同外源泛酸激酶的ts9菌株的抑制效果。 图7显示所试验的各种化合物对大肠杆菌DH5ot的抑制水平。其中各化合物的代表符号为 DL-pantoyltaurine (☆)， D-panthenol ( )， DL-panthenol(o)， N5-Pan (□)， N7-Pan (T)， andN9-Pan
(▽)。
图8显示所试验的各种化合物对流感嗜血杆菌的抑制水平。其中各化合物的代表号为DL-pantoyltaurine (☆)， D-panthenol ( )， DL-panthenol(o)， N5-Pan(口)， N7-Pan(T)'和N9-Pan
(▽)。
图9显示所试验的各种化合物对面包酵母BY4742的抑制水平。其中各化合物的代表符号 为DL-pantoyltaurine (众)，D-panthenol ( )， DL-panthenol(o)， N5-Pan(口)， N7-Pan(V)， and N9-Pan(V)。
具体实施例方式
下面实施例用于进一歩说明本发明，但不是对本发明保护范围的限制。
实施例l: PanK载体的构建
T叫聚合酶购自Promega公司，内切酶和T4连接酶均购自Takara公司，引物由北京三博 生物技术公司合成。其它化学试剂均是分析纯以上级别。
所有的泛酸激酶基因均从相应物种的基因组DNA中PCR扩增获得，其中&PanK扩增自 大肠杆菌K-12菌株DH5a的基因组DNA;用于扩增/Z/PanK的基因组DNA来自于北京协和医院 分离的流感嗜血杆菌//. /"/7wenzae Rd KW20;
因结核分枝杆菌具有感染性， 一般的实验室条件无法操作，但由于M/PanK的基因序列 和用于疫苗的卡介苗(BCG，最初来源于牛型分枝杆菌M ^v"AF2122/97)的泛酸激酶基因 序列相同，因此该基因是从BCG的基因组DNA中扩增得到的。BCG菌株是由北京大学昌 增益老师实验室馈赠的；&PanK是从面包酵母S. rev/w'"e BY4742 (M4rct WW-A7/ew2-A0 />^-A0wra3-A0)(美国Invitrogen公司)的基因组DNA中获得；尸yPanK扩增自恶性疟原虫 (尸./a/c^ ram) 3D7cDNA (美国加大P. Rosenthal实验室)。
设计引物
(1) 对p五cPanK，我们用BamHI和HindIII两个位点，引物序列为"coaAF-80L": 5'-CGGGATCCagtataaaagagcaaacgttaatg-3' (SEQIDNO: 1)禾口"coaAR陽80L": 5'-CGCCCAAGCTTctcccctgcaaattatttgcg-3' (SEQIDNO: 2)。
(2) 对p历PanK，我们用BamHI和PstI两个位点。引物序列为"HIpankF-80L": 5'-CGGGATCCgaattttcaactcagcaaacacc-3' (SEQIDNO: 3)禾口"HIpankN-80L": 5'-AAAACTGCAGacgtgcgaatttttatt加ttaatt-3' (SEQ ID NO: 4)。实验时发现直接从H /"y we"zae 的DNA做PCR很困难，在琼脂糖凝胶上几乎看不到产物，我们利用了巢式PCR(nestingPCR) 才最终把该基因PCR出来。
(3) 对pM,PanK，我们用BamHI和HindIII两个位点。引物序列为"BCGcoaAF-BamHI-80L": 5'-CGGGATCCtcgcggcttagcgagccga-3' (SEQIDNO: 5)禾口"BCGcoaAR-HindlII-80L": 5'-CGCCCAAGCTTaccgccaattacagcttgcgc-3' (SEQIDNO: 6)。
(4) 对p&PanK，我们也用了BamHI和HindIII两个位点。引物序列为"yPankF-80L-Bamffl":
95'-CGGGATCCccgcgaattactcaagagatat-3' (SEQIDNO: 7)和"yPankR-80L-HindlII": 5'-CGCCCAAGCTTgtgaaatctatctacgtacttg-3， (SEQIDNO: 8)。
