专利名称：应用高倍率显微仪检查泌尿生殖道微生物感染的方法
所属领域本发明涉及医疗诊断技术领域，具体为一种应用高倍率显微仪检查泌尿生殖道微生物感染的方法。
背景技术：
众所周知，怎样确定感染人体的病原微生物，属于医学检验范畴。泌尿生殖道炎症是临床最为常见的病变，医生们通常要采集被感染部位的标本，送交检验科进行镜检、培养、单克隆、DNA、核酸等检查，为临床诊断寻求实验室佐证。但是，这样便会带来二个问题第一、医生必须首先提出你所怀疑的病原微生物是哪一种或哪几种？否则实验室将要对泌尿生殖道常见的10多种微生物全部进行检查，不但费时、费事，还给病人增加了不必要的高昂费用。同时这种“选择”与医生的经验、水平密切相关，随机性很大，容易出现漏检、错检和误诊。
第二、当化验结果为阳性时，它只是表明送检标本中含有这种或这些微生物，但并不确定这就是引起病变的病原微生物。也就是说，无论培养、单克隆、DNA、还是核酸技术都不能证明所提示的病原微生物是存在于细胞内还是细胞外。因为，在多数情况下，临床对泌尿生殖道感染的诊断依据是只有存在于细胞内的微生物才能确定为病原微生物，才需要给予治疗，不进入细胞内的微生物通常不会产生病变，这正是诊断泌尿生殖道炎症与诊断人体其它部位炎症不同之处。
这所以不同，是缘于泌尿生殖道常见的病原微生物广泛存在于自然界和人体体表，如支原体、衣原体、加德纳杆菌、单纯疱疹病毒、HPV等。不良卫生习惯，不清洁用水，共用卫生洁具等，有可能使少量的这些微生物进入泌尿生殖道，它们通常“寄居”在较浅表部位，不一定会侵犯细胞造成病变。因此，送检的标本中这些微生物都能使培养、DNA、单克隆、核酸反应等呈现阳性反应。所以，上述检查某一项或几项呈献阳性，并不表明所表示的微生物就是真正引起病变的病原微生物！诊断的标准是谁进入了细胞内并导致了细胞的形态学改变，谁就是真正的病原微生物！这恰恰是培养和分子生物学技术不能回答的问题，一项或多项检查出现阳性反应，只表明标本中有这种或这几种微生物存在，仅此而已。是否进入了细胞？则不得而知。
然而，临床医师希望实验室提供确切的信息是哪种(或哪几种)微生物侵入了泌尿生殖道细胞并引起了细胞的病理改变，从而导致临床病征的产生。可是，这就超出了培养和分子生物学的技术范围。
细胞病理学工作者通过回顾性研究与前瞻性研究，已经能够从细胞核和细胞浆的形态变化，准确地识别和鉴别众多微生物对细胞的侵犯。特别是宫颈细胞微生物感染的观察研究，进展尤为显著，几种常见的、危害严重的泌尿生殖道病原微生物，只要侵入细胞，造成了细胞损害，都能从细胞形态学上加以辨认和识别，为临床医师提供确切的病原微生物诊断依据。这些成就，被写入全球百余名病理学专家、知名学者共同制定的“TBS诊断系统”(标准)中，在世界各国推广应用。
用观察细胞形态学的方法来诊断宫颈与泌尿生殖道微生物感染，是20世纪细胞病理学的重大进展，它是近代培养技术和分子生物学技术的补充与完善，其临床意义非同一般，从此当病人出现宫颈或泌尿生殖道炎症时，医生们无须再去考虑是何种病原微生物引起？选择哪种技术来寻找病原微生物？只需要将获取的标本送交细胞病理室，病理医师会逐一地进行细胞观察分析，为临床提供全面、准确的诊断信息。按照TBS系统要求，女性宫颈标本可能还将同时进行宫颈癌和癌前病变的筛查，给出规范的诊断报告。
在人们的传统观念中，细胞病理形态学用于查找癌细胞是无可置疑的，而作为细胞感染的微生物诊断方法，还是逐渐被接受和认可的。其实，细胞病理学者经过长期观察研究，早就发现泌尿生殖道病原微生物在侵入粘膜细胞之后，造成细胞的损害，往往使细胞核或细胞浆发生形态变异。不同的病原微生物只侵犯特定的细胞，所引起的细胞形变又各不相同且都有各自的形态特征。病理医师就可以根据这些独特的形态特征来发现和诊断造成感染的病原微生物。早些年，这种方法应用还不够普遍，逐步形成系统和规范则是近10年左右的事情。实践证明其敏感性和特异性极高，得到了电镜、分子生物学技术等证实，深受临床的好评与欢迎。
