一种纯化的高比活的重组巴曲酶的制作方法

文档序号:434047
专利名称:一种纯化的高比活的重组巴曲酶的制作方法
技术领域
本发明涉及遗传工程领域,尤其涉及纯化的高比活的重组巴曲酶及其应用。

背景技术
早在1936年奥地利学者Van Klobusitzky等就从巴西矛头蛇(Bothrops atrox)的毒液中纯化精制出一种酶性止血剂Batroxobin,在国内最早的中译名称之为“巴曲酶”。巴曲酶属于丝氨酸蛋白酶类分子,其分子的生理功能及分子的大小均有类似凝血酶(Thrombin)之处,故稍后也有称之为“血凝酶”。但随着对它的深入研究,国内外对巴曲酶在不同的时期赋予了不同的含义。巴西矛头蛇(Bothrops atrox)有5个亚种,从有的亚种提取的巴曲酶具有止血功效[1],而从另一些亚种中提取的巴曲酶却具有去除纤维蛋白原的作用,蛇种的差别,导致了习惯上笼称的“巴曲酶”的蛋白质,事实上在其生物化学本质上是完全不同的有的是止血功效为主,有的则是降纤作用为主,至于这种化学本质上的不同是源于氨基酸序列上的差别或是由于糖基等蛋白质修饰上的差别还有待进一步研究考察。
目前只有从蛇毒中提取制备的巴曲酶用于治疗多种临床适应症(如,心肌梗死、老年痴呆、中风、突发性耳聋等等)的专利(US Pat.No5595974,5869044,6106830,6399576,6416717;Eur.Pat.No0984279,0826374,0750912,0719791)和研究报告,还没有重组巴曲酶用于动物试验和临床研究工作的任何相关研究报导。从蛇毒中生物提取的巴曲酶主要来自巴西矛头蛇(Bothropsmoojeni,Bothrops atrox)的毒液中,含量很低,其原料的获得以及天然巴曲酶纯品的获得难度大,往往还会在终产品中残留少量蛇的毒素以及许多不明杂质,给临床使用带来潜在的风险。高度纯化后的天然巴曲酶的理论分子量应该也是25.6kDa,但实际上该蛋白在毒蛇的毒腺细胞中分泌表达是发生了糖基化修饰,实际分子量37-43kDa,这种分子量有一范围的原因或是糖基化修饰程度上有差别,也有纯化手段不同而导致的糖链丢失等原因所引起。从蛇毒中提取制备的天然巴曲酶,由于蛇毒原料的来源受养蛇的规模、四季节变化等因素影响,其质量控制是很困难,产品的比活性也很不稳定。
对巴曲酶这种来自蛇毒的蛋白质分子生物学研究一直进展缓慢,直到1987、1988年才由日本的研究者完成对巴曲酶基因的cDNA和基因组DNA测序工作。1991年日本藤泽制药公司(Fujisawa Pharmaceutical)的研究者采用基因重组方法,在E.coli中,采用融合表达系统,以包涵体(InclusionBody)的形式表达出该成分,再通过制备电泳和凝血酶切割开融合蛋白的方法得到所谓有生物学活性巴曲酶,而且还为此申请了专利(Pat.No.JP2124092,1990)。采用基因工程的手段生产富含二硫键的蛋白一直都是一个技术难题,尤其是生产有多对二硫键的丝氨酸蛋白水解酶类分子。这是因为二硫键配对错误率很高,在原核中得到的几乎全是包涵体,虽然日本藤泽制药公司报道了通过对包涵体的变性-复性能得到有活性的目的蛋白,但是其比活低,重现性差,直到现在也未见该公司有重组巴曲酶产品问世。
因此,本领域迫切需要一种不受季节限制,生产规模容易控制的重组的巴曲酶产品,它具有极高的二硫键配对正确率,而且活性高。


发明内容
本发明的第一目的是提供一种基因重组的巴曲酶。
本发明的第二个目的是提供所述基因重组的巴曲酶的用途。
本发明的第三个目的是提供含有所述基因重组的巴曲酶的药物组合物。
在本发明的第一方面,提供了一种纯化的重组巴曲酶,所述的巴曲酶具有以下特性 (a)分子量为29-32kDa; (b)所述重组巴曲酶中至少90%(≥90%)巴曲酶具有正确的6对二硫键配对Cys7-Cys139,Cys26-Cys42,Cys74-Cys230,Cys118-Cys184,Cys150-Cys163和Cys1174-Cys199; (c)在SEQ IDNO1中第146位和第225位被N-型糖基化修饰;和 (d)所述巴曲酶的比活性大于等于1500KU/mg蛋白。
在另一优选例中,所述重组巴曲酶中至少95%具有正确的6对二硫键配对。
在另一优选例中,所述巴曲酶中的糖基化是在以下位点Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr228中的Asn氨基酸残基中发生N-糖基化修饰。
在另一优选例中,其N-型糖基化修饰可使巴曲酶蛋白的分子量在25.6kDa的基础上增加4000-6000kDa。
在另一优选例中,所述巴曲酶的比活性1500-3000KU/mg。
在另一优选例中,所述巴曲酶中至少99%具有正确的6对二硫键配对。
在本发明的第二方面,提供了上述纯化的重组的巴曲酶在制备止血药物中的应用。
在本发明的第三方面,提供了一种药物组合物,它含有上述的重组巴曲酶和药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述的组合物还含有水解明胶作为稳定剂。
在另一优选例中,所述的组合物为液体或冻干粉的形式。
据此,本发明提供了一种不受季节限制,生产规模容易控制的重组的巴曲酶产品,它具有极高的二硫键配对正确率,而且活性高。



图1显示了本发明提供的基因重组巴曲酶的C-端序列及在Asn225位上有糖基化修饰。
图2显示了本发明提供的基因重组巴曲酶的Asn146位上有糖基化修饰。
