D-乳酸诊断/测定试剂盒及d-乳酸浓度测定方法

文档序号:590748阅读:251来源:国知局
专利名称:D-乳酸诊断/测定试剂盒及d-乳酸浓度测定方法
技术领域
本发明涉及一种具有D-乳酸特异性的D-乳酸诊断/测定试剂盒,同时 本发明还涉及测定D-乳酸浓度的方法,属于医学/食品检验测定技术领域。
技术背景L-乳酸是近年来人们十分关注并发展较快的有机酸。同时L-乳酸具有 在食品、饲料、医药、塑料、饲料、农药、日用化工、造纸及电子工业等 多领域应用前景。L-乳酸是大多数生物体代谢作用的终产物。仅少数微生物(例乳酸菌属、 明串珠菌属)能形成D-乳酸。生产酸奶时非常注意检测乳酸盐,以评估微 生物是否产生L-乳酸,D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在,则可能是微 生物造成了污染。乳酸盐浓度的异常升高与多种疾病如糖尿病、酸毒症等疾病有密切的关 系。L(+)-Lactate是人体中乳酸盐代谢的主要中间产物,并且存在于血液 中。D(-)-Uctate也存在,但含量很低,只有L(+)-Lactate的1-5%。血乳酸测试作为一个监护、监测运动员训练能力的手段,把血乳酸值作 为衡量运动员有氧耐力水平、无氧训练能力、身体疲劳恢复等方面的一个 重要数据,供安排训练时参考。酶法分析是国际上公认的分析方法,已被多个国际权威组织或机构采 纳如IFU (国际果汁生产者协会),AIJN (欧盟果蔬汁及饮料生产者联盟),及MEBAK, OICC, VDLUFA等组织广为推崇,并确定为标准检测方法。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用具有D-乳酸特异性的酶比 色法(Enzymatic Colorimetric Method)及偶联法(Couple Reaction)技术, 监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化,得 以测定D-乳酸浓度的方法,同时,本发明还将给出用以实现该方法的D-乳酸诊断/测定试剂盒,采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全 自动生化分析仪上进行D-乳酸浓度测定,而且测定速度快、准确度高,因 而可以得到切实的推广应用。本发明D-乳酸浓度测定方法原理如下D-乳酸+ 2高铁细胞色素cD-乳酸脱氢酶丙酮酸+2亚铁细胞色素c 丙酮酸+匸精氨酸+还原型辅酶章鱼碱脱氢酶N2-(D-羧乙基)-精氨酸+辅酶+水 这种方法应用D-乳酸脱氢酶(D-Lactate dehydrogenase; EC 1.1.2.4; EC 1.1.2.5)偶联章鱼碱脱氢酶(octopinedehydrogenase ; EC 1.5.1.11)酶促反 应连续监测法/终点比色法。D-乳酸脱氢酶酶解D-乳酸反应产生丙酮酸,再 通过偶联章鱼碱脱氢酶的作用,最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰) 氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰),从而得以测定还原型辅酶在 340nm处吸光度下降的程度/速度,通过测量340nm处吸光度下降的程度/ 速度,可以测算D-乳酸的浓度大小。实验表明,从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑,无论是单剂、双剂还是三剂,如下成分关系的本发明D-乳酸诊断/测定试剂盒较为理想缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L2高铁细胞色素c 10 mmol/L精氨酸 50 mmol/LD-乳酸脱氢酶 10000 U/L章鱼碱脱氢酶 10000 U/L本发明的D-乳酸诊断/测定试剂盒可以是单剂,包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、精氨酸、D-乳酸 脱氢酶、章鱼碱脱氢酶。 试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体 试剂,直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、精氨酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶、章鱼碱脱氢酶。 还原型辅酶、2高铁细胞色素c、精氨酸、D-乳酸脱氢酶、章鱼碱脱氢 酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态,在使用 前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂:试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素C、精氨酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、章鱼碱脱氢酶。试剂3缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶。还原型辅酶、2高铁细胞色素c、精氨酸、D-乳酸脱氢酶、章鱼碱脱氢 酶在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态, 在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂,本发明测定D-乳酸浓度的方法,其还原 型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。实施例一本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为单试剂, 三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶2高铁细胞色素cD-乳酸脱氢酶包括謂讓ol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 50 mmol/L 10000U/L章鱼碱脱氢酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后,分装入瓶,进行冷冻干燥,制成干粉试剂;使用前,加入纯净水,复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C,反应时间10分钟,起始吸光度1.8土0.7,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测D-乳酸样品与试剂的体积比例为1/25,反应方向为负反应(下降反应),延迟时间大约O分钟左右,检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下,检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度,从而测算出D-乳酸的浓度大小。 实施例二本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为双试剂,包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 2高铁细胞色素c10Ommol/L50 mmol/L0.25 mmol/L10 mmol/L50 mmol/L试剂2(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂D-乳酸脱氢酶100麵ol/L 500画ol/L 10000U/L章鱼碱脱氢酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后,分装入瓶,制成液体双试剂,可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C,反应时间10分钟,起始吸光