例如衣原体感染，它侵犯的是柱状上皮细胞，在细胞浆内形成包涵体，形态特异、典型；支原体也感染柱状上皮细胞，它是在细胞浆内生长、繁殖，但绝不形成包涵体；又如，加德纳杆菌，它只侵犯表层鳞状上皮细胞，在其中大量密布，形如线索状，通称线索细胞；再如，单纯疱疹病毒感染细胞后，它促使细胞融合，造成细胞核相互堆集在一起，形成多核细胞；还有，乳突瘤状病毒感染，侵入鳞状上皮细胞核，除核发生形变外，核周胞浆空化，这就是颇具特色的、提示乳突瘤状病毒感染的挖空细胞；还有，巨细胞病毒感染出现的核周包涵体，称之为“猫头鹰眼”征；再有，临床常见的淋病双球菌，它只侵犯柱状上皮细胞和白细胞，在其中成堆出现，等等。这些形态特征与所感染的病原微生物一一对应，当发生多重感染时，各自的形态特征仍然保持不变。在感染得到控制后，细胞的形态改变便会渐行消失。这是继宫颈癌之后，细胞病理学取得的又一重大进展。
目前临床上普遍应用的方法，仍然是首先在泌尿生殖道涂片，获取表层鳞状上皮细胞和柱状上皮细胞，直接涂抹在玻片上(近年来薄层细胞制片机问世后，则采用自动化制片效果更好)。随后即行固定、染色、干燥等步骤，最终由医师在光学显微镜下进行观察、查找。由于标本经过染色处理，细胞及微生物都死的。加之普通光学显微镜放大倍率有限，有些细胞形态改变观察不清，某些微生物发现不了。这就使得已经成熟的采用细胞形态学来查找和诊断病原微生物的方法，在临床受到了很大限制，未能普遍开展应用。如何将光学显微镜的放大倍率进一步提高？如何保持标本中细胞及微生物的活性？成为用泌尿生殖道病原微生物形态学诊断中必须解决的两项关键技术！对标本进行染色，至今仍然是显微观察中不可缺少的重要环节，泌尿生殖道细胞检查也不例外，巴氏染色被推崇为最经典的染色方法。其实，很早以前，人们就感到染色法也并非不无缺点，比如说它使生物的活动形态消失，有的染色步骤十分繁琐(如巴氏染色)等。因此，在上世纪三十年代，国外科学家发明了相差技术，可以在无须染色的情况下，看到活动的细胞与微生物，因而获得1953年度诺贝尔物理奖。接着，又有人在相差的基础上，发明了微分干涉相差，使之物像反衬更强，呈现“逼真”的立体感，还可出现色彩。微分干涉既保持了细胞活性，又有三维效果与颜色，但它并没有使用化学的或生物的染剂，而是利用了物理光学原理，被称之为“光染色”。
相差和微分干涉发明数十年，并未在临床广泛推广应用，大多仅限于实验研究，其原因有两条1、价格昂贵，相当于一台高挡显微镜，甚至超出一台高挡显微镜的价格，尤其是微分干涉。2、操作繁琐，费时、费事。
进入20世纪80年代，工业技术有了飞速进步，特别是数控机床加工和高品质合金材料的采用，生产出了转盘式显微相差组件，原本复杂、繁琐的调试顿时变得简单、便捷。随之而来的是视频解码技术、图像采集技术和光学放大技术等相继获得进展，使拓宽显微相差的应用成为可能。九十年代初，美国斯坦福大学M.R Bradford教授推出了他潜心研制的一种高放大倍率、高清晰度显微镜(人称布氏显微镜)，放大倍率可达15000倍。主要用来观察新鲜血滴中的细胞形态和有形成份，从而对受检者进行健康评估，即所谓的“亚健康检查”。
这种显微镜的一个特点是标本无须染色，便能看清细胞内的大体结构和被感染细胞内的微生物、寄生虫等。由于没有染色，所以看到的细胞和微生物都是活的，在镜下或荧屏上呈现活动物像。布氏显微镜正是在相差技术的基础上，结合近代高新技术研制而成的，它是相差的一大进步。但它只应用于血液的观察，未能开展对泌尿生殖道病原微生物的研究。