图3中A显示了非还原的胰凝乳蛋白酶和F1酶解的rBAT的Base Peak图谱;B显示了还原的胰凝乳蛋白酶和F1酶解的rBAT的Base Peak图谱。
图4中A显示了非还原的胰蛋白酶和F1酶解的rBAT的Base Peak图谱;B显示了还原的胰蛋白酶和F1酶解的rBAT的Base Peak图谱。
图5中A显示了非还原的胰凝乳蛋白酶和N-糖苷酶F酶解的rBAT的Base Peak图谱;B显示了还原的胰凝乳蛋白酶和N-糖苷酶F酶解的rBAT的Base Peak图谱。
图6中A显示了非还原的胰蛋白酶和N-糖苷酶F酶解的rBAT的Base Peak图谱;B显示了还原的胰蛋白酶和N-糖苷酶F酶解的rBAT的Base Peak图谱。
图7A-7D显示了二硫键C7-C139的检测图谱;其中 7A是包含二硫键C7-C139的肽段的质荷比m/z图谱; 7B是包含二硫键C7-C139的肽段的MS/MS图谱; 7C是包含半胱氨酸C7的MS/MS图谱; 7D是包含半胱氨酸C139的MS/MS图谱。
图8A-8B显示了二硫键C26-C42的检测图谱;其中 8A是包含二硫键C7-C139的肽段的质荷比m/z图谱; 8B是包含半胱氨酸C26和C42的MS/MS图谱。
图9A-9D显示了二硫键C74-C230的检测图谱;其中 9A是包含二硫键C74-C230的肽段的质荷比m/z图谱; 9B是包含二硫键C74-C230的肽段的MS/MS图谱; 9C是包含半胱氨酸C74的MS/MS图谱; 9D是包含半胱氨酸C230的MS/MS图谱。
图10A-10C显示了二硫键C118-C184的检测图谱;其中 10A是包含二硫键C118-C184的肽段的质荷比m/z图谱; 10B是包含二硫键C118-C184的肽段的MS/MS图谱; 10C是包含半胱氨酸C118的MS/MS图谱。
图11A-11C显示了二硫键C150-C1163的检测图谱;其中 11A是包含二硫键C150-C163的肽段的质荷比m/z图谱; 11B是包含二硫键C150-C163的肽段的MS/MS图谱; 11C是包含半胱氨酸C150的MS/MS图谱。
图12A-12D显示了二硫键C174-C199的检测图谱;其中 12A是包含二硫键C174-C199的肽段的质荷比m/z图谱, 12B是包含二硫键C174-C199的肽段的MS/MS图谱; 12C是包含半胱氨酸C174的MS/MS图谱; 12D是包含半胱氨酸C199的MS/MS图谱。
图13显示了发酵液、超滤液非还原电泳图谱;其中泳道1表示蛋白标记物(Marker),2表示超滤前发酵上清液,3表示超滤流出液,4表示超滤后发酵上清液。
图14显示了阳离子交换层析后的洗脱图谱和电泳图谱(非还原SDS-PAGE);其中泳道1表示蛋白标记物(Marker),2表示超滤后发酵上清,3表示阳离子交换流出液,4表示20mM NaAc-HAc+0.15MNaCl洗脱液,5表示20mM NaAc-HAc+0.50MNaCl洗脱液,6表示20mM NaAc-HAc+1.0MNaCl洗脱液。
图15显示了阴离子交换层析后的洗脱图谱和电泳图谱(非还原SDS-PAGE);其中泳道1表示蛋白标记物(Marker),2表示阳离子交换目的蛋白洗脱液,3表示阴离子交换上样流出液,4表示20mM Tris-HCl+0.15MNaCl洗脱液,5表示20mM Tris-HCl+0.50MNaCl洗脱液。
图16显示了凝胶过滤层析后的洗脱图谱和电泳图谱;其中泳道1表示蛋白标记物(Marker),2表示超滤后发酵上清,3表示阳离子交换rBAT洗脱液,4表示阴离子交换rBAT洗脱液,5-7表示rBAT原液。
图17显示了巴曲酶的氨基酸序列(SEQ ID NO1),其中糖基化位点用下划线表示。

具体实施例方式 发明人经过广泛而深入的研究,通过改进巴曲酶的表达和纯化工艺,从而制得了一种高比活的重组巴曲酶。它具有以下特性 (a)分子量为30-32Kda; (b)所述重组巴曲酶中至少90%巴曲酶具有正确的6对二硫键配对Cys7-Cys139,Cys26-Cys42,Cys74-Cys230,Cys118-Cys184,Cys150-Cys163和Cys1174-Cys199; (c)在SEQ ID NO1中第146位和第225位被糖基化;和 (d)所述巴曲酶的比活性大于1500KU/mg蛋白。
在甲醇酵母(Pichia pastoris)中成功实现了分泌表达有生物学活性的巴西矛头蛇(Bothropsatrox)巴曲酶后,经多步层析纯化得到纯度不低于95%的巴曲酶纯品。
如本文所用,1KU是取0.1ml的人标准血浆于标准血凝仪(C2000-4血凝仪,北京普利生仪器有限公司)检测杯中,37℃预温3分钟,加入经适量稀释的待测定的巴曲酶溶液0.1ml,计时,如果血浆在60±20秒凝固,则每1ml该待测溶液中就含一个克氏单位(KU)的巴曲酶。
本发明提供的基因重组巴曲酶是由231个氨基酸残基组成的单链蛋白(SEQ ID NO1),分子量为29-32Kda,它有两个N-糖基化位点Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr228。
本发明提供的基因重组巴曲酶中至少90%具有正确的6对二硫键配对,它的二硫键连接方式为Cys7-Cys139、Cys26-Cys42、Cys74-Cys230、Cys118-Cys184、Cys150-Cys163和Cys174-Cys199。较佳地≥95%,更佳地≥98%巴曲酶具有正确的二硫键配对。
本发明提供的基因重组巴曲酶的比活性大于等于1500KU/mg蛋白,较佳地为1500-2000KU/mg,更佳地为1500-3000KU/mg。
