专利名称：一种能溶解土壤磷酸钙的k3菌株及其微生物有机肥料的制作方法
技术领域：
本发明一种能溶解土壤磷酸钙的细菌K3菌株及其制成的微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术领域，专用于克服石灰性土壤上作物缺磷问题。
背景技术：
化学磷肥施入土壤后当季作物一般只能利用15％左右，85％左右的磷肥被固定在土壤中并逐步老化而失去有效性，即便是下季作物也很难利用上季施入的磷肥。因此，农民只得每季都施用化学磷肥，这样，一方面大量的磷矿资源被耗竭，据预测我国现存的高品位磷矿资源按目前的开发利用速度只有30年就会被全部耗竭，另一方面，农民每季都施用磷肥而使土壤中累积态磷很多，但植物很难利用。因此，发明一种微生物或微生物有机肥料能够溶解土壤中的无效态磷，使其有效化，是我国土壤磷素和磷肥管理中很重要的一环。
土壤中磷细菌根据其作用方式不同有两种，一种是无机磷细菌，一种是有机磷细菌，前者是通过菌体的生命活动产生有机酸(如柠檬酸、乳酸、苹果酸等)，这些有机酸通过螯合石灰性土壤中的钙和降低pH使土壤中的磷酸钙不稳定，而释放出磷，从而将土壤中对植物无效的无机钙磷(酸性土壤除外)化合物变成有效的无机磷。利用一些特殊功能的微生物来调动土壤中的无效态磷这是微生物有机肥料的发展方向之一。磷细菌肥料的另一种(有机磷细菌)是通过微生物分泌磷酸酶将土壤中对植物无效的有机磷化合物分解成对植物能吸收的无机磷，这类磷细菌肥料施入到有机质含量较高的土壤上效果较明显。
另一方面，我国农产品加工业的固体有机废弃物和规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和微生物有机肥产品的原料；大量的养分资源(C、N、P、K、S及微量元素)流失于土壤-植物系统之外，明显地削弱了我国农业可持续发展的能力。如何将从土壤中因收获作物取走的营养元素最大限度地归还到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥料再施入土壤。如果将这些固体有机废弃物经过高温发酵合成高品位的有机堆肥，再用于农业功能菌的有机载体，所制成的微生物有机肥料功能明确，将会有很好的应用前景。
发明内容
技术问题 本发明的目的在于研制一种能溶解土壤磷酸钙的细菌及其制成的微生物有机肥料，将石灰性土壤中的无效态磷(磷酸钙)转化成部分有效态磷，从而改善作物磷素营养，节约大量的磷矿资源，确保我国农业生产的可持续发展。
技术方案1、解磷细菌K3菌株的生理生化特性本发明的一种能溶解磷酸钙的K3菌株，其特征在于，其特征在于该菌株是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，2007年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.2045，主要生物学特性为G-，菌体为杆状，兼性厌氧；过氧化氢酶、氧化酶、吲哚试验、甲基红反应为阳性，V.P试验阴性；能够利用明胶、可使石蕊牛乳凝固，但不能利用淀粉和柠檬酸盐；葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵不产气。该K3菌株16S rDNA在Genban中的查询号为EF064786。
2、用解磷细菌K3菌株所生产的微生物有机肥料该肥料中含有5×107个/g以上的解磷微生物数量；全氮含量为4％，其中90％以上为有机氮；全钾含量1～2％；全磷含量1～2％；有机质含量为35％。
