专利名称：一种胰岛细胞体外增殖方法
技术领域：
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种胰岛细胞的体外培养和增殖方法。
背景技术：
糖尿病是一种由胰岛素分泌相对和绝对不足导致的慢性代谢疾病，尤其是血糖水平的异常，晚期可导致肾脏、眼底、周围神经系统和血管等组织器官的病变，并伴有失明、肾衰等严重症状的罹患风险。据估计目前全球有超过1.5亿人患有糖尿病，而预计在2025年糖尿病患者将达到3亿。
目前糖尿病主要可分为两种类型一型糖尿病和二型糖尿病。前者主要是由胰岛素的绝对不足引起的，而胰岛素绝对量的不足则是由于人体中唯一可以分泌胰岛素的细胞——胰岛β细胞的严重不足。目前研究表明，胰岛β细胞的缺失主的主要原因是T细胞对β细胞的自体免疫攻击。二型糖尿病则的主要病因则是胰岛素的靶器官(肝脏、肌肉等)对胰岛不敏感，而更深层的病因较一型糖尿病更为复杂。二型糖尿病在初期只表现为胰岛素的相对缺乏，并伴随有应激性的胰岛增殖和高胰岛素表现，而在晚期由于长期高血糖导致的胰岛β细胞的大量凋亡，胰岛素水平也大量下降。针对以上情况，胰腺或胰岛移植不仅对于一型，也是二型糖尿病目前最理想的治疗方案之一。
胰腺器官移植较胰岛移植开展得早，相对而言能提供更长时间的正常胰岛素供给，但是胰腺器官移植手术难度高，风险大，作为糖尿病的治疗手段并不十分理想。
胰岛移植世界第一例临床胰岛移植于1974年开展，受体为一位肾移植术后的糖尿病患者。全胰切除后行自体胰岛移植是上世纪70年代开展的。上世纪90年代以前胰岛移植的疗效一直不太满意，只有大约10％的胰岛移植受体脱离了胰岛素的使用。2000年7月加拿大Edmonton中心报告一套被称为“Edmonton方案”的胰岛移植方法，对连续7例有严重低血糖史及代谢不稳定史的II型糖尿病患者进行胰岛移植，采用无类固醇激素的免疫抑制治疗方案，移植后7名患者均实现了胰岛素自给，为成人胰岛移植的临床应用带来广阔前景。其后全世界有很多移植中心也采用“Edmonton方案”进行成人胰岛移植并取得了类似的结果，移植技术日趋成熟。临床上胰岛移植的病例越来越多，1974年至今世界上已报道的临床胰岛移植近1000例。和胰腺移植相比胰岛移植具有移植程序简单、手术安全性高的优势，而且即使移植失败也不至于对受体造成严重伤害。
但胰岛移植也面临很多问题，其中供体缺乏是限制胰岛移植普及的重要因素之一，通常情况下需要有两到三个供体胰腺所分离的胰岛方可满足一位等待移植的糖尿病病人的需要。
为解决上述问题，一些研究者尝试在体外或体内将其他类型的成体细胞或胚胎干细胞诱导分化为分泌胰岛素的类β细胞，从而起到替代β细胞完成胰岛移植的作用。主要涉及的细胞包括胚胎干细胞、骨髓细胞和肝细胞等。上述转分化过程中，体外分化经常需要相当复杂的诱导过程，并不十分适合细胞的大量扩增，同时大多数实验虽然可在体外获得比较好的效果，但诱导分化的细胞移植到体内往往不能很好的维持血糖的正常水平。体内分化实验主要集中在肝细胞向β细胞的分化，往往采用病毒转基因的手段，在临床的应用方面由于涉及安全性问题，目前还不易推广。