本发明提供的基因重组巴曲酶利用甲醇酵母喜好的密码子,人工合成了巴曲酶基因序列,构建表达载体,最终在甲醇酵母(Pichia pastoris)中获得了分泌表达有生物学活性的巴西矛头蛇(Bothrops atrox)巴曲酶。发明人发现真核细胞表达系统(酵母、CHO和昆虫细胞等)中能保证较高二硫键配对正确率和表达蛋白的后修饰。发明人在甲醇酵母(Pichia pastoris,Pichia methanolica)中成功地表达出了有生物学活性的巴曲酶蛋白,产量能达到每毫升发酵液20克氏单位(20KU/ml),这一产量具备开发的意义。
发酵上清经过分离纯化可获得纯化的重组巴曲酶。在本发明的一个优选例中,所述的纯化步骤包括超滤、阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶层析,通过优化的层析条件,得到二硫键配对正确率高、比活性强的重组巴曲酶高纯品。
本发明得到的发酵上清中含有大量的杂蛋白、无机盐、色素等等,因此,本发明先采用超滤的方法脱盐除杂蛋白及更换缓冲液,以利于后面的离子交换层析操作。本发明进行超滤的条件为进口压力5-10psi,出口压力2-5psi,流速100-200ml/min。超滤平衡缓冲液pH4-6,较佳地pH4.5-5.5。所述的超滤平衡缓冲体系中可以是本领域常用的盐类,例如但不限于醋酸钠盐、磷酸钠盐、柠檬酸钠盐、Tris-HCl,其中优选醋酸钠-醋酸和氯化钠。所得到的超滤液电导值为8mS/cm以下,较佳地电导值为5mS/cm以下,更佳地电导值为4mS/cm以下。
然后,本发明对超滤后的发酵上清进行阳离子交换层析。可以使用本领域常用的阳离子交换层析柱,例如但不限于SP SepheroseFF,CM SepheroseFF,,优选SP SepheroseFF。洗脱缓冲液pH4-6,较佳地pH4.5-5.5;可以是本领域常用的盐类,例如但不限于醋酸钠、磷酸钠、氯化钠、其中优选醋酸钠-醋酸和氯化钠。其中氯化钠的浓度为0.1-1.0M,较佳地为0.15-1.0M,更佳地为0.4-0.6M。一种优选的洗脱方式是梯度洗脱。
第三步,是将经阳离子交换层析柱后的洗脱液进行阴离子交换层析。可以使用本领域常用的阴离子交换层析柱,例如但不限于Q Sepherose,DEAE Sepherose,Source 30Q,优选Q SepheroseFF。洗脱缓冲液pH7.5-10,较佳地pH8.5-9.5;可以是本领域常用的盐类,例如但不限于Tris-盐酸、磷酸钠、氯化钠,其中优选Tris-HCl和氯化钠。其中氯化钠的浓度为0.05-1.0M,较佳地为0.10-0.6M,更佳地为0.15-0.5M。一种优选的洗脱方式是梯度洗脱。
最后,将经经阴离子交换层析柱后的洗脱液进行凝胶过滤层析。可以使用本领域常用的凝胶过滤层析柱,例如但不限于Sephacryl S,Sepharose4,SephadexG-25,Superdex,优选Superdex75。洗脱缓冲液pH4-6,较佳地pH4.5-5.5;可以是本领域常用的盐类,例如但不限于醋酸钠、磷酸钠、氯化钠,其中优选醋酸钠-醋酸和氯化钠。其中氯化钠的浓度为0.05-0.5M,较佳地为0.10-0.3M,更佳地为0.12-0.2M。
经过上述步骤,得到本发明提供的纯化的基因重组巴曲酶。也可以使用本领域熟知的基因工程方法得到含有巴曲酶蛋白的发酵液,然后经过上述的纯化步骤获得本发明提供的基因重组巴曲酶。
本发明提供的基因重组巴曲酶可用于止血。巴曲酶的特异性作用底物是纤维蛋白原,与凝血酶不同的是,它只切割纤维蛋白原的A链,而不作用B链。当它水解血浆纤维蛋白原A链中的Arg16-Gly17位肽键时,能够释放出纤维蛋白肽A,从而快速地将血液中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白,接着这些纤维蛋白就能聚集成疏松的易于被纤维蛋白酶水解的血栓来封闭伤口,实现快速止血的功效。不过,在使用较大剂量的时侯,巴曲酶能降低血中纤维蛋白原浓度,改善血液黏度和血液的流体力学特性,从而起到降纤酶的功效(US Pat.No3849252,1974)。
本发明还提供一种药物组合物,它含有本发明提供的纯化的基因重组巴曲酶和药学上可接受的载体。
本发明提供的药物组合物中还可以含有水解明胶作为稳定剂。本发明提供的药物组合物可以是固态形式或液体形式,其中优选液体形式,更优选注射液。
本发明的主要优点在于 1、本发明提供的基因重组巴曲酶二硫键配对正确率极高。
2、本发明提供的基因重组巴曲酶比活性很高。
3、本发明提供了获得上述优质基因重组巴曲酶的分离纯化方法。
下面将结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则所有的百分比和份数按重量计。
实施例1 制备实施例 一、获得含巴曲酶蛋白的发酵液 rBAT工程菌在30L罐中的发酵 按1∶10的接种比例接入已预先灭菌装有15L分批发酵培养基的30L发酵罐中,进行分批补料培养(用氨水将pH控制在4.0,温度控制在30℃),当碳源耗尽后(DO陡然上升,1分钟内),流加甘油(流加速率维持溶氧大于20%)。当菌体湿重为200克/L左右停止补料,甘油耗尽后,补入甲醇诱导表达(pH用氨水控制为5.8,温度控制在20℃),通过调节转速、罐压、空气流量和补料速率使溶氧大于20%,诱导时间为60小时。发酵结束,4000rpm离心收集发酵上清,测定活性确认表达产量应该不低于20KU/ml。将发酵上请冻存或直接进入纯化过程。