(5)对pi^PanK，我们仍然用了BamHI和HindIII两个位点。引物序列为"pfPANKF-80L": 5'-CGGGATCCagaaagtataaaaacgaattaaacatt-3' (SEQIDNO: 9)和"pfPANKR-80L，， 5'-CGCCCAAGCTTcttgagatctacctttttacattg-3， (SEQIDNO: 10)。
由于pQE-80L带有起始密码子ATG，为了在N端加上His6-tag，所有的F端引物均不含 有起始密码子，并且与His6-tag的序列融合。构建质粒的方法按照分子克隆常规方法。
所有构建的质粒均经过酶切验证，测序如果证明，所有克隆的质粒都是正确的，没有突 变位点。至此，我们成功构建了5个质粒，它们分别是p五cPanK， p///PanK， pMtPanK， p&PanK 和p尸yPanK。
实施例2:泛酸激酶的表达和功能互补实验
1、 细胞转化
将如上构建的质粒分别转入ts9突变株中，使外源的泛酸激酶在ts9中表达，功能互补有 缺陷的co"J7，使其在37'C下能够正常生长。由于ts9本身的o)^4/有缺陷，表达的蛋白在37'C 时活性很差(体外实验证明在39'C时己完全没有活性[32])，因此，我们可以认为在37i:时 起作用的绝大部分是外源表达的泛酸激酶。
我们使用常规电转移方法进行质粒转移。将ts9细胞培养至对数中期，OD值为0.5以上， 然后冰浴。4°C， 1000g离心15分钟，倒去培养液，用预冷的无菌去离子水和10%甘油各洗一 次，以降低细胞悬液的离子强度。最后重悬在适量的10%甘油中，使最终的细胞浓度约为2
一3xl0"'细胞/ml，并分装成100pl/管。用于后续的转化。
使用电转仪(Eppendorf公司)，0.2cm电转杯，脉冲电压1250V。脉冲结束后，迅速加 入500pl培养基，并将细胞转移至1.5ml聚乙烯管中，放入3(TC摇床，轻柔振荡l小时。然 后将细胞涂在含氨苄抗生素(100pg/ml )的LB平板上，放入3(TC温箱过夜培养。
共转化了7个质粒，它们分别是p五cPanK， p历PanK， pMrPanK， pScPanK， pPyPanK， pQE-80L和1 ng pUC 18 ，其中1 ng pUC 18是用来测定转化效率的。
2. 功能互补实验
挑取单个菌落，将其重悬在200pl无菌去离子水中，涡悬混匀后10倍稀释，(续四个稀 释度)。6种菌株(pEcPanK， p历PanK， pMfPanK， p&PanK， p尸^PanK和pQE-80L )中每 种菌株挑取6个菌落，进行相同操作，以防假阳性。然后每个稀释度分别取2)al在LB十氨苄 抗生素的平板上，每个稀释度点两个平板， 一个放在30'C温箱培养，作为对照；另一个放在 37'C温箱培养，以检测转入的外源泛酸激酶能否功能互补ts9的coa47，使ts9能在37'C下正常生长(结果参见图4)。
如图4所示，空质粒pQE-80L转入ts9菌株后不能使其在37'C下生长。而转入p五cPanK， p州PanK， pMrPanK和p&PanK均可以使ts9在37。C下」下常生长。五cPanK， ///PanK， MrPanK 和&PanK能够功能互补ts9的缺陷型coa47，使其在37。C下能够正常生长，说明我们所克隆 的基因确实是泛酸激酶基因。
对流感嗜血杆菌泛酸激酶，实验中我们发现，转入pF/PanK后，ts9细胞生长相对较差。 这可能有两种情况 一是流感嗜血杆菌的泛酸激酶和大肠杆菌的泛酸激酶虽然同源性很高， 但它们在执行催化功能时有很大区别，导致功能互补不完全；二是流感嗜血杆菌泛酸激酶蛋 白在ts9中具有毒性，使得它生长缓慢。
