稻瘟菌激发子csbⅰ基因及其克隆方法

专利名称：稻瘟菌激发子csbⅰ基因及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种稻瘟菌糖蛋白激发子 CSB I基因及其克隆方法。
背景技术：
稻瘟病(rice blast disease)是山子囊菌i/ag/7a/ ort/ egrisea (Hebert) Barr[其无性世代为/yr_z'c〃7arj'<s grisea (Cooke) Sacc.] 引起的水稻三大病害之一，在水稻栽培的国家和地区广泛分布并严 重影响水稻的产量和质量。稻瘟病常年均冇不同程度的发生，流行 年份一般减产10%—20%，严軍:时达50%以上。水稻抗稻瘟病品种的 选育和利用是防治稻瘟病的有效措施。但山于稻瘟菌的遗传背景复 杂，易于变异，而且抗稻瘟病品种相对单一化，主栽品种的遗传同 质性，使抗病育种难以跟上稻瘟病菌生理小种的变异速度，常常导 致一个新的具冇抗稻媪病的水稻品种在火面积种植3到5年后就严 重感病。稻瘟菌冇多个生理小种，其中Zd3是广东省优势小种，对 水稻造成很人危害。
激发子是来自于生物的化合物，病原菌产生的激发子能诱导植 物产生不同类型的防卫反应，包括离子渗漏，氧化突发，植物细胞 壁的修饰，植保素及病原相关蛋白的合成，过敏性反应的发生，防 御基因的诱导启动等，从而使植物对病原菌具有杀伤作用或产生抗 性。如果能找到稻瘟菌Zd3生理小种的激发子，将对稻瘟菌诱导抗
病机制研究提供重要的技术资料和基础，为有效提高水稻的产量和
质量做出贡献。

发明内容
木发明的目的是针对现有技术的空白，提供一种稻瘟菌激发子
CSBI基因。
木发明的另-'个目的是提供了所述稻瘟菌激发子CSBI基冈的 简单准确有效的克隆方法。
木发明的技术方案是提供.'种稻瘟菌激发子CSBI基冈，基因 编码的核苷酸序列，cDNA全长序列如SEQ ID N0:1，氨基酸序列如 SEQ ID NO:2。
本发明同时提供了所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法，包 括以下步骤
(1) 稻瘟病菌生理小种菌株培养后提取总RNA;
(2) 以(1)总RNA为模板，采用RT-PCR法合成cDNA第一链； 利用cDNA末端快速扩增技术克隆得到稻瘟病菌生现小种CSB I激发 子的推导cDNA序列。
步骤(l)所述稻瘟病菌生理小种菌株为稻瘟病菌Zd3生理小种。 步骤(1)所述菌株培养为在合适的培养基屮25X:培养4天。 所述培养基为采川酵母浸膏5g和葡萄糖22g用水定容至 lOOOmL，于121。C火齒20 min。
所述稻瘟菌激发子CSBI基因的克隆方法的步骤(2)包括以下
步骤 (a) 设计两条上游简并引物P33A和P39A，进行所述稻瘟病齒 ZC13生理小种总RNA的3， RACE,得到CSB I基因cDNA的3，端的片 段；
(b) 在cDNA的3，端设计一特异引物P5B，并根据3，端序列 与稻瘟菌全基因组数据库的比对结果，在同源性设高的假定蛋白 hypothetical protein MG07877. 4的cDNA编码序列的5，端设计-■ 特异引物P5endA，将其分别作为下游和上游引物扩增cDNA的5，端， 得到CSB I基因cDNA的5，末端片段；
(c) 3'和5'末端拼接得到序列；用3'端序列设计特异引物 P3endB,与P5endA扩增由P3endB反转录稻瘟菌ZC13生理小种总 RNA得到的cDNA，验证拼接得到序列。
歩骤(a)所述引物分别为
P33A: 5， - GYATYAACTACGARWCCGAYCGC-3，；
P39A: 5， - CARCARGCBTGGGTBATYCGTC -3，；
M13 Primer M4: 5， - GTTTTCCCAGTCACGAC -3，。
步骤(b)所述特异引物分别为
P5B: 5， -CTGCAAACACCCTCGAATGACCC- 3，；
P5endA: 5， -GCTTGTTCCGACGAGTCCTTGT- 3，。
步骤(c)所述引物为
P3endB: 5， -GGCGCATTACAGGTAGCTAGTCA- 3，。 本发明的有益效果是本发明中的CSB I激发子可以诱导水稻产 生抗病性，抵抗稻瘟病菌的侵染。所获得的CSB I激发子cDNA序列，
除了可以作为进一歩研究稻瘟病菌与水稻相互作川的机制之外，可
以进行转化水稻进行抗病育种使川，并且将CSBI激发子基因转化 到真核微生物屮，所表达的CSBI可以作为防治水稻病害的新药剂 一一植物抗病诱导剂使川。这种抗病诱导剂具有高效、安全、持久 的特点。


图1 ZC]3CSB I激发子cDNA序列3， RACE第-'次扩增产物电泳
图
图2 ZC13CSB I激发子cDNA序列3， RACE巢式扩增产物电泳图 图3 ZC13CSB I激发子cDNA序列5， RACE产物电泳图 图4 ZC13CSB I激发子cDNA推导序列巢式扩增产物电泳图
具体实施例方式
下面结合具体实施例及附图对本发明作进^ '歩详细的描述。 极据已测的稻瘟菌ZC13生理小种CSB I激发子肽段编码序列设
计引物，克隆CSBIcDNA的全长序列，按照编码规则推导出CSB I
的氨基酸序列。包括以下步骤
(1) 稻瘟病菌生理小种菌株培养后提取总RNA;
(2) 以(1)总RNA为模板，采用RT-PCR法合成cDNA第一链； 利用cDNA末端快速扩增技术克隆得到稻瘟病菌生理小种CSB I激发 子的推导cDNA序列。
步骤(1)过程如下
低温保存的稻瘟病菌ZC13生理小种菌株经活化后接种在液体培
养基于25'C培养4天，液体培养基为酵母没膏5g、葡萄糖22g，用 水定容至1000mL， m。C，火菌20 min。然后用2层普通滤纸以布 氏漏斗滤出齒丝，经双蒸水ddH20充分洗涤，真空泵抽干水分。