二、分离纯化 第一步超滤更换缓冲液。选用Millipore Pellicon 10K超滤膜堆,Millipore Masterflex蠕动泵,超滤器进口压力、出口压力分别控制为6psi、3psi,流速为120ml/min,超滤膜先后用注射用水、缓冲液20mM NaAc-HAc+0.15M NaCl(pH5.0)平衡好后,对发酵上清液进行超滤。当超滤至原来体积的五分之一时,补加缓冲液20mM NaAc-HAc(pH5.0)至原来体积,如此反复操作三次,最后补加缓冲液20mM NaAc-HAc(pH5.0)至原来体积作为阳离子交换层析上样液。
第二步阳离子交换层析填料SP Sepharose F F。平衡缓冲液为20mM NaAc-HAc(pH5.0),洗脱缓冲液分别为20mMNaAc-HAc+0.15MNaCl(pH5.0)、20mMNaAc-HAc+0.50MNaCl(pH5.0)、20mM NaAc-HAc+1.0M NaCl(pH5.0),收集20mM NaAc-HAc+0.50M NaCl(pH5.0)洗脱液。
第三步阴离子交换层析Q SepharoseFF。将阳离子交换20mMNaAc-HAc+0.50M NaCl(pH5.0)洗脱液调节pH值至9.0,稀释电导至3.0mS/cm上样,平衡缓冲液为20mM Tris-HCl(pH9.0),洗脱缓冲液分别为20mM Tris-HCl+0.15M NaCl(pH9.0),20mM Tris-HCl+0.50M NaCl(pH9.0),收集20mM Tris-HCl+0.15M NaCl(pH9.0)洗脱液。
第四步凝胶过滤层析Superdex75填料,6.0×60cm预装柱,CV1700ml。缓冲液采用20mMNaAc-HAc+0.15M NaCl(pH5.0),将阴离子交换层析20mM Tris-HCl+0.15M NaCl(pH9.0)洗脱液分批次上样,分段收集rBAT主峰,将纯度大于95%的样品合并,除菌后即为rBAT原液I。
实施例2 性能实施例 对实施例1制得的rBAT原液I进行检测 1.实验主要参数 检测仪器型号LCQ DECA XP plus 进样方式Microspray 毛细管温度170℃ 色谱柱0.15MM*150MM(RP-C18) 仪器公司FINNIGAN检测方式正离子 2.实验方法 样品rBAT超滤除盐,碘乙酰胺(IAA)修饰→胰蛋白酶(Trypsin)和胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)酶解→N-糖苷酶F和F1酶解→1/2酶解产物二硫苏糖醇(DTT)还原、IAA修饰→质谱分析→数据分析,确定rBAT蛋白质的C端序列,糖基化位点和二硫键配对方式。
3.实验结果及分析 3.1C端序列分析 蛋白C-端序列质谱法鉴定的原理先用蛋白酶对待测蛋白进行酶解,得到含有C端序列的肽段,然后通过比较实验得到的二级质谱和理论得到的二级质谱的相似性(Xcorr),从而对C-端序列进行验证。
如果没有用N-糖苷酶(PNGase F)对rBAT蛋白进行脱糖处理,则不能确认rBAT蛋白质的C-端序列。然而,当用N-糖苷酶(PNGase F)对rBAT蛋白酶解产物进行脱糖处理后,实验数据和理论得到的二级质谱符合得很好,其C-端序列可验证为IQSIIAGDKTATCP。注意,PNGase F在脱除连接在Asn上的糖链的同时,也将Asn转变为Asp,同时,Cys也被修饰,变成为乙酰化的半胱氨酸。实验结果如图1所示。实验中观察到一系列的b和y离子,如b2,b3,b5-b12,y1-y4,y6,y8-y12。b和y是实验中最常见的碎片离子,是因为肽段的肽链的断裂而产生的。如果断裂后的电荷在肽段的N端,则是b离子,如果电荷在肽段的C端,则是y离子。如该图中的y1-8离子,其是GDKTATCP+,y表示该离子是y系列离子,1表示该离子带的电荷数是1,而8则说明肽键断裂的位置。
3.2糖基化位点的确定 糖基化为点鉴定原理先用蛋白酶对待测蛋白进行酶解,得到不同大小的肽段。然后,部分酶解后的样品用PNGase F切除连接在Asn上的糖链,并将Asn转变为Asp。然后对经过脱糖处理和未经过脱糖处理的样品分别进行HPLC-MS-MS分析。通过比较实验得到的肽段覆盖率,可以鉴定出是否有糖基化修饰以及糖基化修饰的位点。
实验发现两个N-糖基化位点,一个为Asn146,另一个为Asn225。Asn225糖基化位点的鉴定见图1。Asn146糖基化位点的鉴定见图2。
注意N-糖苷酶将N-糖链切除后,同时将Asn转变为Asp,同时,cys也被修饰,变成为乙酰化的半胱氨酸。绝大部分的b和y离子都被检测到,如b1-b8,y1-8,这充分证实了该肽段的序列。
3.3二硫键配对方式 质谱法鉴定二硫键的原理首先用碘乙酰胺(IAA)将待测蛋白的游离的半胱氨酸封闭起来,然后用蛋白酶在非还原状态下对待测蛋白进行酶解。一部分酶解产物直接进行HPLC-MS-MS分析,另一部分则用二硫苏糖醇(DTT)还原,然后用碘乙酰胺对半胱氨酸进行修饰,防止形成新的二硫键。最后,通过比较所检测到的肽段的差异,得出由DTT还原而产生的新的肽段,从而推断出二硫键的连接方式。最后,从非还原状态下酶解产物的二级质谱图中,通过对比母离子的分子量和二级质谱图,从而确认二硫键的连接方式。