96年，我国自行开发出布氏显微镜的同类产品一高倍率显微镜。我们便将泌尿生殖道微生物检查移植到高倍率显微镜下进行，在全国数十家医疗单位的推广应用中，受得充分肯定和普遍欢迎。近年，我们又根据宫颈细胞病理学的进展与要求，研制出活细胞制片机，与高倍率显微镜组合，成为一种有别于传统方法的全新细胞病理学仪器—宫颈活细胞检查仪。该仪器在广东省妇幼保健院与美国新柏氏TCT制片，巴氏染色进行临床对照100多例，得到细胞病理专家们认可，经广东省食品药品监督管理局批准注册生产。
发明内容
本发明系采用高倍率显微仪对泌尿生殖道病原微生物感染进行检查的一种新方法。它与以往医学上其它任何检查方法不同，其特点是1、用棉拭子或宫颈恻从尿道、阴道或宫颈获取含有粘膜表层细胞的标本，涮洗于标本瓶内的细胞保存液中。经活细胞制片机制成湿片，无须固定、染色等步骤，以盖玻片复盖，即可直接在高倍率显微仪下观察。高倍率显微仪在10倍物镜观察时，放大倍率调节至1000-2000倍。40倍与100倍物镜观察时，放大倍率调节至4000-8000倍，必要时，也可调节至10000-12000倍。一般采用相差视场，当观察细胞浆内或细胞核内微小质粒运动时，也可采用暗视场。
2、高清晰放大物像显示在17时计算机屏幕上，根据活细胞和微生物的形态特征与活动状态，以及受感染细胞的类型，识别和判断细胞感染的病原微生物。通过计算机设定的程序，存贮JPG或AVI图像，并打印彩色图文检查报告。
本发明是一种活细胞检查技术，细胞和微生物在高倍率显微仪下呈现活动物像，因而保持了它们的形态特征，有利于细胞、病原微生物的识别、鉴别与诊断。在一份标本中，能同时检查泌尿生殖道常见的各种病原微生物，为患者节省了检查费用。且方法简便、快速，减少了病员的等待时间。与传统检查方法比较，其优越性是显而易见的。
本发技术特征概述为从尿道、阴道或宫颈获取含有粘膜表层细胞的标本，放置细胞保存液中，经活细胞制片技术制成活细胞湿片，直接在高倍率显微仪下，采用不同放大倍率的相差观察及暗视场观察；高清晰放大物像显示在计算机大屏幕上，根据活细胞和微生物的形态特征与活动状态，以及受感染细胞的类型，识别和判断细胞感染的病原微生物。通过计算机设定的程序，存贮JPG或AVI图像，并打印彩色图文检查报告；所述的标本为泌尿生殖道粘膜表层细胞的标本；所述的细胞为鳞状上皮细胞和柱状上皮细胞；所述的放大倍率为1000倍-12000倍；所述的细胞保存液为市售的白细胞自动计数仪用细胞稀释液或外科器官移植用器官保存液；所述的活细胞湿片为没有固定、染色的湿片；所述的观察设备为高倍率显微仪，以相差(或暗视场)观察；所述的识别和判断细胞所感染的病原微生物为衣原体包涵体、支原体、淋病双球菌、加德纳杆菌(线索细胞)、白色念珠菌、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、梅毒螺旋体、乳突瘤状病毒(HPV)等。
图1为本发明流程框图。
具体实施列本发明系采用高倍率显微仪对泌尿生殖道病原微生物感染进行检查的一种新方法。它与以往医学上其它任何检查方法不同，其特点是1、用棉拭子或宫颈恻从尿道、阴道或宫颈获取含有粘膜表层细胞的标本，涮洗于标本瓶内的细胞保存液中。经活细胞制片机制成湿片，无须固定、染色等步骤，以盖玻片复盖，即可直接在高倍率显微仪下观察。高倍率显微仪在10倍物镜观察时，放大倍率调节至1000-2000倍。40倍与100倍物镜观察时，放大倍率调节至4000-8000倍，必要时，也可调节至10000-12000倍。一般采用相差视场，当观察细胞浆内或细胞核内微小质粒运动时，也可采用暗视场。2、高清晰放大物像显示在17时计算机屏幕上，根据活细胞和微生物的形态特征与活动状态，以及受感染细胞的类型，识别和判断细胞感染的病原微生物。通过计算机设定的程序，存贮JPG或AVI图像，并打印彩色图文检查报告。
