用小鼠模型从微生物代谢产物中筛选药物的方法

文档序号:434022阅读:1116来源:国知局
专利名称:用小鼠模型从微生物代谢产物中筛选药物的方法
技术领域
本发明涉及动物行为学和药物筛选领域。更具体地,本发明涉及一种用动 物模型从微生物代谢产物中筛选药物的方法,以及利用该方法筛选得到的候选活 性物质以及所述候选活性物质的用途。
背景技术
自然界中微生物的多样性及其代谢产物的多样性,为从微生物代谢产物及 其衍生物中开发新药或其先导化合物提供了不竭的源泉。人类从微生物次生代谢产物中筛选药物的历史,最早可以追溯到1928年英 细菌学家Fleming偶然发现青霉菌能抑制葡萄球菌的生长。而后Florey和Chain 将青霉素用于感染性疾病的治疗并取得了惊人的疗效,这标志着抗生素时代的 到来。抗生素的使用基本上控制了细菌感染性疾病的大规模爆发,使人类的平 均寿命延长了15年以上,因此青霉菌的发现被认为是二十世纪生物医学史上的 十大发现之一。所谓的"微生物次生代谢产物",是指在微生物次生代谢过程中产生的极 其微量的、对微生物本身的生命活动没有明显作用,而对其他生物体往往具有 不同的生理活性作用的一类小分子化合物(戈梅、陈代杰。关注微生物来源的新 药开发。生命科学.2005;17(1):15-18)。为人们所熟知的抗生素就是一类在临床 上广泛使用的微生物次生代谢产物。此外,微生物次生代谢产物还包括微生物 次生代谢过程中分泌的色素、毒素、信息素、酶抑制剂、免疫调节剂、受体激 动剂和拮抗剂、肿瘤抑制因子、生长因子等多种活性物质(Arnold L. Demain。 微生物次级代谢的诱导,"Induction of microbial secondary metabolism ,, 她,"M,c油.o〃丄(1998) 1:259—264)。需要特别指出的是,从微生物次生代谢产物中获得的这类小分子物质用化学方法往往难以合成,即使在实验室能够合成也不易实现产业化。以微生物次 生代谢产物作为先导化合物,通过化学修饰或组合转化的方法得到具有应用价 值的活性物质,已成为开发新药的一条可行途径。通过各种分离培养和筛选检测技术,人们从微生物次生代谢产物及其衍生 物中,筛选到了包括具有抗微生物感染和抗肿瘤、抗病毒作用的传统抗生素以 及酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和其他具有特殊药理活性的多种物质,即微生物药物(microbial medicine)(张月琴、刘红宇。《微生物代谢产物药理活 性描述规范(试行)》)。目前,国内外对微生物药物的研发主要集中在抗耐药菌和抗真菌抗生素、 微生物来源的酶抑制剂和免疫抑制剂、非典型大环内酯类抗生素等方面,并且 都取得了一定的进展(1) 针对近年来临床上颇为棘手的青霉素耐药肺炎链球菌(PRSP)、甲氧西林 耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)等耐药菌,从微物次生代谢产物中开发了一系列 对控制由耐药菌和真菌引起的感染非常有效的药物,如链阳性菌素类抗生素共 杀霉素、肽类抗生素替考拉宁、达托霉素,以及新型抗真菌抗生素卡帕芬净、 米卡芬净和阿尼芬净(anidulafungin)等;(2) 从微生物次生代谢产物中发现了可抑制胆固醇合成过程中限速步骤的 酶抑制剂,即HMG-CoA还原酶抑制剂洛伐他丁和普伐他汀,随后应用化学合 成的方法很快获得了辛伐他汀、氟伐他汀和罗舒伐他汀等一系列他汀类降血脂 药物,在治疗心血管疾病领域取得了良好的疗效(Wojakowski W, Gminski J。 心血管基本预防中的HMG-CoA还原酶抑制剂新机制、方面和试验,"HMG-CoA reductase inhibitors in prevention of cardiovascular diseases: new mechanisms, aspects and trials" . /Vzeg/U.2000;57(5):291-295);(3) 免疫抑制剂环孢素A最初是作为抗真菌药物被发现的,随后被应用于抗 器官移植排斥反应效果显著,此外西罗莫司(雷帕霉素)、他克莫司(FK-506)、霉 酚酸以及咪唑立宾等一系列免疫抑制剂也已经被应用于临床治疗,微生物来源 的免疫抑制剂药物的问世无异于掀起了临床免疫抑制疗法的一场革命;(4) 阿弗菌素类抗虫抗生素是近年来开发的一类非典型大环内酯类抗生素,目前主要用于治疗动物寄生虫感染疾病,并且在控制和治疗人盘丝虫病上亦发 挥了重要的作用,已经应用和正在开发的主要品种有阿维菌素、莫克西汀、密比克汀、普林米克汀(prinomectin)等。