改进OMEGA公rfj的真齒RNA抽提纯化试剂盒E. Z. NA Fungal RNA Kit方法提取总RNA。方法如下
首先将抽滤收获的齒丝放入研钵屮，加液氮速冻后研磨成粉末， 取约50mg粉末转移到川液氮预冷的1. 5mL离心管屮，向离心管屮加 入600 u L RM裂解液RFL和12 u L P -巯基乙醇快速混匀，振荡10 秒，使菌丝粉末完全溶解。然后加入140 uL RNA抽提液SP，颠倒 混合数秒钟，冰浴15分钟，室温离心10 000 g， 10min，吸取上清， 再加入140 yL RNA抽提液SP，重复抽提-'次，以完全除去除菌丝 体屮的蛋白质和多糖。接着吸取十.清，加入等体积异丙醇，室温离 心10 000 g， 10min，弃上清，离心管倒置于干净滤纸上，流干其 中的液体。加350uL 65。C预热RB缓冲液，350 w L溶解RNA沉淀， 加入350uL 75%的乙醇，振荡混匀。再将混匀的样品移入HiBind RNAspin吸附柱中，放入2mL离心管中，室温离心10 000 g， 30sec， 取出吸附柱，倒掉离心管屮的滤液。吸附柱中加入750uL洗脱缓冲 液I，室温离心10 000 g， 30sec，取出吸附柱，倒掉离心管中的滤 液。吸附柱屮加入500 y L洗脱缓冲液II，室温离心10 000 g， 30sec， 取出吸附柱，倒掉离心管中的滤液，重复一次。最后加入30uL的 DEPC水，放入新的1.5mL离心管中，室温离心10 000 g， lmin,所 获洗脱液即为提取的RNA。
歩骤(2)实验过程如下
(a)设计两条上游简并引物P33A和P39A，进行所述稻瘟病菌ZC13 生现小种总RNA的3， RACE,得到CSB I基因cDNA的3，端的片段。 见附图1 ZC13CSB I激发子cDNA序列3，RACE第--'次扩增产物电泳图， 其屮M: DNA Marker (标志)，3， RACE第-？欠扩增产物，不同退火温 度条件摸索1、 60.8°C、 2: 60. 5°C、 3: 59.8°C、 4: 59.0°C、 5: 58. 2°C、 6: 57. 8°C、 7: 57. 5°C、 8: 56. 9°C。
质谱测得的CSB I激发子肽段氨基酸序列，在GenBank屮杏找 同源序列，根据同源序列的氨基酸密码子的偏好性，同吋考虑稻瘟 菌密码子使用频率，利用01igo6软件设计两条上游简并引物P33A 和P39A，进行3， RACE。
P33A: 5， - GYATYAACTACGARWCCGAYCGC-3， P39A: 5， - CARCARGCBTGGGTBATYCGTC _3， Ml3 Primer M4: 5， - GTTTTCCCAGTCACGAC -3， 首先合成cDNA的第一链，在200 u L PCR管屮配制卜'列反应液: luL总RNA， 1pL IOX反转录缓冲液，10mM的dNTPs luL, 40units/uL的RNA酶抑制剂0. 25uL， 2. 5pmo1 >L的Oligo dT-Adaptor反转录引物0. 5pL， 5 units 的AMV反转达录酶
0. 5uL， 25mmol/L的MgCl2 2uL，加DEPC处理ddH20至总体积 10uL。混合均匀后置TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上，30°C 反应IO min， 42。C保温60 min， 99。C反应5 min， 5。C冷却5 min。 然后以P33A和3，端锚定引物M13 Primer M4进行第一轮RT-PCR，
在冰上准备下列反应物5units/uL的ExTaqHS0. 25uL， 5XPCR 缓冲液10"， 20 umol/L的上游引物P33A 0.5"L， 20umol/L 的M13 Primer M4 0. L，加入火菌d孤0至总体积40"。混匀 后加入到上述反应完成的10 u L cDNA模板屮，置TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上进行扩增:94°C， 2min预变性;94°C， 30sec变性; 59. 0°C， 30sec退火；72°C， 2min延仲；35个重复循环，设后72 °C，延仲7min。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测到约1400bp 的特异性最强的条带。
然后将第-'轮PCR产物稀释10倍用于第二轮巢式PCR扩增。见附 图2ZC^CSBI激发子cDNA序列3， RACE巢式扩增产物电泳图，其屮 M: DNAMarker， 3， RACE巢式扩增产物，不同退火温度条件摸索1: 55.7°C、 2: 56.4°C、 3: 57.2°C、 4: 58.0°C、 5: 58.9°C、 6: 59.7 °C、 7: 60. 6°C、 8: 61.6°C。巢式PCR的反应体系为1 u L第一轮 扩增产物，5units/uL的rTaq 0. 25liL， 10XPCR缓冲液5 ti L， 2. 5腿ol/L的dNTPs4u L， 25腿ol/L的MgCl2 3 u L， 20umol/L的上 游引物P39A 1pL， 20umol/L的下游引物M13 Primer M4 1 u L， 加入灭菌ddH20至总体积50 uL。混匀后在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上，进行扩增94°C， 2min预变性；94°C， 30sec变 性；61.6°C， 30sec退火；72°C， lmin30sec延伸；35个重复循环， 最后72°C，延仲7min。反应结束后在1%琼脂糖凝胶电泳检测到一 条约900bp的特异DNA条带，用北京天根生化科技有限公口'J的 TIANgel Mini普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，将该片段与首