至此，我们成功克隆了5个泛酸激酶基因,即p五cPanK， p历PanK， piWifPanK， p&PanK和 p尸/PanK。将它们转入大肠杆菌突变株ts9后，前四者能够功能互补ts9的缺陷基因coo4J，使 它能在37'C正常生长；但pi!/PanK不能功能互补。经过进一歩的研究证明，这可能和/yPanK 含有大量大肠杆菌的稀有密码子，在转入ts9后不能表达有关。由此，我们建立了四种可用 于泛酸激酶靶向的化合物筛选模型，为下一歩的研究做好了准备。
实施例3:候选化合物的合成及模型的应用
如上得到的模型均具有相同的背景(ts9菌株)，所不同的是它们含有不同的外源泛酸 激酶(分别是五cPanK，历PanK， M,PanK和&P肌K)。本实施例中，我们将试验几种己有的 或新合成的化合物，观察它们是否能够抑制各种ts9菌株的生长，并且希望它们对不同的ts9 菌株有不同的抑制浓度。这样， 一方面说明我们建立的模型是成功的，转入不同的外源泛酸 激酶后会对不同的化合物产生不同的反应。 一方面，可以证明泛酸激酶确实是一种重要的和 高度分化的酶，另一方面，不同的抑制浓度为我们寻找特异性抑制药物提供了可能性。
为此，选择七中从市场上购买或自行合成某些泛酸结构类似物，使其分别在进入细胞后 能够作为泛酸激酶的底物并进入辅酶A合成途径，或者直接与泛酸激酶作用，以观察其阻碍 泛酸激酶的活性。
这些化合物包括购自Sigma公司的D-泛酸(D-pantothenic acid) 、 DL-泛磺酰胺 (D-pantoyltaurylamide) ， D-泛酰醇(D-panthenol)和DL-泛酰醇(DL-panthenol)，以及自 己合成的N-戊基泛酸酰胺(N-pentylpantothenamide， N5-Pan) 、 N-庚基泛酸酰胺 (N-heptylpantothenamide， N7隱Pan)禾QN-壬基泛酸酰月安(N-nonylpantothenamide， N9-Pan)
(参见图6)。
60ml泛酸水溶液旋蒸干燥后得到6g泛酸，呈粘性，淡黄色，将其溶于15ml干燥的DMF
中，平均分成三份，每份溶液加入10ml干燥的DMF，在100ml烧瓶中进行反应。在其中一
份溶液中加入1.16ml正戊胺和2.24ml DPPA,用于合成N5-Pan ;另外一份溶液中加入1.48ml
正庚胺和2.24ml DPPA，用于合成N7-Pan ;最后一份溶液中加入1.83ml正壬胺和2.24mlDPPA,用于合成N9-Pan 。反应物冷却到0。C后分别加入1.39ml三乙胺，在0。C搅拌2小时后 在室温下搅拌过夜，得到的产物旋蒸除去DMF，用硅胶柱纯化，洗脱液为120:8:1的二氯甲
烷甲醇氨水。收集含有所需产物的部分并浓縮，得到的白色粉末即为所需产物。
至此，我们共有7种化合物，它们的结构如图5所示。为了统一起见，我们都用5%的 DMSO溶解这些化合物。所选定的筛选浓度梯度为5^M， 50pM， lOOOpM和5000nM。
l配制平板对一种化合物，共需5块平板，为LB十氨苄抗生素(10(^g/ml) +不同浓度的化 合物(0pM， 5|aM， 50|aM， lOOOpM和5000^M)。鉴于0pM浓度的平板对六种化合物可以 共用，并另外再加一个3(TC培养的对照，因此六种化合物一共需26块平板(2块0)nM浓度 化合物的平板+4块含不同浓度化合物的平板x6种化合物=26块平板)。 化合物筛选对每种ts9菌株，挑取单个菌落，将其重悬在200nl无菌去离子水中，涡悬混匀。 然后十倍稀释，连续四个稀释度。每组稀释度各取2pl点在平板上，点成一排，共点26个平 板。除了0pM化合物的一块平板放在30'C温箱过夜培养外，其余均放入37C温箱过夜培养。 结果如图6。
从图6可以看出，D-pantoyltaurine对所有的菌株均无抑制作用。这恰好与己报道的 D-pantoyltaurine不能被泛酸通透酶跨膜转运相符合(Vallari D S and Rock CO. Pantothenate transport in Escherichia coli. J. Bacteriol, 1985, 162: 1156-61)。