除了以上提及的几类微生物药物外,在微生物次级代谢产物来源的受体拮 抗剂、抗氧化剂、细胞因子诱导剂等研究领域,也都发现了很多具有药物开发 价值的候选化合物。经典的抗生素筛选,是早期规模化微生物药物筛选的典范,被称为是抗生 素产生菌与活性物质的双重筛选,其筛选流程见图4(司书毅,黄明玉,张月琴。 微生物药物筛选研究进展。基础医学与临床。2001,21(4):294)。应用常规的抗生素筛选模型,从微生物次生代谢产物中发现新药的方式已 不能满足人们的需求。随着近20年来生物科学的发展以及相关新技术的应用, 特别是分子生化药理学、病因学、分离培养技术、组合生物合成技术、组合生 物转化技术的日益成熟,从微生物次生代谢产物中发现具有生理活性的物质的 范围,从传统的抗生素拓展到了包括微生物次生代谢产生的信息素、酶抑制剂、 免疫调节剂、受体激动剂和拮抗剂等在内各个领域。基于药物作用机制的筛选 方法和定靶筛选方法如支原体模型、几丁质合成酶抑制剂模型、HIV整合酶抑制剂模型等,也在逐步建立完善中。例如可参见如下文献姚天爵.国外医药抗生素分册.1995,16(1):1; Sokemi S等,J爿""&o , 1995,48(2):134; Aoki M等. 爿"〃6/o" 1993, 46(6):952; Kuschel A等.J/^"6/of, 1994, 47(7):733; Stefandli S等."""力,.o,, 1995, 48(4):332; Thomas M等.2>e"c/5/o&c/wc /, 1997, 15:167; Matsuzaki K等.J^幼/of, 1995, 48(7):703。诚然,自然界中微生物的多样性及其代谢产物的多样性,为新药或其先导 化合物的开发提供了不竭的源泉。但是如何行之有效地从纷繁复杂的微生物代 谢产物中筛选具有药物开发价值的活性物质,将是今后很长一段时间内要面临 的现实问题。动物模型是现代生物医学和药理学研究中的一个极为重要的实验方法和 手段,使用动物模型作为实验假说和临床假说的试验基础,可以严格控制实验 条件,增强实验材料的可比性,避免了在人身上进行实验所带来的风险,克服 了人类某些疾病潜伏期长、病程长和发病率低、发病原因多样、经常伴有其它 因素千扰的缺陷,而且可以在相对较短时间内复制出各类典型的动物模型,增 强实验的可重复性。与传统的微生物药物筛选方式相比,以动物模型作为研究 的起始点,能及时了解待筛选药物在整体水平上的效果和副作用。结合行为学 实验、代谢实验等标准化、数量化的检测手段,从对小鼠综合身体机能有明显 影响的微生物代谢产物的混合物中逐级筛选具有药物开发价值的活性物质,可 以增强对微生物代谢产物可能存在的生理活性作用的预测性。小鼠是建立药物 筛选模型理想的实验动物之一,而利用旷场行为实验观察记录小鼠的行为学表 现的技术也已经十分完善。本领域迫切需要一种利用小鼠模型行之有效地从复杂的微生物代谢产物 中筛选具有药物开发价值的活性物质的方法。发明内容本发明正是提供了一种利用小鼠模型筛选微生物代谢产物,以获得具有药 物开发价值的活性物质的方法。本发明的第一方面涉及一种筛选对神经系统有活性的候选物质的方法,其特征在于,包括步骤(a) 将待筛选的微生物代谢产物给予实验组的模型动物,并观察所述模型动物的行为学表现;(b) 将实验组模型动物的行为学表现与对照组的行为学表现进行比较,其中,实验组动物的行为学表现与对照组动物的行为学表现存在显著差异就表明 所述待筛选的微生物代谢产物是对神经系统有活性的候选物质。在本发明的优选实施方式中,所述待筛选的微生物代谢产物获自下组中的至少一种原核微生物、真核微生物。