另一方面，虽然大量研究证明在成体中存在有胰岛细胞的新生，但是新生胰岛细胞的来源一直存在争论。早期的研究认为有胰岛干细胞的存在，可能定位于胰岛内部，胰腺外分泌组织，尤其是分布于胰导管周围得到了比较多的实验结果的支持。有研究者从胰导管周围分离得到导管细胞成功的诱导培养分泌胰岛素的类胰岛素细胞，移植后可有效控制糖尿病模型动物受体的血糖水平。然而最新的研究表明，成年个体新生的β细胞可能来源于已有的β细胞的增殖，而不是来源于可能存在的干细胞。因此，如何使β细胞能够于体外扩增，并保持或在需要的时候重新获得β细胞的特性，便成今年糖尿病细胞治疗研究的热点之一。目前以有几家实验室成功使β细胞体外增殖，并在一定时期诱导增殖细胞重获体内β细胞相应的生物学功能。但上述实验一般都涉及一个无血清培养的过程，大部分需要比较复杂的处理保证其增殖获诱导其分化，因此β细胞体外增殖的效率就受到了一定的影响。同时，据我们所知，迄今并无报道体外增殖的胰岛细胞移植回糖尿病模型动物后可有效的恢复血糖正常水平，治疗糖尿病。
在胰岛细胞的体外增殖的尝试中，有些课题组采用向β细胞中转入病毒原癌基因维持β细胞的永生化，移植后也可起到治疗糖尿病的效果，但方案面临很大的安全问题。
因此，本领域需要一个更加简单、安全、有效、适于临床推广的可用移植治疗糖尿病的胰岛细胞体外增殖方法。
发明内容
本发明的目的在于提出一种简单、安全、有效的胰岛细胞体外增殖方法，使该胰岛细胞能用于降低血糖水平的细胞移植，且可长时间维持血糖正常水平。
采用常规方法获得来源于胰腺的富含胰岛的混合细胞群，用添加15％胎牛血清的RDM1640培养基重悬，平铺于培养皿中，置35-39℃，含有5％二氧化碳的培养箱中培养；待细胞完全贴壁，以1∶2比例传代于培养皿中，加入bFGF，使bFGF的终浓度为1.5-2.5ng/ml，按常规细胞培养方法培养；待细胞覆盖达90％以上时，以1∶3传代入培养皿；在培养基中保持bFGF的上述浓度，继续培养7-10天，即细胞分离后的第10-15天后，可获得流量约2-4×107的细胞，此时的细胞即可用于移植。
本发明提供了一种可以在体外增殖并部分保留胰岛内分泌功能的细胞制备方案。来源于富含胰岛的胰腺组织成分在bFGF的刺激下表现为旺盛的增殖以及均一的类似成纤维细胞的形态特征，依此方案制备的细胞可应用于以降低血糖水平和治疗糖尿病为目的的细胞移植，并达到长时间维持血糖正常水平，以及改善糖尿病其他症状的效果。
与目前临床所应用的胰岛移植方案比较，本发明所涉及方法制备的细胞用作移植用途的优点主要表现为所需原始供体数量的减少，和植入物免疫原性的降低。具体来讲，目前所普遍采用的胰岛移植手术方案通常需要二到三个供体的胰岛组织才能达到维持一名接受胰岛移植的糖尿病患者正常血糖水平的目的；而通过本发明所述方法的培养，来源一个供体的胰岛组织至少可以供给六名受试者接受移植，并达到维持正常血糖水平的效果。另一方面，目前所普遍采用的胰岛移植通常需要长时间服用免疫抑制剂，以保护移植物不受免疫系统的攻击，根据此前的实验结果，新鲜胰岛移植给模型动物后，在不加免疫抑制剂的条件下，正常血糖水平通常只能维持十天左右；而在接受依照本发明方法制备的细胞移植的糖尿病模型动物中，同样不加免疫抑制剂，普遍观察到超过三个月的正常血糖水平的维持，说明经此方法制备的细胞具有极低的免疫原性。
本发明所涉及的bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)是一种促细胞生长作用很强的多肽细胞生长因子，是一种广谱的有丝分裂原，对广泛的来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促增殖作用和促细胞迁移作用。bFGF的生物学效应非常广泛，主要有促进血管新生，改善细胞生活微环境，促进受损神经再生及血管、肌肉、皮肤修复的功能。bFGF的临床应用也很广泛，可以用于治疗烧烫伤、脑中风、神经性耳聋、外周神经损伤、老年性痴呆、弱精少精症等病症。bFGF用于治疗神经性耳聋、白癜风等适应症的开发也已基本完成了临床前试验。因此bFGF在此处的应用相比较于病毒转基因等其他方法，具有很高的安全性，适合临床推广。