3、用K3菌株生产微生物有机肥料的方法包括1)选用权利要求1所述解磷细菌K3菌株，先进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为pH生长范围5.0～8.0，培养温度范围25～45℃，液体培养基为LB加富，发酵周期18～30小时，发酵液中K3菌株含菌量≥1×1010个/ml；2)解磷细菌的有机载体生产按照本课题组获得的专利“利用农业固体废弃物制成有机高氮肥的方法及其肥料产品”，专利号ZL2004 1 0014773.1所述方法生产的有机高氮肥为有机载体；3)解磷细菌K3菌株有机肥料的生产将上述有机载体按重量比加入5％的解磷细菌K3菌株发酵液解磷细菌的发酵液与有机载体充分混合后在自然条件下放置3-5天，其间解磷细菌数量将从1×107个/g左右繁殖至1×108个/g，最终产品中含解磷细菌数量达到5×107个/g以上，含水量小于30％，全氮含量达4％(有机氮大于90％)，有机质含量达到35％，达到国家微生物有机肥料产品的标准。
上述生产方法中解磷菌发酵生产最佳温度为37.5℃。其微生物发酵生产方法中培养基LB加富指的是在LB中添加硝铵、硫铵、黄豆粉等。
有益效果本发明一种能溶解土壤磷酸钙的微生物有机肥料及其生产方法，利用农业固体有机废弃物堆制成特定的有机载体，再与解磷细菌发酵液混合后制成微生物有机肥料，其产品与目前市场上的产品相比具有如下优点1)肥料产品中含有溶解土壤磷酸钙的高效菌株，其解磷效果非常显著，肥料中该高效菌株的含量达到5×107个/g以上，施入土壤后能迅速形成优势群，并在土壤中存活下来。
2)肥料产品中含有丰富的有机碳和有机氮，能给解磷功能细菌提供十分优越的生长环境，极大地提高了外来功能微生物在土壤中的定植和发挥作用的能力。
3)实验室培养结果表明该磷细菌能使磷酸钙溶液中可溶性磷浓度达到643mg/L，比国外最新报道的结果要高4倍多。
4)本产品生产原料来源广而丰富，原料成本很低，生产工艺简便，固定资产投入少，生产过程中耗电耗水极少，因此产品价位低而针对性强，企业每生产1吨含解磷细菌的微生物有机肥料，其所有成本不超过600元，而象这种特效专用的微生物有机肥料市场价格较高，一般在1000元/吨左右，而且目前市场上非常紧缺，因此本产品具有强大的社会、环境和经济生命力。
5)大田生物试验结果表明，在玉米、大豆等作物上施用本产品后，能够使解磷细菌迅速繁殖，在土壤中形成优势群，使土壤中有效磷显著提高，在石灰性土壤上每亩施用该微生物有机肥料100公斤，其提供磷素营养的作物效果相当于每亩施用10公斤(P2O5)的化学磷肥(75公斤过磷酸钙)、8公斤(N)的化学氮肥(18公斤尿素)、1-2公斤(K2O)的化学钾肥(3公斤氯化钾)。农民施用该微生物有机肥料的投入成本为100元，而施用上述化学肥料的投入成本为120元。不仅如此，通过施用本发明的微生物有机肥料产品后，所生产的农产品品质和风味有较大提高，生态环境和土壤质量有很大改善。
四
图1高效解磷细菌K3菌株分离筛选流程2通过PVK固体培养基分离筛选获得高效解磷细菌K3菌株图3解磷细菌的液体发酵培养工艺流程五具体实施方式
(一)解磷菌株的获得从石灰性缺磷土壤中选择生长良好的植株根际采集土壤和植株根系，样品低温(4-15℃)保存带回实验室；采用系列法利用PVK改良的固体平板选择性培养基(葡萄糖10g，磷酸三钙5g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，酵母浸膏0.5g，硫酸锰0.002g，硫酸亚铁0.002g，0.4％溴酚蓝6ml，琼脂18g，蒸馏水1000ml，pH自然)37.5℃条件下培养36-48小时获得解磷细菌单菌落，选择溶磷圈与菌落圈比值较大的菌株进一步进行摇床筛选；采用NBRIP液体培养基(葡萄糖10g，，磷酸三钙5g，氯化镁5g，硫酸镁0.25g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g，蒸馏水1000ml，pH7.0.)