轮扩增特异性最强的片段克隆、交上海英骏生物技术有限公司测序 后，发现首轮扩增特异性条带全长1362bp，巢式扩增序列特异性条 带全长907bp。分析后发现，巢式扩增片段与首轮扩增片段的下游 部分完全重合，首轮扩增的特异性片段编码序列包含CSBI激发子 用于设计简并引物的两肽段。在片断中还包括 "个终止密码子TGA。 在终止密码子下游包含一个长139bp的3'端非编码区，含16个腺 苷酸的poly (A)，由此证实得到的片段为CSB I基因的3'端的片段。
(b)在cDNA的3，端设计一特异引物P5B，并根据3'端序列与稻 瘟菌全基因组数据库的比对结果，在同源性最高的假定蛋白 hypothetical protein MG07877. 4的cDNA编码序列的5，端设计一 特异引物P5endA，将其分别作为下游和上游引物扩增cDNA的5，端，
得到CSB I基因cDNA的5，末端片段；见附图3 ZC13CSB I激发子 cDNA序列5， RACE产物电泳图，其屮，M: DNAMarker， 1、 2: cDNA5， 末端扩增产物。
根据3， RACE克隆测序结果在cDNA的3，端设计一特异引物 P5B，并根据3'端序列与稻瘟菌全基因组数据库的比对结果，在同 源性最高的假定蛋白(hypothetical protein MG07877. 4)的cDNA 编码序列的5'端设计一特异引物P5endA，将其分别作为下游和上 游引物扩增cDNA的5，端
P5B: 5， -CTGCAAACACCCTCGAATGACCC- 3，
P5endA: 5， -GCTTGTTCCGACGAGTCCTTGT- 3，
首先合成cDNA的第一链，在200 u L PCR管中配制下列反应液
luL总RNA， luL IOX反转录缓冲液，10mM的dNTPs 1pL， 40units/ti L的RNA酶抑制剂0. 25"， 2. 5pmo1 /叱的P5B反转 录引物0. 5uL， 5 units/uL的AMV反转达录酶0. 5 " L， 25mmol/L 的MgCl2 2 " L，加DEPC处理ddH20至总体积10 u L。混合均匀后置 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上，30。C反应10 min， 42。C保温 30 min， 99。C反应5 min， 5。C冷却5 min。
然后进行RT-PCR，在冰上准备下列反应物5units/' y L的Ex Taq HS 0. 25u L, 5XPCR缓冲液10 y L， 20 y mol/L的上游引物P5endA 0.5uL,加入灭菌ddH20至总体积40uL。混匀后加入到十.述反应完 成的10 uL cDNA模板屮，置TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上 进行扩增94°C， 2min预变性;94°C， 30sec变性;55.3。C， 30sec 退火；72°C， 1 min30sec延伸；35个重复循环，最后72°C，延伸 7min。反应结束后在1%琼脂糖凝胶电泳检测到一条约1200bp的特 异DNA条带，用北京天根生化科技有限公司的TIANgel Mini普通琼 脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，将该片段克隆、交上海英骏生物技 术有限公司测序后，发现扩增特异性条带全长1158bp。序列分析后 发现，除掉它与3'端重叠片段后，还包含969nt序列，其中包含 N-端全部已测出氨基酸序列和1个起始密码子ATG。起始密码子前 有35nt的5'端非编码区。从序列分析结果可以证实，片段为CSB I基因的5'末端片段。
(c) 3'和5'末端拼接得到序列；用3'端序列设计特异引物 P3endB，与P5endA扩增由P3endB反转录稻瘟菌ZC13生理小种总
RNA得到的cDNA，验证拼接得到序列。
用3'端序列设讣特异引物P3endB，与P5endA扩增由P3endB 反转录稻瘟菌ZC13生现小种总RNA得到的cDNA，验证拼接得到序
P3endB: 5， -GGCGCATTACAGGTAGCTAGTCA- 3，
合成cDNA的第一链，在200uLPCR管屮配制下列反应液1" 总RNA， 1 u L IOX反转录缓冲液，10mM的dNTPs 1 y L， 40units/u L 的腿酶抑制剂0.25"， 2. 5pmo1 /叱的P3endB反转录引物 0. 5 u L， 5 units / u L的AMV反转达录酶0. 5 u L， 25,1/L的MgCl2 2 p L，力口 DEPC处理ddH20至总体积10 u L。混合均匀后置TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上，3CTC反应10 min， 42。C保潟.60 min， 99 。C反应5 min， 5。C冷却5 min。
然后进行RT-PCR，在冰上准备下列反应物5units/ u L的Ex Taq HS0.25uL, 5XPCR缓冲液10uL， 20 u mol/L的上游引物P5endA 0.5"，加入火菌ddH20至总体积40uL。混匀后加入到上述反应完 成的10uL cDNA模板中，置TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上 进行扩增94°C， 2min预变性;94°C， 30sec变性；55°C， 30sec 退火；72°C， 2min30sec延伸；35个重复循环，最后72°C，延伸7min。 反应结束后在1%琼脂糖凝胶电泳检测到一条约2200bp的特异DNA 条带，用北京天根生化科技有限公司的TIANgel Mini普通琼脂糖凝 胶DNA回收试剂盒回收，将该片段克隆、交上海英骏生物技术有限 公司测序后，发现扩增特异性条带大小为2281bp。