本发明采用目前常规的胰岛分离和纯化方法分离得到纯度约为50～80％的大鼠胰岛细胞，该胰岛细胞包含胰导管细胞、胰腺外分泌细胞和胰岛内分泌细胞等多种细胞在内的混合细胞群体，因此增殖得到的细胞来源于，但不局限于，胰导管细胞、胰腺外分泌细胞和胰岛内分泌细胞中的一种或几种细胞。而胰岛内分泌细胞中又存在α、β、γ、ε和pp细胞，这些细胞都是增殖得到的细胞的来源。
本发明采用重组碱性成纤维细胞生长因子处理体外培养的胰岛细胞，使其大量增殖，传代可达20代以上，增殖时间超过两个月，并在一定的时间内保留胰岛内分泌的特征。
上述操作中，胰岛的分离和纯化均为目前临床采用的标准胰岛分离纯化步骤，具有相关经验的医生可熟练完成。细胞培养除添加bFGF细胞因子刺激外，均为普通细胞培养操作，经过细胞培养相关训练的人员均可独立操作。移植方案亦属于外科手术中比较简单的操作，具有相关资质的外科医生即可顺利完成。
图1，胰岛分离纯化、体外培养、肝门静脉移植的流程说明图。
图2，胰岛分离后体外培养的照片(A、新鲜分离胰岛，双硫腙染胰岛为猩红色；B、细胞生长曲线，C、分离后14天有bFGF刺激；D、分离后14天无bFGF刺激)。
图3，体外培养10、20、40天的bFGF刺激增殖胰岛、未处理胰岛，以及新鲜分离胰岛的基因表达情况。
图4，接受安慰手术、接受未经bFGF处理的胰岛移植、和接受bFGF处理的胰岛移植的三组糖尿病大鼠术后血糖及体重水平变化。
图5，术后20天腹腔注射糖耐量实验结果。
图6，术后10天和40天血清胰岛素含量。
图7，手术后模型大鼠肝脏内的胰岛素表达，以及植入细胞对胰岛再生的促进作用(A、接受IPPC移植大鼠术后第五天肝脏；B、接受IPPC移植大鼠术后第三十天肝脏；C、未治疗糖尿病大鼠肝脏；D、正常大鼠胰岛；E、接受IPPC移植后130天大鼠胰岛；F、未治疗糖尿病大鼠胰岛)。
具体实施例方式
胰岛的分离和纯化采用改良的Lacy及Kostianovsky方法，乙醚持续吸入麻醉，70％酒精常规消毒手术野，作腹部正中切口及双侧肋缘下切口，显露肝门部。找出胆总管下端，近十二指肠结扎胆总管，近肝脏胆总管上段，于胆总管下端结扎线的肝脏侧采用22G套管针原位插管，丝线结扎并固定套管针后放血处死大鼠。经胆总管注入1mg/ml胶原酶溶液10ml(含7.5mmol/l Ca++，10mmol/l HEPES，pH7.8)，快速分离已膨胀的胰腺，移入消化瓶中，37℃水浴静止消化约30min，取出振摇，使呈细沙状，600μm不锈钢丝网过筛，加入冰冷的Hanks液(含5％胎牛血清)约40mL，终止消化，1500r/min 4℃离心2分钟，弃上清，同法洗2次，沉淀加25％Ficoll 4mL重悬，依次加入23％、20％、11％Ficoll溶液和Hanks液各2mL，3000r/min 4℃离心20min，吸出23％～20％，20％~11％界面的胰岛，Hanks液洗3次，备用。