和磷矿粉改良培养基(葡萄糖10g，磷矿粉5g，氯化镁5g，硫酸镁0.25g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g，蒸馏水1000ml，pH7.0)在37.5度条件下培养18-24小时获得解磷菌发酵液，测定发酵液和菌体中磷含量，选择溶磷量较高的4株菌株进行盆栽试验；在缺磷的石灰性土壤上用玉米直播的方式进行盆栽试验，氮钾养分施肥量保持完全一致，磷养分分别用过磷酸钙、磷酸二氢钾、解磷细菌发酵液、灭活解磷细菌发酵液替代进行施肥，经过30-35天的温室培养，测定植株全磷量和土壤中有效磷含量，根据植株生长健壮情况和植株全磷量、土壤有效磷含量高低筛选高效解磷菌株，即获得K3菌株，经过生理生化和16sRNA分子鉴定确定属种，菌种冻干保藏于-20℃。
(二)解磷菌株的发酵生产1、解磷细菌K3菌株的种子培养种子培养基(摇瓶培养)培养基LB加富、121℃蒸汽灭菌20分钟；种子培养条件5-10％接种量，37.5度，150-200转/分钟；培养周期18-25小时。
2、菌株的发酵生产(扩大培养)利用LB加富培养基进行高密度扩大培养获得高浓度发酵液(含菌量≥1×1010个/ml)。
发酵培养基培养基LB加富(加富主要成份为硝铵、硫铵和黄豆粉等)，121℃蒸汽灭菌20分钟；发酵条件5-10％接种量、80-100转/分钟、培养温度37.5℃、pH7.0-7.5，发酵周期20-25小时。溶氧稳定在100％-60％，当溶氧开始回升并逐步趋向于75％时表明发酵进入平缓期可以放罐，放罐条件为有效活菌数≥1×1010个/ml，高密度发酵菌液低温保存待用。
3、解磷细菌K3菌株生物有机肥的生产将解磷细菌与有机载体(按中国专利“利用农业固体废弃物制成的方法及其肥料产品”，专利号ZL2004 1 0014773.1所述方法生产的有机高氮肥为有机载体)充分混合(加入按重量比5％的解磷细菌发酵液，)混匀后的混合物在自然条件下散失水分至含水量小于30％，该过程大约需要3-5天时间，其间解磷细菌数量将从1×107个/g左右繁殖至1×108个/g，最终产品中含解磷细菌数量达到5×107个/g以上，全氮含量达4％(有机氮大于90％)，有机质含量达到35％，产品指标达到国家微生物有机肥料的标准。产品包装，存放于阴凉、干燥处。
表1本发明微生物有机肥料产品某些特性
表1表明通过本发明技术及生产工艺生产的产品中有机质含量为35.8％，且含有很高比例的可溶性有机质(9.52％)和很高的有机氮含量(4.12％)，这是该产品施入土壤后解磷功能细菌大量繁殖的物质基础；同时，这些大量的有机碳和有机氮施入土壤后也显著促进了土壤微生物的生物活性，从而大大提高土壤养分转化速率，使作物生育期内始终处于良好的营养状态；产品中解磷细菌的活菌数达到5×107个。以上特性充分说明了本发明技术及生产工艺制造的特种解磷微生物有机肥料的可行性。
4、解磷细菌K3菌株生物有机肥的田间试验本发明所研制的特种解磷微生物有机肥料对石灰性土壤上玉米的增产效应非常显著(见表2)，由表2可知在石灰性土壤上如果仅施用有机高氮肥(有机载体)玉米籽粒产量比对照高27.1％(表2处理3减去处理1除以处理1，再乘以100％)，说明该有机肥对玉米产量具有一定的增产作用。如果仅施用解磷细菌液体，玉米籽粒产量比对照仅高5.7％(表2处理4减去处理1除以处理1，再乘以100％)，说明施用解磷细菌发酵液体单独施用对玉米的增产效果不显著。如果施用微生物有机肥料(处理5)，则玉米籽粒产量接近于当地农民常规施肥产量，比对照高43.2％。如果施用微生物有机肥料后在配合施用少量尿素和氯化钾，则玉米产量为所有处理最高，比当地农民常规施肥还增产3.9％(表2处理6减去处理2除以处理2，再乘以100％)，通过处理6与处理2比较，得出每亩施用该微生物有机肥料100公斤，其提供磷素营养的作物效果相当于每亩施用75公斤过磷酸钙、18公斤尿素和3公斤氯化钾)，农民施用该微生物有机肥料的投入成本为100元，而施用上述化学肥料的投入成本为120元。