由此，我们认为泛酸酰胺类化合物是可以跨膜转运的。另外一个证据就是，如果泛酸酰 胺类化合物是通过它们的垸基侧链作用于膜上，来抑制细胞生长，那么它们的作用效果应该 是N9-Pan〉N7-Pan〉N5-Pan ，但实验的结果恰恰相反，是N5-Pan〉N7-Pan〉N9-Pan 。这也通过 反证排除了作用于膜的可能性。
由图6可见，D-和DL-panthenol区别不大，它们对带有五cPanK，历PanK和M,PanK的 ts9菌株都不抑制，但在lmM时能够抑制带有&PanK的ts9菌株。这就体现了化合物对不 同泛酸激酶的特异性抑制。
N5-， N7-和N9-Pan对四种ts9菌株的抑制效果都很好，没有太多的选择性。从药物开 发的角度来说，这样的化合物并不适用。
以上，我们评价了同一种药物对不同ts9菌株的抑制效果，进行了纵向比较。我们还可以 进行横向比较，即评价不同的药物对同一种ts9菌株的抑制效果，这样的评价更加可信。因为 对同一个菌株，它的一切背景都是均一的，所有的不同都是由化合物的不同引起的。而且， 横向比较的结果更加可靠。
从图4可以看到，EcPanK的表达量非常高，这可能和它本身就是大肠杆菌的蛋白有关。 州PanK和MWanK的表达量次之，ScPanK稍差(参见图3)。这种蛋白表达量的不同，恰 是化合物的抑制浓度不同的根本原因。实施例4:对本发明模型的评估实验
我们建立了泛酸激酶靶向的快速筛选大肠杆菌模型，并且选用了六种化合物来应用这个 模型，得到了关于不同化合物对各个ts9菌株的抑制情况的信息。为了证实本发明模型所得 数据是否能真实地反映原本物种的客观情况，我们选取了大肠杆菌DH5a，流感嗜血杆菌以及 面包酵母BY4742等三种物种。测定它们在添加不同化合物浓度的情况下的生长状态，并与从 模型中得到的数据进行了比较，以对本发明模型的实际可应用性进行评估。
1、 化合物对大肠杆菌DH5oc的抑制效果 选用液体稀释法测定化合物对大肠杆菌DH5a的抑制效果。
挑取大肠杆菌DH5ct的单菌落，37'C过夜培养。测OD值，估算细胞数，然后将细胞稀释 成3-4xl04细胞/ml。
配制不同浓度的化合物。采用梯度稀释法我们的化合物储液浓度是100mM，溶在5% DMSO中。取无菌1.5ml聚乙烯管14个，排成一排，第l管加入984pl溶剂(即5XDMSO)， 最后一管(第14管)加入400W溶剂(这一管作为不加化合物的生长对照)，其余12管分 别加入500W溶剂。在第l管中加入100mM的化合物原液16nl (浓度为1600pM)，混匀， 然后吸取500pl至第2管，混匀后再吸取500pl至第3管，如此连续倍比稀释至第7管(浓 度为25pM)，然后从第7管吸取524.6pl至第8管(浓度为12.8pM)，之后，从第8管吸取 50(^1至第9管，混匀后再吸取500pl至第IO管，如此一直到第13管。
此时，各管的化合物浓度分别为1600、 800、 400、 200、 100、 50、 25、 12.8、 6.4、 3.2、 1.6、 0.8、 0.4、 O(iM。
一开始我们用LB培养基，但发现DH5a很难被抑制，可能是LB中营养过于丰富，或 者含有高浓度的泛酸。后来根据参考文献，改用Tryptone Broth (TB)培养基。
接菌时，在14支试管中，每支加入500plTB培养基，lOOpl稀释后的菌液(约有3000 一4000个细胞)以及相应浓度的化合物400ial。总共是lml 。最终化合物的浓度分别为640、 320、 160、 80、 40、 20、 10、 5.12、 2.56、 1.28、 0.64、 0.32、 0.16、 O(iM 。
将接种好的试管置于37'C摇床中振荡48小时后收菌，测OD600的值。结果如图7。此结 果是三次重复实验的平均值(绝大部分误差小于5%)。
2、 化合物对流感嗜血杆菌的抑制效果