测序结果发现该序列与由3'和5'末端拼接得到的序列吻合。
CSB I cDNA序列全长2331bp，包含 一个2157bp的0RF，编码含有718 个氨基酸残基的蛋白质。附图4为ZC13 CSB I激发子cDNA推导序列 巢式扩增产物电泳图，其屮M: DNAMarker， 1、 2: cDNA序列巢式扩 增产物。SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<12()〉稻瘟菌激发子CSB I基因及其克隆方法
<130〉
<160〉 2
<170> Patemtln version 3,2
〉1
> 2:348
> DNA 〉人丄序列
>
〉CDS
〉(36). (2192) <40()> 1
gcttgttccg acgagtcct.t gtcgaactat caatc atg cat gtt acc agg age 53
Met His Val Thr Arg Ser 1 5
ttg ttg gcg gcg gtc gcc ctg ccc gtc gcc tgg gcc a.ta acc cca gag 101 Leu Lmi Ala Ala Val Ala Leu Pro Val Ala Trp Ala lie Thr Pro Glu 10 15 20
get at,g ctg tea gca aac egg tat tct gat gcc gtg ccc a.at ccg tea 149 Ala Met Leu Ser Ala Asn Arg Tyr Ser As()人la Val Pro Asn Pro Ser 25 30 35
gga gaa ttt get etc ttc a.ca gcc aac aag tac tct ttc gag teg ggt 197 Gly Glu Phe Ala Leu Phe Thr Ala Asn Lys Tyr Ser Phe Glu Sei. Gly 40 45 50
tct cga tag aa.c tgg tgg aac ate ttg gac etc a.a.g acc ggc gac ate 245 Ser Arg Gin Asn Trp Trp Asn lie Leu人sp Leu Lys Thr Gly Asp lie 55 60 65 ' 70
tct gtt tgg ttc犯c gga tec gac att tec gag gtt gtg ttt gcc ggt 293 Ser Val T丄'p Phe Asn Gly Ser Asp lie Ser Glu Val Val Phe Ala Gly 75 80 85
ccg act ccg acc age ate ate tac etc aac ggc acc aat get gaa gag 341 Pro Thr Pro Thr Ser lie lie Tyr Leu Asn Gly Thr Asn Ala Glu Glu 90 95 100
gat gga ggt gtc age ttg tac gcc gcg gat etc cac teg ccg aca aac 389 Asp Glv Gly Val Ser Leu Tvr Ala Ala Asp Leu His Ser Pro Thr Asn 105 110 115
gcc acc eta gtg gcc tec ctt ccg gcc ccc tac tec gga etc aaa gcg 437 Ala Thr Leu Val Ala Ser Leu Pro八la Pro Tyr Ser Gly Leu Lys Ala 120 125 130 '
gcg cgc aca tct tct ggc gac ate aac ttc ctg etc acc gcc aag gcg 485 Ala Arg Thr Ser Ser Gly Asp lie Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Ala 135 14b 145 ' 150
tac cct aac gga act gtg tac aac gag cag ctt gcc acc aa.g gcg agg 533 Tyr Pro Asn Gly Th丄'Val Tyr Asn Glu Gin Leu Ala Thr Lys Ala Arg ]55 160 165
age txa gcc aac att tac acg teg ctg tat c(',t cgt cac tgg gac tac 581 Ser Ser Ala Asn lie Tyr Thr Ser Leu Tvr Pro Arg His Trp Asp Tyr 170 175 ' 1,80 '
tgg ctg acc ccc cag aaa a.at gcc gtt ttc gga, ggt gtc etc sag tct 629 Trp Leu Thr Pro Gli Lys Asn Ala Val Phe Glv Glv Val Leu Lvs Ser 185 190 195
ggt age age ggc tac tec etc tct ggc aac etc acc aac tac gtc act 677
J 2 C
2 2Gly Scr Scr Glv Tyr Scr Leu Ser Gly Asn Leu Thr Asn Tyr Val Thr '200 205 ' 210 '
gga 8t,a tgc gac gtt att tgc gcc gag age ccg tac gac etc aac ggt 725