因为在rBAT蛋白中存在糖基化修饰,而从上面的数据中发现,在糖基化修饰位点有半胱氨酸的存在,这会影响到二硫键配对方式的检出,因此,在蛋白酶酶解后,我们加入了用PNGaseF除去糖链的步骤,这样为二硫键配对方式的检出提供了便利条件。我们设计了rBAT-胰凝乳蛋白酶-N-糖苷酶F-非还原和rBAT-胰凝乳蛋白酶-N-糖苷酶F-还原、rBAT-胰蛋白酶-N-糖苷酶F-非还原和rBAT-胰蛋白酶-N-糖苷酶F-还原、rBAT-胰凝乳蛋白酶-F1-非还原和rBAT-胰凝乳蛋白酶-F1-还原、rBAT-胰蛋白酶-F1-非还原和rBAT-胰蛋白酶-F1-还原四组对照实验。从这四组数据中,我们分析了75种可能的包含二硫键的肽段,共47种二硫键配对方式。应用严格的筛选标准,六对二硫键被检测到C7-C139、C26-C42、C74-C230、C118-C184、C150-C163和C174-C199;另外微量的没有形成二硫键的半胱氨酸肽段C7、C118和C150也被检测到。具体结果见实验图谱3-6和图8-12。
对通过二硫键结合的肽段,由于其包含两段肽链,其断裂的方式比较多。其可能是其中的某一个链断裂,而通过二硫键结合的另外一个肽链则保持不变。也有可能是两个肽链分别断裂。在此,以通过Cys7和Cys139连接的肽段为例,说明二硫键连接方式的判定方法。在rBAT-胰凝乳蛋白酶-N-糖苷酶F-非还原和rBAT-胰凝乳蛋白酶-N-糖苷酶F-还原的实验中,我们检测到VIGGDECDINEHPF和GAITTSEDTYPDVPHCANIN这两个肽段(图7C和图7D),而这两个肽段的在rBAT-胰凝乳蛋白酶-N-糖苷酶F-非还原实验中没有被检测到。在非还原样品中,我们检测到荷质比为916.1Da,1221.3Da和1831.4Da的峰(如图7A),通过去卷积分析,发现这三个峰都对应于分子量为3660.3的肽段,他们分别是该肽段的四价,三价和二价离子。而由VIGGDECDINEHPF和GAITTSEDTYPDVPHCANIN通过二硫键连接的肽段的分子量刚好是3660.9Da.。由此,可以推断出这两段肽是通过二硫键结合的。进一步的二级质谱数据证实了这种推断。图7B是通过二硫键连接的VIGGDECDINEHPF和GAITTSEDTYPDVPHCANIN的二级质谱。实验中,检测到一系列的C139-y2离子(Cys139-y2-5到Cys139-y2-18)。这充分证实了其二硫键的存在。以Cys139-y2-10为例,其检测到的荷质比为1311.33Da。C139表示该离子是通过含有Cys139残基的肽链的断裂而产生的,另外一个肽链则依然通过二硫键连接在上面;y2说明该离子是y系列的离子,并且带有2个电荷;10则表示肽键断裂的位置(Y-P)键。
结果表明,所制得的rBAT原液I中的rBAT二硫键配对正确率为≥95%。
3.4通过发酵层析纯化后获得的rBAT蛋白原液I 纯度98% 浓度1.02mg/ml 比活性2000KU/mg 实施例3 纯化工艺研究实施例 1.疏水层析条件的研究 由于发酵采用无机盐培养基(pH值6.0左右),所以发酵上清含有较高的盐,电导较高,故想采用疏水层析作为纯化第一步,粗纯rBAT。
1.1pH6.0时疏水层析条件的研究 分别取发酵上清100ml,按如下操作 上述A、B、C组,调节pH值至6.0后,12000rpm、室温、离心10分钟,收集上清,分别测定活性。
选用Phenyl Sepharose FastFlow 1ml预装柱,经缓冲液120mM PB,1.5M(NH4)2SO4,pH6.0平衡后,上A组(上样体积100ml,以下同),收集流出液,测定活性;Phenyl SepharoseFastFlow1ml预装柱再生后,经缓冲液220mMPB,1.0M(NH4)2SO4,pH6.0平衡后,上B组,收集流出液,测定活性;Phenyl Sepharose FastFlow 1ml预装柱再生后,经缓冲液320mM PB,0.5M(NH4)2SO4pH6.0平衡后,上C组,收集流出液,测定活性。结果如下表 由上表数据可见,在此条件下rBAT与Phenyl Sepharose Fast Flow结合不好,有相当一部分流出,所以此种条件不适于rBAT的纯化。
1.2pH5.0时疏水层析条件的研究 分别取发酵上清100ml,按如下操作 上述D、E、F组,调节pH值至5.0后,12000rpm、室温、离心10分钟,收集上清,分别测定活性。
选用Phenyl Sepharose FastFlow 1ml预装柱,经缓冲液420mM NaAc-HAc,1.5M(NH4)2SO4,pH5.0平衡后,上D组(上样体积100ml,以下同),收集流出液,测定活性;PhenylSepharose FastFlow 1ml预装柱再生后,经缓冲液520mM NaAc-HAc,1.0M NH4)2SO4,pH5.0平衡后,上E组,收集流出液,测定活性;Phenyl Sepharose FastFlow 1ml预装柱再生后,经缓冲液620mM NaAc-HAc,0.5M(NH4)2SO4,pH5.0平衡后,上F组,收集流出液,测定活性。结果如下表 pH降低以后,rBAT蛋白的疏水性有所增加,与pH6.0时相比,流出液的活性无多大变化,仍有相当部分的流出,所以应当更换疏水填料作进一步的研究。
1.3pH5.0时,Butyl与Octyl填料的研究 分别取发酵上清100ml,按如下操作 上述G、H组,调节pH值至5.0后,12000rpm、室温、离心10分钟,收集上清,分别测定活性。