胰岛细胞体外培养新鲜胰岛用15％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，平铺于直径6cm的培养皿中，置于37℃，提供5％二氧化碳的培养箱中培养。待细胞完全贴壁，以1∶2比例传代于两个6cm培养皿中，向其中一份加入bFGF，终浓度为2ng/ml。两组细胞均按普通细胞培养方法培养，待细胞覆盖达90％以上时即可以1∶3传代入直径10cm培养皿。其中未加bFGF组，在两周左右可传至1～2只10cm培养皿，此后即停止增殖，在本方案中作为对照移植物，加bFGF组此后培养基中一直保持2ng/ml的bFGF浓度，细胞分离后10-15天左右可扩增至1-2×107细胞总量，可进行移植或继续培养。
肝门静脉移植乙醚麻醉糖尿病大鼠，沿腹白线纵剖大鼠腹腔，暴露肝门静脉。消化胰岛细胞，重悬于磷酸缓冲液中，以5×106细胞每只大鼠的剂量，将培养两个星期的胰岛细胞缓慢注射入肝门静脉。注射完成后抽出针头，压迫止血。缝合大鼠腹腔。待大鼠苏醒后移至鼠笼正常饲养。
免疫组织化学取对应实验大鼠肝脏或胰脏切割修剪成约0.5×0.5×1.5cm大小组织块，组织块按下列步骤石蜡包埋，行苏木素伊红(HE)染色以及免疫组织化学方法检测胰岛素原表达情况。
包埋步骤10％福尔马林固定24h50％酒精，2~3h70％酒精，2~3h80％酒精，2~3h95％酒精，2~3h(中间换一次)100％酒精，1hr 15min(中间换一次)1/2酒精、二甲苯，20min二甲苯，5~10min苯蜡，20min蜡1、蜡2、蜡3，各20min石蜡包埋。
蜡块4℃保存留作形态学、免疫组织化学等检测。
免疫组化主要步骤石蜡切片经脱蜡还原后蒸馏水浸泡约3min。
切片加入0.3％H2O2-甲醇溶液，37℃，30min，以消除组织内源性过氧化物酶活性。
切片经水洗后加入预热的0.1％胰蛋白酶消化液，37℃，30分钟。
PBS洗3次，滴加10％正常小牛血清，于湿盒内，37℃，30分钟。
滴加1∶100兔抗大鼠胰岛素单克隆抗体，室温，1.5h。
PBS洗3次后，滴加1∶100生物素化抗兔-HRP或抗小鼠-HRP，室温，2h。
PBS洗3次后，滴加DAB显色液，显色时间为5-10分钟，显微镜下检查显色程度。
切片水洗后，加入苏木素液复染细胞核切片烘干后封固，镜下观察。
胰岛素放射性免疫检测依照制造商推荐步骤，使用125I人血清胰岛素放射免疫分析药盒检测胰岛素的含量。
实施例1，bFGF刺激体外培养胰岛细胞的增殖该实验设计为检测体外培养的胰岛细胞是否能在bFGF的刺激实现大量增殖。
如附图2所示，未处理的对照细胞在普通的体外培养条件下增殖速率逐渐降低，并最终在分离后两个星期左右停止生长。与之相比，经bFGF的胰岛细胞可以在至少一个月的时间内维持平均48小时左右一代的增殖速度，并持续增殖超过两个月的时间。另外，经bFGF刺激的胰岛细胞在增殖的同时表现为逐渐的形态均质化，即表现为均一的类成纤维细胞状态。
这一结果表明bFGF可刺激体外培养的胰岛细胞大量增殖，提供了可用于胰岛移植的潜在的细胞来源。
实施例2增殖胰岛细胞的基因表达情况本实验设计为检测在bFGF刺激下增殖的胰岛细胞，在增殖过程中相关基因的表达情况。
本实验所检测的基因包括胰岛内分泌激素胰岛素、胰高血糖素和糖皮质激素；胰腺外分泌酶类淀粉酶；胰岛祖细胞标志性分子Nestin；以及胰岛细胞分离的标志分子C-myc。
本实验所检测的时间点包括新鲜分离的胰岛，以及体外培养的第10、20和40天。