在本发明的一个优选例中,所述微生物选自细菌、放线菌、和/或真菌。在本发明的一个优选例中,所述微生物代谢产物选自以下活性物质抗生 素、色素、毒素、信息素、酶抑制剂、免疫调节剂、受体激动剂、受体拮抗剂、 肿瘤抑制因子或生长因子。在本发明的另一优选实施方式中,所述的对照组包括施用了安慰剂或阴 性对照药物的阴性对照组、不施用所述待筛选的微生物代谢产物的对照组、或 者在施用所述待筛选的微生物代谢产物之前的实验组。在本发明的另一优选实施方式中,所述方法还包括以下步骤将实验组模 型动物的动物行为学表现与阳性对照组的动物行为学表现进行比较。在本发明的另一优选实施方式中,所述模型动物选自正常动物、或疾病 模型动物。在本发明的另一优选例中,所述的模型动物是帕金森症小鼠或大鼠模型, 而所述的对神经系统有活性的候选物质是对帕金森症有改善或治疗作用的候 选物质。在本发明的另一优选例中,所述的模型动物是老年痴呆症小鼠或大鼠模 型,而所述的对神经系统有活性的候选物质是对老年痴呆症有改善或治疗作用 的候选物质。在本发明的另一优选例中,所述的模型动物是精神分裂症小鼠模型,而所 述的对神经系统有活性的候选物质是对精神分裂症有改善或治疗作用的候选 物质。在本发明的另一优选例中,所述动物是精神分裂症模型小鼠,更优选为用 5-甲基二氢二苯并环庚烯亚氨马来酸诱导的精神分裂症模型小鼠。在本发明的另一优选例中,所述动物是哺乳动物,优选啮齿类动物、灵长 类动物。在本发明的另一优选例中,所述动物是小鼠或大鼠。在本发明的另一优选实施方式中,所述行为学表现选自移动、直立、异 常刻板性动作、共济失调、探索性行为、记忆能力表现和/或社会行为。在本发明的另一优选实施方式中,步骤(b)中筛选得到的对神经系统有活性 的候选物质是单一微生物的代谢产物、或多种微生物的代谢产物所形成的混合物。在本发明的一个优选例中,所述混合物是由2-50种,优选2-25,更优选2-15 种,最优选2-10种微生物的代谢产物形成的。在本发明的另一优选实施方式中,对所述混合物进行进一步的筛选,以确 定所述混合物中对神经系统有活性的微生物代谢产物,并任选地对所述对神经 系统有活性的微生物代谢产物中的各组分进行进一步的筛选,以确定该代谢产 物中对神经系统有活性的组分。在另一优选例中,步骤(b)中筛选得到的对神经系统有活性的候选物质是单 一微生物的代谢产物,而所述方法还包括对该微生物的代谢产物的各组分进 行进一步筛选,从而确定该代谢产物中对神经系统有活性的组分。本发明的第二方面涉及用上述任一方法筛选得到的对神经系统有活性的 候选物质。本发明的第三方面涉及用本发明方法筛选得到的对神经系统有活性的候 选物质在制药中的用途。本发明的另一方面提供了一种药物组合物,其包含(1) 有效量的用本发明的方法筛选得到的对神经系统有活性的候选物质;(2) 药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。


图l所示为正常小鼠服用微生物代谢产物后旷场行为实验移动(Locomotion) 的结果。图1 A和图1B分别显示了首次服用A组和B组菌液上清对小鼠移动的影 响;图1C和图1D则分别显示了持续服用A组和B组菌液上清后对小鼠移动的影 响;图1E显示了持续服用A组和B组菌液上清过程中,小鼠移动的变化趋势。图2所示为正常小鼠服用微生物代谢产物后旷场行为实验直立(rearing)的结果。图2A和图2B分别显示了首次服用A组和B组菌液上清对小鼠直立的影响;图2C所示为0-60分钟小鼠直立的累积;图2D和图2E则分别显示了持续服用A组 和B组菌液上清后对小鼠直立的影响。图3所示为精祌分裂症模型小鼠服用微生物代谢产物后旷场行为实验的结 果。图3A和图3B分别显示了A组和B组菌液上清对精神分裂症模型小鼠移动的 影响;图3C和图3D则分别显示了A组和B组菌液上清对精神分裂症模型小鼠直 立的影响。图4所示为经典抗生素筛选的流程图,是早期规模化微生物药物筛选的典 范,也被称为是抗生素产生菌与活性物质的双重筛选(摘录自司书毅,黄明玉, 张月琴。微生物药物筛选研究进展。基础医学与临床。2001,21(4):294)。
具体实施方式