选用Butyl Sepharose FastFlow 1ml预装柱,经缓冲液720mM NaAc-HAc,1.5M(NH4)2SO4,pH5.0平衡后,上G组(上样体积100ml,以下同),收集流出液,测定活性;选用Octyl Sepharose FastFlow 1ml预装柱,经缓冲液820mM NaAc-HAc,1.5M(NH4)2SO4,pH5.0平衡后,上H组,收集流出液,测定活性。结果如下表 在此条件下,rBAT与填料的结合没有改善,流出液中rBAT的比例仍很高。
综上所述,由于rBAT与疏水填料的结合性能不好,即使降低了整个操作系统的pH值,提高的效果不大,且以上操作均在室温下进行,若再增加操作时的温度以提高疏水性,对rBAT蛋白的活性可能会有影响,所以这提示疏水层析并不适合rBAT蛋白的纯化。
2.阳离子交换层析条件的研究 由于发酵上清中含有大量的杂蛋白、无机盐、色素等等,拟采用超滤的方法脱盐除杂蛋白及更换缓冲液,以利于后面的离子交换层析操作。但由于不清楚rBAT蛋白采用哪种缓冲液适合离子交换层析,即不清楚超滤时更换哪种缓冲液,所以应该首先研究rBAT蛋白在不同条件下的离子交换层析的吸附行为,以确定缓冲液,再来研究超滤的条件。
2.1上样液最佳pH及电导的优选 根据rBAT的等电点(理论等电点为7.39),把发酵上清液,用1M的HAc分别调节pH值为4.5、5.0、5.5和6.0。在各个pH值下,用注射用水分别把发酵上清稀释至电导如下表所示。选用1ml SP Sepharose Fast Flow预装柱,上样量为50ml发酵上清(稀释前),流速为1.0ml/min,收集流出液并测定活性,进行上样液条件优选,结果如下 pH=4.5,平衡缓冲液20mM NaAc-HAc,pH4.5 pH=5.0,平衡缓冲液20mM NaAc-HAc,pH5.0 pH=5.5,平衡缓冲液20mM NaAc-HAc,pH5.5 pH=6.0,平衡缓冲液20mM NaAc-HAc,pH6.0 由以上表中的各数据可知,在pH=4.5与5.0的条件下,稀释液的电导为4.0mS/cm时,rBAT基本上没有流出,考虑到pH值对rBAT蛋白活性的影响,故选用把发酵上清调节pH值至5.0,稀释电导至4.0mS/cm,平衡缓冲液为20mM NaAc-HAc,pH5.0的条件,来研究rBAT蛋白在阳离子交换层析上的洗脱行为。所以,超滤更换的缓冲液为20mM NaAc-HAc,pH5.0,且应超滤至电导4.0mS/cm以下。
2.2超滤条件的研究 采用Millipore Pellicon 10K超滤器、Millipiore Masterflex蠕动泵,操作参数进口压力10psi,出口压力5psi,流速200ml/min。先后用注射用水、缓冲液20mM NaAc-HAc,pH5.0将超滤器平衡好,然后取5L发酵液开始超滤,至剩余1L发酵液时,补加缓冲液20mM NaAc-HAc,pH5.0至5L,如此反复循环3次,最后用缓冲液20mMNaAc-HAc,pH5.0补足至5L(经测定pH5.0,电导3.5mS/cm),分别取发酵液、超滤液、流出液测定活性,结果如下 此条件下超滤的损失在20%左右,疑为膜堆非特异性的吸附或操作压力过大所致,所以做第二次试验时,先用注射水将进口压力、出口压力分别调整为6psi、3psi,流速调整为120ml/min,用缓冲液20mM NaAc-HAc,0.15M NaCl,pH5.0平衡超滤系统。取5L发酵液开始超滤,至剩余1L发酵液时,补加缓冲液20mM NaAc-HAc,pH5.0至5L,如此反复循环3次,最后用缓冲液20mMNaAc-HAc,pH5.0补足至5L(经测定pH5.0,电导3.5mS/cm),分别取发酵液、超滤液、流出液测定活性,结果如下 结果表明,通过超滤更换缓冲液,rBAT的活性得率在90%上。超滤后的发酵上清非常有利于下一步的阳离子交换层析。
2.3阳离子交换层析洗脱条件的研究 选用1ml SP Sepharose F F预装柱,平衡缓冲液A20mM NaAc-HAc,pH5.0,洗脱缓冲液为B20mM NaAc-Hac,1.0M NaCl,pH5.0,把50ml超滤后发酵上清液以1.0ml/min的流速上样,上样完毕后用平衡缓冲液A平衡,进行梯度洗脱,条件为0-100%B,20CV,流速1.0ml/min,结果发现在0-100%B的洗脱过程中共含有三个洗脱峰,出峰位置分别位于18%B、45%B和60%B处,分别取样测活;最后用2M NaCl再生柱子,收集再生峰并测活。所有结果如下 由上表数据可知,rBAT蛋白主要集中在45%B(0.45MNaCl)洗脱峰内,但在18%B(0.18MNaCl)洗脱峰的中后段、60%B(0.60MNaCl)洗脱峰的中前段也有少量的rBAT蛋白,所以应把18%B适当降低、45%B适当升高,使得rBAT蛋白主要集中在一个洗脱峰内。因此重复以上试验过程,只是在洗脱时采用15%B、50%B和100%B分段洗脱,分别收集各洗脱峰,测定活性,结果如下 由上表的数据可知,rBAT蛋白绝大部分集中在50%B(0.50M NaCl)洗脱峰内,15%B(0.15MNaCl)洗脱峰的后段和100%B(1.0M NaCl)洗脱峰的前段虽有少量的rBAT蛋白,但相对于发酵液来讲,活性已经很低,所以最后把洗脱条件确定为20mM NaAc-HAc,0.15M NaCl,pH5.0、20mMNaAc-HAc,0.50MNaCl,pH5.0和20mM NaAc-HAc,1.0M NaCl,pH5.0,收集20mM NaAc-HAc,0.50MNaCl,pH5.0洗脱峰,即为rBAT蛋白峰。