表2本发明的解磷微生物有机肥料对石灰性土壤上玉米的增产效应(田间试验)
注所有有机肥料、磷肥和钾肥均一次性做基肥施入土壤，尿素分三次施入土壤(基肥60％，第一次追肥20％，第二次追肥20％。)从表2还看出，施用该微生物有机肥料后玉米吸收的总磷量显著增加，由于该土壤具有土壤总磷含量高而有效磷很低(4.6mg/kg)的特征，施用该微生物有机肥料后加快了土壤无效态磷转化成有效态磷的转化速度，使玉米全生育期内吸收的总磷量显著提高，从而确保了玉米的磷素营养，使玉米高产稳产。
从表3可看出，施用解磷微生物有机肥料、经过一季玉米的生长，该土壤中解磷细菌的数量显著增加，达6×104个/g土，说明该解磷微生物有机肥料确实能使外来解磷细菌在土壤中定植和繁殖，而且发挥作用，一季玉米后土壤中有效磷为7.02mg/kg，而1、2、3处理土壤有效磷3.5mg/kg以下，仅为施用解磷微生物有机肥料处理的一半，说明该微生物有机肥料的解磷效果显著。
表3本发明的解磷微生物有机肥料对石灰性土壤上解磷细菌和土壤磷含量的影响(盆栽试验结束时的土壤样品)
注所有肥料均一次性做基肥施入土壤，试验作物为玉米。
权利要求
1.一种能溶解磷酸钙的细菌K3菌株，其特征在于，该菌株是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，2007年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.2045。
2.用权利要求1所述的一种能溶解土壤磷酸钙的细菌K3菌株所生产的微生物有机肥料。
3.根据权利要求2所述能溶解土壤磷酸钙的微生物有机肥料，其特征在于该肥料中含有5×107个/g以上的解磷微生物数量；全氮含量为4％，其中90％以上为有机氮；全钾含量1～2％；全磷含量1～2％；有机质含量为35％。
4.根据权利要求2或3所述能溶解土壤磷酸钙的微生物有机肥料，其生产方法包括1)解磷细菌K3菌株发酵液生产选用权利要求1所述解磷细菌K3菌株，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为pH生长范围5.0～8.0，培养温度范围25～45℃，液体培养基为LB加富，发酵周期18～30小时，所获得的发酵液中K3菌株含菌量≥1×1010个/ml；2)解磷细菌的有机载体生产按照中国专利“利用农业固体废弃物制成有机高氮肥的方法及其肥料产品”，专利号ZL200410014773.1所述方法生产的有机高氮肥为有机载体；3)解磷细菌K3菌株有机肥料的生产将上述有机载体按重量比加入5％的解磷细菌K3菌株发酵液，充分混合后，在自然条件下放置3-5天，即为获得的解磷微生物有机肥料产品。
5.根据权利要求4所述解磷微生物有机肥料，其生产方法中解磷菌发酵生产最佳温度为37.5℃。
6.根据权利要求4或5所述解磷微生物有机肥料，其微生物液体发酵生产方法中培养基LB加富指的是在LB中添加硝铵、硫铵和黄豆粉等。
全文摘要
本发明一种能溶解土壤磷酸钙的细菌K3菌株及其生产的微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。从石灰性土壤上分离到1株具有溶解磷酸钙能力很强的细菌，将该细菌先进行液体发酵生产，然后与特定有机载体混合制成解磷微生物有机肥料，肥料中含有5×10
文档编号C12R1/385GK101066897SQ20071002291
公开日2007年11月7日 申请日期2007年5月25日 优先权日2007年5月25日
发明者沈其荣, 杨兴明, 徐阳春, 黄启为 申请人:南京农业大学