Gly lie Cys Asp Val lie Cys Ala Glu Ser Pro Tvr Asp Leu Asn (;lv 2L5 220 225 23b
get age gac tac gag ctt tec ccc gac ggc age aag gtt get ttc atg 773
Ala Ser Asp Tyr Glu Leu Ser Pro Asp Gly Ser Us Val Ala Phe Met
235 24b 245
a.cc aag gat att gga ct.t exc etc gcc aac acg acg age acc cag ate 821
Thr Lys八sp Ilo Gly Leu Pro Ltni人la Asn Thr Thr Ser Thr Gin lie 250 255 260
tac ctt gtc ccc ttc acc ggt acc gcc aag gat get gtc ccc ate aac 869
Tyr Leu Val Pro Phc Thr Gly Thr Ala Lys Asp Ala Val Pro lie Asn 265 270 275
ccc cgt age age age gcc aag tac ccc gag gcc cag ggc get tcg gcg 917
卩丄'o A丄'g Ser Ser Sor Ala Lvs Tyr Pro Glu Ala Gin Gly Ala Sei' Ala ， 2b5 290
age ccc ttt ttc tct ccc gac age age aag att gca tac gtg cag atg 965
Ser Pro Phe Phe Ser Pro Asp Ser Scr Lys lie Ala Tyr Val Gin Mel; 295 300 305 310
aat ggc ate aac tac gag tec gac cgc tec 3tc ctg tac gtc gcc gac 1013
Asn Giy lie Asn Tyr Glu Scu' Asp Arg Ser lie Leu Tyr Val /Ua Asp
315 320 325
gcc aac ggt gac aag gag aag ggc ttc aac at,c acc a.gg ctg get ggt 1061
Ala Asn Gly Asp Lys Glu Lvs Gly Phe Asn lie Thr Arg Lou Ala Gly 330 335 340
gac tgg gac cgc gca cca ggc tcg gcc aag tgg tcg cac gac ggc gag 1109
Asp Trp A叩Arg Ala Pro 6ly Sei' Ala Lys Trp Ser IUs Asp Gly Glu 345 350 355
acc ata tat gcc gac gcc gcg gac ctg ggt cat tcg agg gtg ttt gca 1157
Thr lie Tvr Ala Asp Ala Ala Asp Leu Gly Ilis Ser Arg Val Phe Ala 360 365 370
gta ccc ctg aca get ggc gat tcg tat gtg ccc aag aac ate acc gac L205
Val Pro L^u Thr人la Gly Asp Ser Tyr Val Pro Lys Asn lie Thr Asp 375 380 385 ' 390
cag ggt tec gtt get gga ttc tac cca ctt ccg gat ggc tct gtg etc 1253
Gin Gly Ser Val Ala Gly Phc Tyr Pro Leu Pro Asp Gly Ser Val Uu
395 400 405
gtc tec gac tec aag ata tgg tcg age egg gac att cac aca gtg tcg 1301
Val Ser人sp Ser Lys lie Trp Ser Ser Arg Asp lie His Thr Val Ser 410 415 420
ggc gag ggc aag ggg tct acc aag gtt tac ttc cag gcc aac etc gcc 1349
Gly Glu Gly Lys Gly Ser Tlu' Lys Val Tyr Phe Gin Ala Asn Uu Ala 425 430 435
gat tcg gag cU get ggc etc age tcg gcc gac gtg tec gag ttt tac 1397
八sp Ser Glu Uu Ala Gly Leu Ser Ser Ala Asp Val Ser Glu Phe Tyr 440 445 450
tac age age aac acc acc gag aac aag cag cag get tgg gtg att cgt 1445
Tyr Ser Ser Asn Thr Th丄'Glu Asn Lys Gin Gin Ala Trp Val lie Arg 455 460 465 470
ccg gcc gga. ttt gac age aca aag aag tat ccc ttg get ttc ate acc 1493
Pro Ala Gly Phe Asp Ser Thr Lys Lys Tyr Pro Uu Ah Phe lie Thr
475 * 485
ca,c gga. gga ccg ca,a gga gcg cac age aac a_cg tgg age acc cgc tgg 1541