2.4阳离子交换层析过程的分析研究 选用规格为1.6×15cm的层析柱,内装20ml SP Sephrose FF填料,上样流速为10ml/min,把1000ml超滤后发酵上清液上样。平衡缓冲液为20mM NaAc-HAc,pH5.0,洗脱缓冲液分别为20mMNaAc-HAc,0.15M NaCl,pH5.0、20mM NaAc-HAc,0.50M NaCl,pH5.0,和20mM NaAc-HAc,1.0MNaCl,pH5.0,分别收集各个洗脱峰(1.0M洗脱峰色素较重),洗脱图谱和电泳图谱(非还原SDS-PAGE)如图14 对各个收集液分别取样,测定活性,结果如下 结果表明,20mM NaAc-HAc,0.50MNaCl,pH5.0洗脱峰,为rBAT蛋白峰。
3.阴离子交换层析条件的研究 3.1上样液最佳pH及电导的优选 根据rBAT的等电点(理论等电点为7.39),把上步20mMNaAc-HAc,0.50MNaCl,pH5.0洗脱峰,用1M的NaoH分别调节pH值为8.0、8.5、和9.0。在各个pH值下,用注射用水分别稀释至电导如下表所示。选用1ml Q Sepharose Fast Flow预装柱,上样量为10ml阳离子交换rBAT收集液(稀释前),流速为1.0ml/min,收集流出液并测定活性,进行上样液条件优选,结果如下 pH=8.0,平衡缓冲液20mM Tris-HCl,pH8.0 pH=8.5,平衡缓冲液20mM Tris-HCl,pH8.5 pH=9.0,平衡缓冲液20mM Tris-HCl,pH9.0 由以上表中的各数据可知,在pH9.0条件下,稀释液的电导为3.0mS/cm时,rBAT基本上没有流出,故选用把阳离子交换rBAT收集液调节pH值至9.0,稀释电导至3.0mS/cm,平衡缓冲液为20mM Tris-HCl,pH9.0,来研究rBAT蛋白在阴离子交换层析上的洗脱条件。
3.2阴离子交换层析洗脱条件的研究 选用1ml Q Sepharose F F预装柱,平衡缓冲液A为20mM Tris-HCl,pH9.0,洗脱缓冲液B为20mM Tris-HCl,1.0M NaCl,pH9.0,把10ml阳离子交换rBAT收集液调节pH值至9.0,稀释电导至3.0mS/cm,1.0ml/min的流速上样。首先进行梯度洗脱,条件为0-100%B,20CV,流速1.0ml/min,结果发现在0-100%B的洗脱过程中共含有两个洗脱峰,出峰位置分别位于10%B和50%B处,但是10%B峰拖尾比较严重,分别收集并取样测活;最后用2MNaCL再生柱子,收集再生峰并测活。结果如下 为了克服10%B洗拖峰的拖尾问题,洗脱条件改为从0-40%B,5CV,后升至50%B,流速1.0ml/min,第一峰的拖尾有明显改善,峰尖位于15%B处,分别收集并取样测定活性。结果如下 所以最后把洗脱条件确定为20mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH9.0、20mM Tris-HCl,0.50MNaCl,pH9.0,收集20mMTris-HCl,0.15MNaCl,pH9.0洗脱蛋白峰,即为rBAT蛋白峰。
3.3阴离子交换层析过程的分析研究 选用规格为1.6×15cm的层析柱,内装20ml Q Sephrose F F填料,上样流速为10ml/min,把200ml阳离子交换rBAT收集液调节pH值至9.0,稀释电导至3.0mS/cm上样。平衡缓冲液为20mMTris-HCl,pH9.0,洗脱缓冲液分别为20mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH9.0和20mM Tris-HCl,0.50MNaCl,pH9.0,分别收集各个洗脱峰,洗脱图谱和电泳图谱(非还原SDS-PAGE)如图15 对各个收集液分别取样,测定活性。结果如下 由此可见20mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH9.0洗脱峰,即为rBAT蛋白峰。
4.凝胶过滤层析的条件 选用Pharmacia公司Superdex 75填料,6.0×60cm预装柱,CV1700ml,平衡缓冲液为20mMNaAc-HAc,0.15M NaCl,pH5.0,将阴离子交换层析20mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH9.0洗脱液分批次上样,每次上样量不超过85ml(柱体积的5%),分段收集洗脱峰,将纯度大于95%的样品合并,除菌后即为rBAT原液。
洗脱图谱及电泳图谱如图16 5.纯化工艺重复性的研究 按照以上工艺流程,以实施例1方法得到的一批发酵上清连续三次验证纯化工艺,结果如下
*平均总得率为33.6%。
6.纯化工艺的中试 6.1超滤更换缓冲液选用Millipore Pellicon 10K超滤膜堆,Millipore Masterflex蠕动泵,超滤器进口压力、出口压力分别控制为6psi、3psi,流速为120ml/min,超滤膜先后用注射用水、缓冲液20mMNaAc-HAc,0.15MNaCl,pH5.0平衡好后,对发酵上清液进行超滤。当超滤至原来体积的五分之一时,补加缓冲液20mM NaAc-HAc,pH5.0至原来体积,如此反复操作三次,最后补加缓冲液20mM NaAc-HAc,pH5.0至原来体积作为阳离子交换层析上样液。