本发明人经过深入而细致的研究发现,可采取施用微生物代谢产物的方式 建立动物模型,并检测和记录实验动物行为学指标的变化情况,将这些指标作 为衡量微生物代谢产物对实验动物综合身体机能影响的尺度,由此创建应用动 物模型从微生物代谢产物中筛选药物的新方法。在此基础上完成了本发明。具体而言,本发明人以旷场行为检测系统记录实验动物移动(Locomotion) 和直立(Rearing)两个行为学指标的变化情况,以这两个行为学指标作为衡量微 生物代谢产物对实验动物综合身体机能影响的尺度。实验结果指出不同性质 的微生物产生的代谢产物对正常小鼠旷场行为的变化趋势的影响不尽相同。同时,本发明人尝试用该方法结合MK-801诱导的精神分裂症小鼠模型,筛 选抗精神分裂症药物,发现服用不同微生物代谢产物的精神分裂症模型小鼠的 行为学表现也有所差异,这表明不同的微生物代谢产物对小鼠身体状况的影响 能够在行为学指标上反映出来。因此,以微生物代谢产物作为原材料,用动物模型作为检测手段,为更加 迅速、有效地从微生物代谢产物中筛选具有药物开发价值的候选化合物提供一 个新的途径。如本文所用,术语"微生物"包括原核微生物、真核微生物或病毒,例如 细菌、放线菌、真菌等。术语"微生物次生代谢产物"是指在微生物次生代谢 过程中产生的极其微量的、对微生物本身的生命活动没有明显作用,而对其他生物体可能具有不同的生理活性作用的一类小分子化合物。本发明所用术语 "微生物代谢产物"包括微生物次生代谢产物。在本发明中可使用多种微生物的代谢产物的混合物,或使用单一微生物的 代谢产物。可对代谢产物进行纯化、浓缩,然后用于本发明的方法。也可不经 纯化、浓縮等处理,将所得代谢产物直接用于本发明的方法。代谢产物的施用 方法没有特别限制,优选的方法包括(但并不限于)腹腔注射,静脉注射、肌 内注射等。如本文所用,术语"对神经系统有活性的候选物质"是指微生物代谢产物 可包括抗生素、色素、毒素、信息素、酶抑制剂、免疫调节剂、受体激动剂、 受体拮抗剂、肿瘤抑制因子或生长因子等活性物质,其在施用于模型动物后可 引起动物行为与对照动物行为的显著变化。所述对神经系统有活性的候选物质可为多种微生物的代谢产物所形成的 混合物或单一微生物的代谢产物。可用本发明的方法或本领域常用的方法,对 候选物质进行进一步的筛选。例如可对混合物进行进一步筛选以确定所述混合 物中对神经系统有活性的微生物代谢产物,并任选地对所述对神经系统有活性 的微生物代谢产物中的各组分进行进一步的筛选,以确定该代谢产物中对神经 系统有活性的组分。也可对单一微生物的代谢产物中的组分进行进一步的筛选 以确定该代谢产物中对神经系统有活性的组分。如本文所用,术语"对照组"是指阴性参照,具体为施用了安慰剂或阴性 对照药物的阴性对照组、不施用所述待筛选的微生物代谢产物的对照组、或者 在施用所述待筛选的微生物代谢产物之前的实验组。在本发明的一个优选实施 方式中,所述阴性对照是不含所述微生物代谢物的培养基。还可在本发明的方 法中设置阳性对照,并经实验组模型动物的行为与阳性对照组的动物行为进行 比较。在本发明的一个优选实施方式中,给所述阳性对照组施用明确对疾病具 有治疗作用的药物。适用于本发明的模型动物可以是哺乳动物,例如啮齿类动物、灵长类动物 等,较佳的动物是啮齿类动物,更佳的动物是小鼠、大鼠。在本发明的一个优 选实施方式中,所述动物是小鼠。所述模型动物可以是正常动物,也可以是疾病模型动物。在本发明的一个 优选实施方式中,采用了正常小鼠模型。在本发明的另一优选实施方式中,采用了MK-801(地卓西平马来酸盐,它是N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)非竞争性 受体拮抗剂)诱导的精神分裂症模型小鼠,以筛选抗精神分裂症的候选物质。在 本发明的一些优选实施方式中,分别采用了帕金森症小鼠或大鼠模型、老年痴 呆症小鼠或大鼠模型、精神分裂症小鼠或大鼠模型,来筛选对帕金森症、老年 痴呆症或精神分裂症有改善或治疗作用的候选物质。可用于本发明方法中的动物行为包括任何可以反映动物状况的行为。应理 解,对于不同的实验动物,所选用的动物行为可有所不同。