如附图3所示，外分泌酶类的表达在体外培养过程中很快的消失，而内分泌激素表达水平也以不同的速率逐渐减弱，其中胰岛素表达在培养第20天仍可检测到比较高的表达水平。
同时体外培养初期可以检测到Nestin表达的提高，而高水平的C-myc表达则在可见于整个培养过程。
这一实验结果提示受bFGF刺激而增殖的胰岛细胞在相当的时间内保留了部分内分泌细胞的功能，进一步提示其应用于胰岛移植的可行性。同时胰岛前体细胞的标志分子的表达和分裂抗原表达水平的升高则支持本方案所获得细胞具有持续分裂的能力。
实施例3植入增殖胰岛细胞可降低糖尿病模型动物的血糖至正常水平本实验设计为确定bFGF处理的体外培养胰岛细胞，是否可通过移植给糖尿病模型大鼠达到治疗糖尿病的目的。
移植细胞来源为体外培养15天的，经bFGF刺激而增殖的胰岛细胞(n＝10)；并以体外培养15天未经处理的体外培养胰岛细胞移植(n＝7)和磷酸缓冲液安慰手术(n＝10)为对照。
接受移植的模型动物为链脲霉素诱导的糖尿病大鼠模型，接受移植前一天血糖在300到600mg/dl之间。
移植途径选择肝门静脉移植。
接受移植的糖尿病模型大鼠的血糖和体重水平在手术后一个星期内每两天，一个星期到一个一月每三天，一个月后每星期检测。血糖水平在200mg/dl一下认为是正常水平。
本实验结果表明(附图4)，10只接受增殖胰岛细胞移植的大鼠中有7只在五天内血糖恢复至正常水平，并在所观察的时间范围(三个月)内表现为体重的逐渐增加；接受未处理胰岛细胞移植的大鼠无一只恢复至正常水平，但相对安慰手术组，7只中有4只表现为较低的血糖水平(400～500mg/dl)，同时在所观察的时间范围内，体重水平以显著低于增殖细胞移植组的速率缓慢增长；在安慰实验组中，模型动物均表现为血糖水平的逐渐升高以及体重的逐渐降低，并在三个月内相继死于高血糖。
移植实验的结果说明通过本发明所涉及方案获得的胰岛细胞可以通过肝门静脉移植的方法有效治愈链脲霉素所诱导的糖尿病。至我们所选取的细胞培养阶段，相对最初所分离胰岛组分，细胞已增殖20倍左右；而根据我们所选取的移植剂量，每只供体所获得的细胞可实现对六只受体的移植。
另外与新鲜胰岛移植实验对比，在不添加任何免疫抑制剂的情况下，接受移植的模型动物可以维持超过三个月的正常水平，说明根据此方案获得的增殖胰岛细胞在移植后具有极低的免疫原性。
实施例4增殖胰岛细胞移植对糖尿病模型大鼠腹腔注射葡萄糖耐受实验(IPGTT)的影响本实验设计为确定增殖胰岛细胞移植是否可改善糖尿病模型动物对葡萄糖注射的耐受水平。
本实验所检测动物为接受增殖胰岛细胞移植(n＝5)、未处理胰岛细胞移植(n＝3)和安慰手术(n＝3)后20天的模型大鼠，以及相近月龄的正常大鼠(n＝3)。
葡萄糖以2g/kg体重的剂量腹腔注射，葡萄糖注射前所有受试动物经16小时的饥饿处理。
血糖水平分别在葡萄糖注射前，以及注射后30、60、90、120和180分钟检测。
葡萄糖注射前增殖胰岛细胞移植组与正常大鼠无显著差别，而未处理胰岛移植组则与安慰手术组类似。葡萄糖注射后所有的组分中，血糖水平均在30到60分钟达到峰值，正常大鼠血糖水平在120分钟回复至基底水平，而增殖胰岛细胞移植的大鼠在180分钟回复至基底值，相对正常大鼠略显延迟，但相对接受未处理胰岛细胞移植和安慰手术的大鼠则有明显的改善。
实施例5接受增殖胰岛细胞移植的模型动物表现为血清胰岛素的增加本实验室设计为检测细胞移植的模型动物血清中的胰岛素含量。