His Gly Gly Pro Gin Gly Ala His Ser Asn Thr Trp Ser Thr Arg Trp 490 495 500
aac ttt aag gtg tgg gcc gac cag ggc tac gtt gtc gtt gcg ccc匿 1589Asn Phe Lys Val Trp Ala Asp 5*35
Gin Gly Tyr Val Val 510
Val Ala Pro 515
Asn
ccg acc gca teg act ggt t,tc Pro Thr Ala Ser Thr Gly Phe 520 525
gga. cag aac ttg acc Gly Gin Asn Leu Thr 530
gat gcc gtg Asp Ala Val
teg Ser
1637
gga. egg tgg aga. act gtg tac
(;iy Arg Trp Arg Thr Val Tyr
53.5 540 '
gtg agg gat肌c ctt gac tat
Val Arg Asp Asn Leu Asp Tyr 555
tgg gat a.tt gtg cac Trp Asp lie Val His 545
gtc gac acc gag aat Val Asp Thr Glu Asn 560
get tgg gag Ala Trp Glu
gga. ate gag Gly lie Glu 565
ta.t Tyr 550
gcc Ala
1685
1733
gga. gcg age ttt ggt ggt tac Gly Ala Ser Phe Gly Gly Tyr 570
atg acc aac ta.c ate Mot Thr Asn Tyr lie 575 '
ca.a ggt cag Gin Gly Gin 58b
ccg Pro
1781
ttg ggc cgc gag Uc sag gca. Leu ()lv Arg Glu Phc Lys Ala 585
etc gta acc cac gat Lou Thr His Asp 590
ggt gtt acc Gly Val Thr 59^
teg Ser
1829
act etc aac cag tac get a.ca Thr Leu Asn Gin Tyr Ala Thr 600 ' 605
gat gag cU tgg ttc Asp 6lu Leu Trp Phe 610
atg aac cac Met Asn His
gac Asp
1877
ttc erne ggc cct ttc aac cag Phc Asn Gly Pro Phe Asn Gin 615 620
tea tec aac gaa cct Ser Ser Asn Glu Pro 625
ggc teg ccg 61y Ser Pro
tac Tyr 630
1925
tac gac tgg aac ccg ctt cgc Tyr Asp Trp Asn Pro Leu Arg 635
tac att gac aac tgg Tyr lie Asp Asn Trp 640
gcc a.cg ccg Ala Thr Pro 645
His
i973
ttt gtc ate cac aac gac etc Phd Val lie His Asn Asp Leu 650
gac tac cgt ctt ccc Asp Tyr Arg Lcni Pro 655
gtg tec gag Val Sor Glu 660
ggc Gly
2021
gtc atg ctg ttc aac ctg etc Val Met Leu Phe Asn Leu Leu 665
cag gtc a.a.g gga gU Gin Val Lys Gly Val 670
ccc age aag Pro Ser Lys 675 '
Uc Phe
2069
ctg aac ttc cca gac gag aac Leu Asn Phe Pro Asp Glu Asn 680 685
cac tgg gtc acc肪g ll丄s Trp Val Thr Lys 6§0
cct gag肌c Pro Glu Asn
age Ser
2117
ctg gtc tgg cac acg gag ate Lgu Val Trp His Thi' Glu lie 695 700
ttt aac ttt 2itc aac Phe Asn Phe lie Asn 705
tac ta.c age Tyr Tyr Ser
ggt Gly 7L0
2165
gtc gat aac teg act agt ccg Val Asp Asn Ser Thr Ser Pro 715
ttt tg￡i aaeictaggtt ga.ggttta.gg Phe
2212
a.aggatataa cgagatccca ggtcttggat taatgtacat gtgatatga.c tagctacctg 2272 tfmtgcgccei taccaiga.taa. t朋cgacgit8肪tgtctcgc gtceiaiei^aB Et犯a朋a^g 2332 tcgtgactgg gaaaac 2348
<210> 2
<211> 718
<212> PRT <213〉人工序列
<400〉 2
Met, His Val Thr Arg Ser Leu Ala Ala Val Ala. Leu Pro Val Ala 15 10 15
Trp Ala. Jle Thr Pro Glu Ala Met Leu Ser Ala Asn Arg Tyr Ser Asp 20 25 3b
Ala Va丄Pro Asn Pro Ser Glv Glu Phe A—la Leu Phe Thr Ala Asn L\'s 35 ."10 45