此处使用的流感嗜血杆菌是由浙江大学附属儿章医院临床分离所得的。流感嗜血杆菌的 培养需要添加血液中的X因子， 一般使用巧克力平板。但巧克力平板相对不透明，不方便计 数；而且不能配成液体培养基。我们在本实验中使用XV培养基，购于天津金章新技术研究 所，它是以脑心浸液为基础，加入XV因子及抗生素成分配置而成的，可根据需要配制成液 体或固体培养基，而且颜色类似LB培养基，基本透明，可计数。最初想直接液体摇菌，然后通过测量OD值检测。后来发现，对流感嗜血杆菌，OD值很 不准确，而且有些化合物(比如N9-Pan)在刚开始是溶解的，等培养结束后，会析出一些不 溶物，影响了OD值的测量。于是改用先液体摇菌，然后涂板记活菌数的方法。
挑取单菌落接菌，37。C过夜培养，至OD6G()二0.4-0.5，稀释200倍。
不同浓度化合物的配制。为了更方便地和模型所得数据比较，我们选取了和模型中差不 多的浓度梯度5000、 1000、 500、 50、 5、 0|iM。 i于最终是将40pl化合物加入到总体积120pl 中，因此先配成浓度为15000、 3000、 1500、 150、 15、 OpM 。取无菌PCR管6个，排成一 排，第l管加入26.22nl溶剂(即5XDMS0)，第2管加入49.76pl溶剂，第3管加入22.2pl溶 剂，第4管加入39.6pl溶剂，第5管加入36)Ltl溶剂，最后一管加入40nl溶剂(这一管作为不 加化合物的生长对照)。在第l管中加入30mM的化合物原液26.22pl (浓度为15mM),混匀， 然后吸取12.44nl至第2管(浓度为3mM)，混匀后再吸取22.2^1至第3管(浓度为1.5mM)，混 匀后吸取4.4pl至第4管(浓度为150pM)，混匀后吸取4pl至第5管(浓度为15^iM)。
然后在每管中加入70inlXV液体培养基，最后加入稀释后的细胞10pl。总体积是120(al。 将它们放入37'C摇床，低速振荡，过夜培养，18小时后取出。再将培养后的菌液稀释1000倍， 取80pl涂XV平板。将平板放入C02烛缸中，置37。C温箱培养，最后计数。
结果如图8所示。与大肠杆菌DH5a的结果一样，此结果是三次重复的平均值(绝大部 分误差小于5%)。
3、化合物对面包酵母BY4742的抑制效果
实验方法和化合物对大肠杆菌DH5ot的抑制效果类似，只是所需的浓度比我们预想的要 高，经过预实验，我们最终设定浓度梯度为2560、 1280、 640、 320、 160、 80、 40、 20、 10、 5、 OpM。
接菌方法在无菌试管中加入500nlYPD培养基+100pl细胞(大约含5000个细胞) 相应浓度的化合物。总体积lml。放入30。C摇培育15小时后，取出，湖(jOD值，确定 生长情况。
结果如图9。与前述结果一样，此结果是三次重复的平均值(绝大部分误差小于5%)。 由上述结果可以看出，对大肠杆菌泛酸激酶而言，模型中所得抑制浓度普遍高于大肠杆 菌DH5a，这可能和pQE-5cPanK在细胞内的表达量比较高有关。但从这两个独立的系统中得 出的信息是相同的，即各种化合物对大肠杆菌的抑制效果为N5-Pan>N7-Pan-N9-Pan> pantoyltaurine=D-panthenol= DL-panthenol 。
对流感嗜血杆菌泛酸激酶，由于N7-Pan和N9-Pan的溶解性比N5-Pan要差，在液体中 可能情况要比固体中好，因此对N7-Pan和N9-Pan而言，从模型中(在平板上操作)得到的 抑制浓度比相应物种中(在液体培养基中操作)得到的抑制浓度要稍高。综合考虑这些影响 因素，我们认为模型和相应物种得到的数据仍然是吻合的，即各种化合物对流感嗜血杆菌的 抑制效果为N5-Pan$N7-Pan-N9-Pan> pantoyltaurine二D-panthenol二 DL-panthenol 。对面包酵母的泛酸激酶，虽然从模型和相应物种得到的数据相对排序相同，即各种化合 物对面包酵母的抑制效果为N5-Pan>N7-Pa论N9-Pan>