度1.8±0.7,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测D-乳酸样品与
试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5,反应方向为负反应(下降反应),延
迟时间大约O分钟左右,检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析
仪下,检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度,从而测算出D-乳酸的
浓度大小。
实施例三
本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为三试剂,包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂
还原型辅酶
2高铁细胞色素c
50 mmol/L
0.25 mmol/L
10 mmol/L
50 mmol/L
试剂2
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
廳mmol/L 500mmol/L 10000U/L
试剂3三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/LD-乳酸脱氢酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后,分装入瓶,制成液体三试剂,可以直接使用。 测定D-乳酸浓度时,在全自动生化分析仪上设定温度37'C,反应时 间IO分钟,起始吸光度1.8±0.7,测试主波长340nm,测试副波长405nm, 被测D-乳酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5,反应方 向为负反应(下降反应),延迟时间大约0分钟左右,检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析 仪下,检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度,从而测算出D-乳酸的 浓度大小。申请人经过实验验证,采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的,鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同, 不另一一例举。总之,实验证明,采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果,并且灵敏度高、精确度好,便于推广应用。
权利要求
1.一种利用具有D-乳酸特异性的酶比色法及酶联法技术的D-乳酸浓度测定方法,其方法原理如下D-乳酸+2高铁细胞色素cD-乳酸脱氢酶丙酮酸+ 2亚铁细胞色素c丙酮酸+L-精氨酸+还原型辅酶章鱼碱脱氢酶 N2-(D-羧乙基)-精氨酸+辅酶+水将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下,检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度,测算出D-乳酸的浓度大小测定结果。
2. —种D-乳酸诊断/测定试剂盒,主要成分包括:缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 2高铁细胞色素20-500 mmol/L1-4000 mmol/L0.1-0.35mmol/L50 mmol/LD-乳酸脱氢酶50 mmol/L1000——80000 U/L1000--80000 U/L
3.其特征在于试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可 以配制成液体试剂,直接使用。 3.根据权利要求2所述D-乳酸诊断/测定试剂盒,其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、精氨酸、D-乳酸脱氢酶、章鱼碱脱氢酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述D-乳酸诊断/测定试剂盒,其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、精氨酸、D-乳酸 脱氢酶、章鱼碱脱氢酶组成双剂试剂;试剂l,由缓冲液、稳定剂、还 原型辅酶、2高铁细胞色素c、精氨酸组成;试剂2,由缓冲液、稳定 剂、D-乳酸脱氢酶、章鱼碱脱氢酶组成。还原型辅酶、2高铁细胞色素 c、精氨酸、D-乳酸脱氢酶、章鱼碱脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置 可以不限。
5. 根据权利要求2所述D-乳酸诊断/测定试剂盒,其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、精氨酸、D-乳酸 脱氢酶、章鱼碱脱氢酶组成多剂试剂;试剂l,由缓冲液、稳定剂、还 原型辅酶、2高铁细胞色素c、精氨酸组成;试剂2,由缓冲液、稳定 齐U、章鱼碱脱氢酶组成;试剂3,由缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶组 成。还原型辅酶、2高铁细胞色素c、精氨酸、D-乳酸脱氢酶、章鱼碱 脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述D-乳酸诊断/测定试剂盒,其特征在于还包括稳 定剂1~^000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用具有D-乳酸特异性的酶比色法及酶联法技术的D-乳酸诊断/测定试剂盒,同时本发明还涉及测定D-乳酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分,属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、精氨酸、D-乳酸脱氢酶、章鱼碱脱氢酶及稳定剂;通过将样品与试剂按一定的体积比混合,使之发生一系列的酶促反应,再将反应物置于紫外/可见光分析仪下,检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度,从而测算出D-乳酸的浓度大小。
文档编号C12Q1/00GK101324562SQ20071002323
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司
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