Tyr Ser Phe Glu Ser Gly Ser Arg Gin Asn Trp Trp Asn lie L_eu Asp
50
55 .60
Leu Lys Thr GLy Asp lie Ser V'ai Ti'p Phe Asn Gly Ser .Asp lie Ser
65
70
75 . . 80
G"i VaL Val Phe Ala Gly Pro Tlir Prcr Thr Ser lie lie Tyi' Leu Asn
85
90 95
Gly Thi' Asn Ala Ghi Glu Asp Gly Gly Val Ser Leu Tyr Ala Ala Asp
100
105 110
Leu His Ser Pro Thr Asn Ala Thr I.,eu Val Ala. Set' Leu Pro Ala Pro
115
120 125
Tyr Set- Gly Leu Lys Ala ALa Arg Thi' Ser Ser Gly Asp lie Asn Plie
130
135 140
Leu Leu Thr Ata Lys Ala Tyr Pi.o Asn Gly Thr Val Tyr Asn Ghi Glri
145
■150
155 160
Leu A.la Thr Lys Ala Arg Ser Ser Ala Asn [Le Tyr Tlir Ser Leu Tyr
165
170 175
Pi;o Avg His. Tvp Asp Tn' Trp 1—eu Tlvt. Pi'o Gh、 Lys Asii Ala Val Pl'ie 180 185 190
Gly Gly Val, Leu Lys Ser Gly Ser Ser GW Tyr Ser Leu Ser Gly Asn 195 200 205
Leu Thr Asi Tyr Val Thr GI.y [le Cys Asp VaL [le Cys Ala Glu Ser 210 215 220
Pi-o Tyr Asp l,eu Asn Gly Ala Ser Asp Tyr Glu Leu Ser Pro Asp Gly
225 230
235
240
Sei' Lvs VaL Ala Phe Met Tlir Lvs Asp lie Gly Leu Pro Leu Ala Asn 245 250 255
Thr Tlir Ser Thr G:ln lie Tyr Leu Val Pro Phe Thi' Giy Thr A丄a Lys
260 265
270
Asp Ala VaL Pi.o [Le Asri Pro Arg Sei' Set' Ser Ala Lys Tyr Pro Glu
275 280
285
Ala Gin Gly Ala Ser Ala Ser Pro Phe Phe Ser Pto Asp Ser Ser Lys
290 295
300
lie Ala Tyr Val Gin Met Asn Gly lie Asn Tyr Glu Ser Asp Arg Ser
305
310 315
320
ILe Leu Tyr Val Ala Asp Ala Asn Gly Asp Lys Glu Lys Gly Phe Asn
325 330
335
:le Thr Arg Leu Ala. Giv Asp Trp Asp Arg Ala Pro Gly Ser Ala Us 340 345 350
Trp Ser His Asp G:l.y G].u Thr lie Tyi' Ala Asp Ala AJa Asp Leu Gly 355 360 365
His Ser Ai'g Val Phe Ala Val Pro Leu Thr A.la Gly Asp Ser Tyr VaJ 370 375 38i)
Pro Lys Asn lie Thr Asp G:l" GIt Ser Val A]a Gl.v Phe Tyr Pro Leu 385 390 395 400
Pro Asp Gly Ser Va'l L,eu Val Ser Asp Ser l,ys Ue Trp Ser Ser Arg 405 410 415
Asp lie His Tlir Val SeT' Gly Glu Gly l,ys Glv Ser Thr Lys Val Tyr 420 42^ 4i30
Phe G]n Ala Asn Leu A]a. Asp Ser Glu l'eu A.a G〗y Leu Ser Ser Ala 435 440 445
Asp Va.l Ser Glu Phe Tyr Tvr Ser Ser Asn Thr Thr Glu Asn Lys Gin 450 455 460
Gin Ala. 'hp Va.l lie Arg Pro Ala, Gly Phe Asp Ser Thr Lys Lys Tyr 465 470 475
Pro Leu Ala Phe lie Thr His Gly G丄v Pro Gin Gly Ala His Ser Asii 485 490 495
Thr Trp Ser Thr Arg Trp Asn Phe Lvs Val Trp Ala. Asp G.ln G]v Tyr 500 5i)5 510
Val Val Val Ala Pro Asn Pro Thr Ala Ser Thr Gly Phe Gly Gin Asn 515 520 525
Leu Thr A印Ala Val Ser Gly Arg Trp Arg Thr Va.l Tyr Trp Asp lie 530 540
Val His Ala Trp Glu Tyr Val Arg A印Asn Leu Asp Tyr Val Asp Thr
545 550 555
560