例如,代表性的动 物行为可包括(但并不限于)移动、直立、异常刻板性动作、共济失调、探索 性行为、记忆能力表现和社会行为等。还可进一步利用本发明的方法来优化对神经系统有活性的候选物质的施 用条件。在本发明的一个实施方式中在预设的实验参数(例如剂量、剂型、给药 方案和/或联用)下,将筛选得到的对神经系统有活性的候选物质给予模型动物; 根据动物的行为学变化选择施用对神经系统有活性的候选物质的优化参数。本发明还包括了用本发明方法筛选得到的活性微生物代谢产物及其药物 组合物。所述药物组合物中包含有效量的用本发明方法筛选得到的活性微生 物代谢产物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本文所用的术语"有效量"指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的 量,或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取 决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和 /或治疗剂的组合。对于某给定的状况而言,可以用常规实验来确定该有效量, 临床医师是能够判断出来的。术语"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体,其本身不诱导产 生对接受该组合物的个体有害的抗体,且给药后没有过分的毒性。这些载体是 本领域普通技术人员所熟知的,可参见《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Pub. Co. , N.J. 1991年)。本发明的组合物可通过常规途径给药,例如通过口服、静脉内、肌内或皮下 等方式给药。通常,在本发明的药物组合物中,活性微生物代谢产物占组合物 总重量的0.001 99.9%;优选为组合物总重量的1 95%,较优选为5 卯%, 更优选10 80%。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的,只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。 本发明的优点在于(1) 将动物模型引入微生物药物的筛选,以量化的行为学指标作为衡量活性 物质药效的标准,在整体动物水平上建立了筛选微生物药物的方法;(2) 本发明的方法可用于从复杂的微生物的代谢产物(例如多种微生物的代 谢产物的混合物、多种组分的微生物代谢产物)中简便、快速而有效地筛选出对 神经系统有活性的微生物代谢产物类药物;(3) 通过本发明的方法可直接观测到待筛选的微生物代谢产物对动物整体 的影响,例如某些毒副性作用等,从而简化了药物筛选过程。实施例下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件进行。实验材料A. 实验动物远交群ICR小鼠,成年雄性(20 22g), SPF级,购自中国科学院上海实验动 物中心(生产许可证号SCXK(沪)2004-0005)。将实验小鼠(共30只),分成两个 实验组和一个对照组,每组10只。实验过程中小鼠一直被饲养在12/12小时昼夜 交替的动物房中,房间内温度和湿度保持恒定,并提供充足的水和食物。B. 试剂配制地卓西平马来酸盐[简称MK-801](由美国TOCRIS公司生产)溶解于含 0.9。/。NaCl的生理盐水(Saline)中,配成5mg/kg体重的母液低温保存,实验前稀 释至0.6mg/kg。C. 徵生物代谢产物性质将这28种微生物均分为A、 B两组,实验中涉及的微生物的学名详见表l。微生物代谢产物的提取过程如下所有微生物首先单独在试管中培养到稳 定生长期,然后将试管中的菌液分别转移到装有100ml发酵培养基的三角烧瓶 中,培养至稳定生长期。将发酵所得的菌液以8000rpm离心15分钟,分离得到 上清液,分别测量各种微生物上清液的体积,A组菌液和B组菌液的上清各自 按l:l体积比混合后(75mlX14种菌液/组,共A、 B两组),无菌过滤。