本发明是一种活细胞检查技术，细胞和微生物在高倍率显微仪下呈现活动物像，因而保持了它们的形态特征，有利于细胞、病原微生物的识别、鉴别与诊断。在一份标本中，能同时检查泌尿生殖道常见的各种病原微生物，为患者节省了检查费用。且方法简便、快速，减少了病员的等待时间。与传统检查方法比较，其优越性是显而易见的。
权利要求
1.一种应用高倍率显微仪检查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于从尿道、阴道或宫颈获取含有粘膜表层细胞的标本，放置细胞保存液中，经活细胞制片技术制成活细胞湿片，直接在高倍率显微仪下，采用不同放大倍率的相差观察及暗视场观察。
2.根据权利要求1所述的应用高倍率显微仪检查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于高清晰放大物像显示在计算机大屏幕上，根据活细胞和微生物的形态特征与活动状态，以及受感染细胞的类型，识别和判断细胞感染的病原微生物，通过计算机设定的程序，存贮JPG或AVI图像，并打印彩色图文检查报告。
3.根据权利要求1所述的应用高倍率显微仪检查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于所述的标本为泌尿生殖道粘膜表层细胞的标本。
4.根据权利要求1所述的应用高倍率显微仪检查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于所述的细胞为鳞状上皮细胞和柱状上皮细胞。
5.根据权利要求1所述的应用高倍率显微仪检查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于所述的放大倍率为1000倍-12000倍。
6.根据权利要求1所述的应用高倍率显微仪检查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于所述的细胞保存液为市售的白细胞自动计数仪用细胞稀释液或外科器官移植用器官保存液。
7.根据权利要求1所述的应用高倍率显微仪检查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于所述的活细胞湿片为没有固定、染色的湿片。
8.根据权利要求1所述的应用高倍率显微仪检查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于所述的观察设备为高倍率显微仪，以相差(或暗视场)观察。
9.根据权利要求1所述的应用高倍率显微仪检查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于所述的识别和判断细胞所感染的病原微生物为衣原体包涵体、支原体、淋病双球菌、加德纳杆菌、白色念珠菌、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、梅毒螺旋体、乳突瘤状病毒等。
全文摘要
本发明涉及医疗诊断技术领域，具体为一种应用高倍率显微仪检查泌尿生殖道微生物感染的方法。本发明是一种活细胞检查技术，细胞和微生物在高倍率显微仪下呈现活动物像，因而保持了它们的形态特征，有利于细胞、病原微生物的识别、鉴别与诊断。在一份标本中，能同时检查泌尿生殖道常见的各种病原微生物，为患者节省了检查费用。且方法简便、快速，减少了病员的等待时间。与传统检查方法比较，其优越性是显而易见的。
文档编号C12Q1/04GK101067625SQ20071002823
公开日2007年11月7日 申请日期2007年5月28日 优先权日2007年5月28日
发明者宋士明, 宋若渠 申请人:宋士明