大鼠血清分别取自手术后10天和40天接受增殖胰岛细胞、长期培养胰岛细胞或安慰手术的大鼠，以及正常大鼠。胰岛素含量通过放射性免疫法测定。
如附图6，接受增殖胰岛细胞移植的糖尿病大鼠在10d和40均表现为显著高于同期接受长期培养胰岛细胞移植和安慰手术的对照组，而接受增殖胰岛细胞移植的糖尿病大鼠在10d与正常大鼠无显著性差异。
实施例6植入增殖胰岛细胞在模型动物体内的胰岛素表达情况本实验设计未检测植入细胞是否可在动物肝脏内表达胰岛素。
动物肝脏组织切片分别取自手术后5天和30天的，接受增殖胰岛细胞移植或安慰手术的大鼠。
胰岛素阳性细胞通过免疫组织化学的方法检测。
如附图7，胰岛素阳性细胞普遍存在于接受增殖胰岛细胞移植的动物肝脏内，并主要集中于血管周围；然而在移植后30天的动物肝脏内，则几乎检测不到胰岛素阳性细胞。另外在安慰实验组中，无论是手术后5天还是30天，均无胰岛素阳性细胞检测到。
本实验说明植入的增殖胰岛细胞最初大量存在于肝脏内并表达胰岛素，但由于免疫攻击或受细胞分裂代数限制等其他原因，肝脏中外源的胰岛素阳性细胞逐渐减少甚至消失。
实施例7增殖胰岛细胞移植对模型动物胰岛再生的影响本实验设计为探索增殖胰岛细胞植入是否可促进受试动物胰岛的再生。
动物胰腺组织切片取自接受增殖胰岛细胞移植或安慰手术后120天的大鼠，以及相近月龄的正常大鼠。
上述三组中，每组共检测20片胰腺切片，切片厚度为5μm，每两片之间至少间隔20片连续切片。
如附图8，接受增殖细胞移植的大鼠胰岛，无论是数目还是大小均与正常大鼠无明显差别，而同期接受安慰手术的糖尿病大鼠胰岛则在很大程度上遭受到破坏。
这一结果说明，植入的增殖胰岛细胞具有促进胰岛再生的功能，并且可能是长期维持正常血糖水平的主要因素。
权利要求
1.一种胰岛细胞体外增殖方法，其特征在于具体步骤如下采用常规方法获得来源于胰腺的富含胰岛的混合细胞群，用添加15％胎牛血清的RDM1640培养基重悬，平铺于培养皿中，置35-39℃，含有5％二氧化碳的培养箱中培养；待细胞完全贴壁，以1∶2比例传代于培养皿中，加入bFGF，使bFGF的终浓度为1.5-2.5ng/ml，按常规细胞培养方法培养；待细胞覆盖达90％以上时，以1∶3传代入培养皿；在培养基中保bFGF的上述浓度，12-16天后传代至2-4×107的细胞总量，即可进行移植或继续培养。
2.一种如权利要求1所述方法获得的胰岛细胞。
3.一种如权利要求2所述的胰岛细胞作为降低血糖水平药物制剂的应用。
全文摘要
本发明属于细胞培养技术领域，具体为一种胰岛细胞体外增殖方法。本发明采用重组碱性成纤维细胞生长因子处理体外培养的胰岛细胞，使其大量增殖，传代可达20代以上，增殖时间超过两个月，并在一定的时间内保留胰岛内分泌的特征。经碱性成纤维细胞生长因子刺激的胰岛细胞经肝门静脉移植给链脲霉素诱导的糖尿病大鼠肝中，糖尿病症状在一周内完全恢复。在未经任何免疫抑止剂处理的情况下，接受移植的糖尿病大鼠在超过两个月的时间内血糖维持正常水平，体重逐渐上升，同时移植后二十天糖耐量实验证明移植大鼠对葡萄糖的响应得到明显的改善。依本发明所述方案增殖的胰岛细胞在植入糖尿病模型动物后，一方面在肝脏内表达胰岛素，另一方面具有明显促进胰岛再生的功能，并上述两方面达到治疗糖尿病的目的。
文档编号C12N5/071GK101054571SQ20071003863
公开日2007年10月17日 申请日期2007年3月29日 优先权日2007年3月29日
发明者李戈, 卢大儒 申请人:复旦大学