将A组菌 液和B组菌液的上清以及发酵培养基分别低温冻干,浓縮菌液上清中的次生代 谢产物。表l.实验涉及的微生物的学名 A组徵生物iAmyco/atops/'s me仿ano〃ca >Amyco/atops/'s厂tygosa Amyco/afops/'s o〃'enfa//sA/ocarcf/a cora///V7e A/ocard/'a wn/'form/s/\myco/afops/'s cfasso脂7/e/'Ampu〃ar/'ec/a /ct/nm/勿ens/s 尺/70c/ococci;s sp Acf/'nomyces sp拟无枝酸菌属拟无枝酸菌属东方拟无枝酸菌星形奴卡氏菌珊瑚色奴卡氏菌奴卡氏菌属奴卡氏菌属拟无枝酸菌属成都马杜拉放线菌橘黄色糖多孢菌瓶孢囊菌属红球菌属放线菌属分支杆菌属B组微生物yA/t/ rot)3cte厂Wscosws Gssc/o/f Pset/cfomonas sp.节杆菌属 假单胞菌属 粘质沙雷菌 无色杆菌属Sfreptosporangf/'um a/bt/m Sfreptomyces AV/c/ans MZ, aprJ Sfreptomyces coe//co/or Sfreptove/t/.c/7/"m caesp/tost;s Sfreptomyces //V/cfar s(Z;(7 pro sfr-6 rec-46J Esche〃.c/7/'a co// S^"eptove/t/c/7/wm caesp/'tosm短杆菌属黄质菌属/产黄菌属白色链孢囊菌变铅青链霉菌天蓝色链霉菌头状链轮丝菌变铅青链霉菌大肠杆菌链轮丝菌属啤酒酵母通用方法A. 行为学实验的检拥和记录小鼠的旷场行为由美国San Diego Instruments公司生产的旷场行为红外线 检测系统(Flex Field System)自动记录。将受试小鼠单独置于48cmX24cmX20cm(长X宽X高)顶部开口的长方形 实验盒内,各个实验盒之间由木板分隔成封闭区域。实验盒底部被监控旷场行 为的软件虚拟地划分为8个大小相同的区域,旷场行为红外线检测系统利用小 鼠是否阻断红外线(beam break)来自动检测记录每单位时间内(15秒)小鼠进入 各个区域的次数,并由另一组平行的红外线监测小鼠直立的次数。旷场行为实验每次持续时间为3小时,每次有10只小鼠同时受试,两个实 验组及对照组中的小鼠被随机安排入同一次旷场行为实验,以减少系统误差。B. 正常小鼠的实验过程实验开始前,使小鼠先在动物房饲养一天以适应环境。实验开始后以灌胃 给药的方式让小鼠分别服用A组菌液上清、B组菌液上清或培养基(对照),连续 灌胃10天,每天一次,每次0.2ml。每天灌胃给药后,立刻将小鼠放入仪器,观 测其行为学表现。C. MK-801诱导的精神分裂症模型小鼠模型的实睡过程灌胃10天后,于第ll天时给小鼠注射0.6mg/kg体重的MK-801,建立MK-801诱导的精神分裂症小鼠模型,并在注射后立即测试小鼠的旷场行为。实施例l.微生物代谢产物对正常小鼠移动(Locomotion)行为的影响如通用实验方法所述,使正常小鼠分别服用A组菌液上清和B组菌液上清, 采用旷场行为红外线检测系统记录用药对小鼠移动行为的影响,结果如图l所示。实验结果显示,无论是在第一天给予含微生物代谢产物的菌液上清后还是 在连续10天给予菌液上清的过程中,服用A组菌液上清和B组菌液上清的小鼠都 在旷场行为上表现出了不同的趋势在首次给予菌液上清后,服用A组菌液上 清的小鼠与服用发酵培养基的对照组小鼠相比,在放入仪器的初期移动下降更 为迅速(图1A),而服用B组菌液上清的小鼠在旷场行为实验的整个阶段移动情 况与对照组几乎没有差异(图1B);在持续服用菌液上清的过程中,服用A组菌 液上清的小鼠移动在随后的9天内比对照组略有上升(图1C、图1E),而服用B组 菌液上清的小鼠移动的下降趋势与对照组大致吻合(图1D、图1E)。不同性质微生物产生的代谢产物对正常小鼠移动行为的影响,不仅可以反 映在初次服用微生物代谢产物后的小鼠移动行为变化上,而且也可以在持续给 药过程中的移动行为变化趋势上有所反映。这表明不同的微生物代谢产物对小 鼠身体状况的影响能够在行为学指标上反映出来。