6.2阳离子交换层析将超滤后发酵上清液上SP Sepharose F F阳离子交换层析层析柱,柱规格为Index70/500mm,填料高度7.5cm,柱床体积为300ml,平衡缓冲液为20mM NaAc-HAc,pH5.0,洗脱缓冲液分别为20mM NaAc-HAc,0.15M NaCl,pH5.0、20mM NaAc-HAc,0.50M NaCl,pH5.0、20mM NaAc-HAc,1.0M NaCl,pH4.0,收集20mM NaAc-HAc,0.50M NaCl,pH5.0洗脱峰。
6.3阴离子交换层析将阳离子交换层析20mMNaAc-HAc,0.50MNaCl,pH5.0洗脱液调节pH值至9.0,稀释电导至3.0mS/cm以下,上Q Sepharose F F阴离子交换层析,规格为36/30,填料高度6cm,柱床体积为60ml,平衡缓冲液20mM Tris-HCl,pH9.0,洗脱缓冲液分别为20mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH9.0,和20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,pH9.0,收集20mM Tris-HCl,0.15MNaCl,pH9.0洗脱峰。
6.4凝胶过滤层析将阴离子交换层析20mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH9.0洗脱液分批上分子筛Superdex 75,规格为60/600mm预装柱,柱床体积为1700ml,每次上样量为不超过柱床体积的5%(85ml),缓冲液为20mM NaAc-HAc,0.15M NaCl,pH5.0,分段收集,将纯度大于95%的样品合并,除菌后即为rBAT原液。
6.5连续三批中试产品纯化结果见下表 批号20030601
批号20030602
批号20030603
实施例4-10 药物组合物 将实施例1制得的高纯化的基因重组巴曲酶(rBAT原液I)与含有下表中的各辅料组分的注射用水溶液混合,得到重组巴曲酶液体制剂。

√代表该组配方选择了本辅料。
实施例11-17 稳定性测试实施例 参见实施例4-10的配方组成。
37℃稳定性实验结果 实施例4-10的重组巴曲酶制剂规格均为1KU/ml,也就是说在各个检测点,将100ul含重组巴曲酶的某一配方的溶液同100ul的经抗凝处理的人标准血浆混合,在37℃下,能在60±20秒内凝固。超出范围的均算不合格。
在进行制剂稳定性试验时,将原液稀释至活性浓度为1KU/ml进行。
实施例4-10的重组巴曲酶制剂存放在37℃下,于各个检测点的凝血时间(秒)。见下表
>196s表示超出血凝仪的最大量程仍没有凝血发生。
结果表明,使用水解明胶作为保护剂,可以使重组巴曲酶显示出较高的稳定性,能在37℃下稳定100天以上。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1. 一种纯化的重组巴曲酶,其特征在于,所述的巴曲酶具有以下特性
(a)分子量为29-32kDa;
(b)所述重组巴曲酶中至少90%巴曲酶具有正确的6对二硫键配对Cys7-Cys139,Cys26-Cys42,Cys74-Cys230,Cys118-Cys184,Cys150-Cys163和Cys1174-Cys199;
(c)在SEQ ID NO1中第146位和第225位被N-型糖基化修饰;和
(d)所述巴曲酶的比活性大于等于1500KU/mg蛋白。
2. 如权利要求1所述的巴曲酶,其特征在于,所述重组巴曲酶中至少95%巴曲酶具有正确的6对二硫键配对。
3. 如权利要求1所述的巴曲酶,其特征在于,所述巴曲酶中的糖基化是在以下位点Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr228中的Asn氨基酸残基中发生N-糖基化修饰。
4. 如权利要求3所述的巴曲酶,其特征在于,其N-型糖基化修饰可使巴曲酶蛋白的分子量在25.6kDa的基础上增加4000-6000kDa。
5. 如权利要求1所述的巴曲酶,其特征在于,所述巴曲酶的比活性1500-3000KU/mg。
6. 如权利要求1所述的巴曲酶,其特征在于,所述巴曲酶中至少99%具有正确的6对二硫键配对。
7. 一种如权利要求1所述的纯化的重组的巴曲酶在制备止血药物中的应用。
8. 一种药物组合物,其特征在于,它含有权利要求1所述的巴曲酶和药学上可接受的载体。
9. 如权利要求8所述的药物组合物,其特征在于,所述的组合物还含有水解明胶作为稳定剂。
10. 如权利要求8所述的组合物,其特征在于,所述的组合物为液体或冻干粉的形式。
全文摘要
本发明公开了一种基因重组巴曲酶,它具有以下特性(a)分子量为29-32Kda;(b)所述重组巴曲酶中至少90%巴曲酶具有正确的6对二硫键配对Cys7-Cys139,Cys26-Cys42,Cys74-Cys230,Cys118-Cys184,Cys150-Cys163和Cys1174-Cys199;(c)在SEQ ID NO1中第146位和第225位被糖基化;和(d)所述巴曲酶的比活性大于1500KU/mg。
文档编号C12N9/50GK101275126SQ20071003891
公开日2008年10月1日 申请日期2007年3月30日 优先权日2007年3月30日
发明者黄秀东, 陈佩新, 潘学工, 强 王, 曹之舫 申请人:上海万兴生物制药有限公司
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