D-panthenol-DL-panthenol>pantoyltaurine。但它们的绝对数值差别很大在模型中，N5-Pan对 带有pQE-Sqw"《的ts9菌株抑制是最强的，在5pM时即完全抑制，但在相应的物种面包酵 母BY4742中， 一直要到2.5mM以上才呈现抑制作用。我们注意到，酵母的最适生长温度是 3(TC，但我们的模型是在37'C下操作的，温度对酶的活性的影响是很大的，因此我们认为， 在模型中，&PanK足够功能互补ts9中有缺陷的CoaAl ，但由于在37。C， ScPanK处于很不 稳定的脆弱状态， 一旦遇到抑制剂，活性就很容易被阻抑。
因此，以上实验结果表明，本发明的模型能够准确的反映各种化合物之间的相对抑制效 果，并且这些抑制强度的区别都是由转入的泛酸激酶不同引起的，这就确保了所筛得的抑制 剂都是以泛酸激酶为靶点的。序列表
〈110〉江苏先声药物研究有限公司 〈120〉药物筛选模型及其应用 〈140〉 〈141〉 〈160〉 10 〈170〉 WORD98
〈210〉 1 〈211〉 32 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈400〉 1
CGGGATCCAG TATAAAAGAG CAAACGTTAA TG
〈210〉 2 〈211〉 32 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈400〉 2 、 CGCCCAAGCT TCTCCC.CTGC AAA丁TATTTG CG
〈210〉 3
〈211〉 31
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈400〉 3
CGGGATCCGA ATTTTCAACT CAGCAAACAC C
〈210〉 4
〈211〉 36
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈400〉 4
AAAACTGCAG ACGTGCGAAT TTTTATTTTC TTAATT
〈210〉 5 〈211〉 27 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉〈400〉 3
CGGGATCCTC GCGGCTTAGC GAGCCGA
〈210〉 6 〈211〉 32 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈400〉 4
CGCCCAAGCT TACCGCCAAT TACAGCTTGC GC
〈210〉 7
〈211〉 30
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈400〉 3
CGGGATCCCC GCGAATTACT CAAGAGATAT
〈210〉 8
〈211〉 33
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈400〉 4
CGCCCAAGCT TGTGAAATCT ATCTACGTAC TTG
〈210〉 9 〈211〉 35 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈400〉 3
CGGGATCCAG AAAGTATAA A AACGAATTAA ACATT
〈210〉 10 〈211〉 35 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈400〉 4
CGCCCAAGCT TCTTGAGATC TACCTTTTTA CATTG
权利要求
1、一种大肠杆菌药物筛选模型，特征在于该模型是以泛酸激酶为靶向的。
2、 权利要求1的药物筛选模型在筛选与泛酸激酶相互作用化合物中的应用。
全文摘要
本发明涉及大肠杆菌泛酸激酶药物筛选模型，特别是涉及不同外源泛酸激酶取代大肠杆菌自身泛酸激酶的模型，以及利用该模型筛选泛酸激酶靶向药物中的应用。
文档编号C12Q1/48GK101294194SQ200710021770
公开日2008年10月29日 申请日期2007年4月28日 优先权日2007年4月28日
发明者兵 周, 丹 沈 申请人:江苏先声药物研究有限公司