换言之,可用不同微生物代 谢产物对小鼠身体状况的影响来反映代谢产物的活性,将小鼠行为学指标用于 微生物代谢产物的筛选。实施例2.徵生物代谢产物对正常小鼠直立(Rearing)行为的影响如通用实验方法所述,使正常小鼠分别服用A组菌液上清和B组菌液上清, 采用旷场行为红外线检测系统记录用药对小鼠直立行为的影响,结果如图2所示。实验结果表明,服用菌液上清的小鼠,在首次给药后直立次数与对照组小 鼠相比,前期均有大幅度的下降(图2A、图2B),且服用A组菌液上清的小鼠直 立下降幅度与对照组相比其差异有统计学意义(图2C, F2. 27 = 4.314, P<0.05, F 是方差分析的检验统计量)。然而在持续服用菌液上清或培养基的过程中,小鼠旷场行为实验的直立次数除了第二天有明显的下降,在随后的9天内直立次数基本恒定(图2D、图2E)。该结果表明不同性质微生物产生的代谢产物对正常小鼠直立行为的影响, 不仅可以反映在初次服用微生物代谢产物后的小鼠直立行为变化上,而且也可 以在持续给药过程中的直立行为变化趋势上有所反映。这表明不同的微生物代 谢产物对小鼠身体状况的影响能够在行为学指标上反映出来。换言之,可用不 同微生物代谢产物对小鼠身体状况的影响来反映代谢产物的活性,将小鼠行为 学指标用于微生物代谢产物的筛选。实施例3.微生物代谢产物对糖神分裂症模型小鼠旷场行为的影响如通用实验方法所述,使正常小鼠分别服用A组菌液上清和B组菌液上清, 持续灌胃结束后,在第ll天给小鼠注射0.6mg/kg体重的MK-801,以测试微生物 代谢产物对MK-801诱导的精神分裂症模型小鼠的旷场行为的影响。结果显示,服用两组菌液上清的小鼠在旷场行为实验后期与对照组相比都 有降低MK-801诱导的快速移动(Hypelocomotion)的趋势(图3A、图3B)。同时在 直立行为上,两组菌的代谢产物均能增加MK-801诱导的精神分裂症模型小鼠的 直立(图3C、图3D),而且A组菌液上清的效果更加明显。该结果表明,服用不同微生物代谢产物的精神分裂症模型小鼠行为学表现 有所差异,其原因可能是微生物代谢产物中存在能影响精神分裂症相关通路的活性物质,进而为从微生物代谢产物中筛选出抗精神分裂症药物提供了平台。 讨论微生物的种类繁多,而且在不同的生长条件下,胞内产生的或分泌到胞外 的、影响自身或其它生物生命活动的物质极为丰富,是人们获取天然化合物的 不竭资源。相对于药用植物而言,微生物的优势在于可以在实验室培养,生长 条件完全可控;而药用植物的有效成分多为植物的次生代谢产物,含量甚微, 且具有不均一性, 一般从0.01%到1%不等。同时,微生物具有可以通过定向突 变来调节某一项代谢通路的能力,即一旦要提取某种代谢产物进行有目的的研究时,可人为调节相应的代谢通路使待研究的代谢产物的产率提高,便于分离 纯化,而这正是将中草药有效成分进行分离、进入现代化生产的一大障碍。如何行之有效地从纷繁复杂的微生物代谢产物中筛选具有药物开发价值 的活性物质,很大程度上取决于进行筛选检测的模型。本实验的创新之处就是 将动物模型引入微生物药物的筛选,以量化的行为学指标作为衡量活性物质药 效的标准,在整体动物水平上建立筛选微生物药物的方法。移动和直立行为是衡量哺乳动物身体状况的两个广泛、全面的指标。动物 身体状况的变化会反映到综合指标上,如肌肉力量、运动的意愿、肌肉的耐疲 劳能力、对外界新鲜事物的敏感程度等,而这些综合指标能在移动和直立上反 映出来。因此用标准化、数量化的方式检测动物行为可以作为衡量综合身体机 能的技术平台。正如实验结果所指出的那样,不同性质的微生物产生的代谢产物对正常小 鼠旷场行为的影响不仅可以反映在初次服用微生物代谢产物后的小鼠行为学 指标的变化上,而且也可以在持续给药过程中的行为学指标的变化趋势上有所 反映。这表明不同的微生物代谢产物对小鼠身体状况的影响完全能够在行为学 指标上反映出来。与此同时,本发明人在实施例3中使用了MK-801诱导的精神分裂症小鼠模型,进一步筛选具有抗精神分裂症活性的微生物代谢产物药物。精神分裂症的 病因未明,具有感知、思维、情感、行为等多方面的障碍和精神活动的不协调以及精神活动与环境不协调的症状,多起病于青壮年, 一般无意识障碍及智能 障碍,病程多迁延。