Glu Asn G].y lie Glu Ala G丄y Ala Ser Phe Gly Gly Tvr Met Thr Asn 565 570 575
Tyr Ue Gin G.l.y Gin Pro Leu Gly Arg Glu Phe Lys Ala Leu Val Thr 580 585 590
His Asp Gly Val Thr Ser Thr Leu Asn Gin Tvr Ala Thr Asp Glu Leu 595 600 605
Trp Phe Met Asn His Asp Phe Asn Gly Pro Phe Asn GJti Ser Ser Asn 610 615 620
Glu Pro Gly Ser Pro Tyr Tvi' Asp Trp Asn Pro Leu Arg T，,r lie Asp 625 6i30 635 640Asn Tip Ala Thr Pro His Phe Val lie His Asn Asp Leu Asp Tvr Arg 645 650 655
Leu Pro Val Ser Glu Gly Val Met Leu Phe Asn Leu Leu Gn Val L,ys 660 665 670
Gly Val Pro Ser Lys Phe l,eu Asn Phe Pro Asp Glu Asn His Trp Va] 675 680 685
Thr Lys Pro G]u Asn Sei' Leu Val Trp His Thr Glu lie Plie Asn Phe
695 700
lie Asn Tyr Tvr Ser Gly Val Asp Asn Ser Thr Ser Pro Phe 705 7li) 71权利要求
1、一种稻瘟菌激发子CSB I基因，其特征在于所述基因编码的核苷酸序列，cDNA全长序列如SEQ ID NO1，氨基酸序列如SEQ IDNO2。
2、 权利要求1所述稻瘟菌激发子CSBI基因的克隆方法，其特 征在于包括以下步骤(1) 稻瘟病菌生理小种菌株培养后提取总RNA;(2) 以(1)总RNA为模板，釆用RT-PCR法合成cDNA第一链； 利用cDNA末端快速扩增技术克隆得到稻瘟病菌生理小种CSB I激发 子的推导cDNA序列。
3、 根据权利要求2所述稻始:菌激发子CSB I基因的克隆方法， 其特征在于步骤(1)所述稻瘟病菌生理小种菌株为稻媪病菌ZC13 生理小种。
4、 根据权利要求2所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法， 其特征在于步骤(1)所述菌株培养为在培养基中25"C培养4天。
5、 根据权利要求4所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法， 其特征在于所述培养基为采用酵母浸膏5g和葡萄糖22g用水定容至 lOOOmL，于121。C灭菌20min。
6、 根据权利要求2所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法， 其特征在于步骤(2)包括以下步骤(a)设计两条上游简并引物P33A和P39A，进行所述稻瘟病菌 ZC13生理小种总RNA的3， RACE,得到CSB I基因cDNA的3，端的片段；(b) 在cDNA的3，端设计一特异引物P5B，并根据3'端序列 与稻瘟菌全基因组数据库的比对结果，在同源性最高的假定蛋白 hypothetical protein MG07877. 4的cDNA编码序列的5，端设计一 特异引物P5endA，将其分别作为下游和上游引物扩增cDNA的5'端, 得到CSB I基因cDNA的5，末端片段;(c) 3'和5'末端拼接得到序列；用3'端序列设计特异引物 P3endB，与P5endA扩增由P3endB反转录稻瘟菌ZC13生理小种总 RNA得到的cDNA，验证拼接得到序列。
7、 根据权利要求7所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法， 其特征在于步骤(a)所述引物分别为<formula>formula see original document page 3</formula>.
8、 根据权利要求7所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法， 其特征在于歩骤(b)所述特异引物分别为<formula>formula see original document page 3</formula>.
9、 根据权利要求7所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法， 其特征在于步骤(c)所述引物为<formula>formula see original document page 3</formula>.
全文摘要
本发明公开了一种稻瘟菌激发子CSB Ⅰ基因及其克隆方法，所述基因编码的核苷酸序列，cDNA全长序列如SEQ ID NO1，氨基酸序列如SEQ ID NO2。根据已测的CSB Ⅰ激发子的肽端编码序列设计引物，以稻瘟病菌ZC₁₃生理小种总RNA为模板，采用RT-PCR方法，合成cDNA第一链，利用cDNA末端快速扩增技术克隆得到了稻瘟病菌ZC₁₃生理小种CSB Ⅰ激发子的推导cDNA序列。本发明能作为广泛、大量研究激发子诱导水稻产生抗病性的机制的基础，并供研究水稻转基因育种使用。
文档编号C12N15/29GK101186917SQ20071003205
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月4日 优先权日2007年12月4日
发明者李云锋, 王振中, 童英林, 纪春艳, 董章勇 申请人:华南农业大学