精神分裂症作为影响脑神经高级思维功能的病变,是对人 的思维及工作能力最具威胁力的一种疾病,且患病率在各种精神疾病中居首 位,己成为一个严重的社会问题,然而迄今为止尚缺乏理想的抗精神分裂症的 药物。本发明人发现,服用不同微生物代谢产物的精神分裂症模型小鼠其行为 学表现也有所差异,这表明微生物代谢产物中可能存在能影响精神分裂症相关 通路的活性物质。如可将本发明的方法应用于其它人类疾病动物模型上,并结合相应的行为 学实验、代谢实验等多种检测手段,从对实验动物综合身体机能有明显影响的微生物代谢产物的混合物中逐级筛选具有药物开发价值的活性物质,也可以增 强对微生物代谢产物可能存在的生理活性作用的预测。从微生物代谢产物中筛选药物具有广阔的前景,而新药筛选模型的匮乏已 逐渐成为制约微生物药物开发进展的关键因素之一。以微生物代谢产物作为原 材料,用动物模型作为检测手段,为更加迅速、有效地从微生物代谢产物中筛 选具有药物开发价值的候选化合物提供了一条新路。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后, 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1. 一种筛选对神经系统有活性的候选物质的方法,其特征在于,包括步骤(a)将待筛选的微生物代谢产物给予实验组的模型动物,并观察所述模型动物的行为学表现;(b)将实验组模型动物的行为学表现与对照组的行为学表现进行比较,其中,实验组动物的行为学表现与对照组动物的行为学表现存在显著差异就表明所述待筛选的微生物代谢产物是对神经系统有活性的候选物质。
2. 如权利要求l所述的方法,其特征在于,所述待筛选的微生物代谢产物 获自下组中的至少一种原核微生物、真核微生物。
3. 如权利要求l所述的方法,其特征在于,所述的对照组包括施用了安 慰剂或阴性对照药物的阴性对照组、不施用所述待筛选的微生物代谢产物的对 照组、或者在施用所述待筛选的微生物代谢产物之前的实验组。
4. 如权利要求l所述的方法,其特征在于,所述方法还包括以下步骤将 实验组模型动物的动物行为学表现与阳性对照组的动物行为学表现进行比较。
5. 如权利要求l所述的方法,其特征在于,所述模型动物选自正常动物、 或疾病模型动物。
6. 如权利要求l所述的方法,其特征在于,所述行为学表现选自移动、 直立、异常刻板性动作、共济失调、探索性行为、记忆能力表现和/或社会行 为。
7. 如权利要求l所述的方法,其特征在于,步骤(b)中筛选得到的对神经系 统有活性的候选物质是单一微生物的代谢产物、或多种微生物的代谢产物所 形成的混合物。
8. 如权利要求7所述的方法,其特征在于,对所述混合物进行进一步的筛 选,以确定所述混合物中对神经系统有活性的微生物代谢产物,并任选地对所 述对神经系统有活性的微生物代谢产物中的各组分进行进一步的筛选,以确定 该代谢产物中对神经系统有活性的组分。
9. 用权利要求l-8中任一所述的方法筛选得到的对神经系统有活性的候选物质。
10. 权利要求9所述的对神经系统有活性的候选物质在制药中的用途。
全文摘要
本发明提供了一种利用动物模型从微生物代谢产物中筛选药物的方法,该方法包括步骤将待筛选的微生物代谢产物给予实验组的模型动物,并观察所述模型动物的行为;将实验组模型动物的行为学表现与对照组的行为学表现进行比较,其中,实验组动物的行为学表现与对照组动物的行为学表现存在显著差异就表明所述待筛选的微生物代谢产物是对神经系统有活性的候选物质。本发明还提供了用该方法筛选得到的活性微生物代谢产物及其用途。
文档编号C12Q1/18GK101244279SQ20071003745
公开日2008年8月20日 申请日期2007年2月13日 优先权日2007年2月13日
发明者张曼芳, 张臣颢, 成志恒, 谢青莲, 赵国屏, 洪 邹, 金玫蕾, 马志方 申请人:上海中科伍佰豪生物工程有限公司
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