专利名称：包含有乙醛脱氢酶的解酒药的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及解酒药的新用途，具体而言，涉及包含有乙醛脱氢酶的解酒药用于心脏的保护和心脏病的治疗保健食品或药物。
背景技术：
心脏被称为人体“发动机”，心脏是一个健壮、不知疲倦、努力工作的强力泵。心脏之于身体，如同发动机之于汽车。如果按一个人心脏平均每分钟跳70次、寿命70岁计算的话，一个人的一生中，心脏就要跳动26亿次。一旦心脏停止跳动而通过抢救不能复跳，那就意味着，一个人的生命终止了。心脏是人类健康的头号杀手，全世界1/3的人口死亡是因心脏引起的，而我国，每年有几十万人死于心脏病。
由是可见，心脏之于人类的重要意义。保护心脏的方式很多，比如培养健康合理的生活习惯，保持平和的心态，坚持适量运动，如果万一患上心脏病，不得不进行治疗，目前常用的心脏病药物有速效救心丸、复方丹参片、地奥心血康和天士力复方丹参滴丸，这些药物药效显著，但是其副作用也不容忽视。
解酒药发挥解酒防醉作用的重要成分就是ALDH2，由生物酶技术生产，它是快速分解乙醛的酶，而乙醛是酒精代谢过程中对人体危害最大的物质。
通过研究结果证实乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase2，ALDH2)高表达可以发挥心肌保护作用，减少缺氧导致的心肌细胞凋亡。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供解酒药的新用途，具体而言，就是将包含有乙醛脱氢酶的解酒药用于心脏的保护和心脏病的治疗保健食品或药物。
本发明的技术方案如下一种包含有乙醛脱氢酶的解酒药的新用途，将含有乙醛脱氢酶的解酒药用于心脏的保护和心脏病的治疗保健食品或药物。
在上述技术方案基础上，所述的包含有乙醛脱氢酶的解酒药是指含有乙醛脱氢酶的保健品或药物，包括海王金樽，安体普，或解酒神茶等。
在上述技术方案基础上，所述的心脏病包括冠状动脉粥样硬化性心脏病以及心力衰竭。其中，所述的心力衰竭是指各种原因引起如缺血性心脏病、风湿性心脏病、瓣膜性心脏病、原发性扩张性心肌病等。
本发明的原理是由于解酒药能通过补充ALDH2而减轻心肌缺血/再灌注损伤。以下通过动物实验说明选择市面上一种能提高ALDH2的解酒药(以下简称药物组)，比较该药物与辛伐他汀(他汀类药物)对大鼠缺血再灌注后损伤的影响。其中，他汀类药物是目前临床上常用、有效的调脂药物。另外，近年来，他汀类药物的非调脂作用日益受到关注，临床研究发现，早期应用他汀类药物能明显改善心肌梗死及不稳定型心绞痛患者的预后，降低发病率、死亡率。
药物组采用海王金樽(海王集团)，主要成分为牡蛎提取物，提高乙醛脱氢酶活性。通过实验证明含有乙醛脱氢酶的解酒药对心脏的保护和心脏病的治疗有效。
本发明所称的解酒药除海王金樽外，还包括
1.安体普(原苏联特工使用解酒药RU21)安体普所含的活性物质激励体内产生乙醛脱氢酶，并提高其活性，全面提升机体对乙醛的分解能力，达到主动解酒、清醒护体之功效。
2、内蒙古赤峰市杰恩天然生物资源研究开发部(解酒醒神茶)解酒醒神茶所应用的核心技术乙醛脱氢酶是用生物酶技术生产的，它能快速分解乙醛所必须的酶。而乙醛是酒精代谢过程中对人体危害最大的物质。乙醛脱氢酶直接分解乙醛而达到解酒防醉的目的。作为解酒醒神茶的重要成分，它在解酒防醉过程中的作用是无可取代的。
3.其它用乙醛脱氢酶制成的保健食品或药物。
图1为缺血再灌注模型示意图；图2为TTC染色法评价药物对缺血再灌注后心肌保护的作用示意图；图3为ALDH2腺病毒颗粒的转染效率示意图；图4为RT-PCR测定ALDH2病毒颗粒的转染效率示意图；图5为乙醛代谢法测定转染后ALDH2酶活性示意图；图6为采用Hoechest 33324法检测细胞凋亡示意图；图7为采用TUNEL法检测细胞凋亡示意图；图8为采用流式细胞仪法检测细胞凋亡示意图。
其中，图1和图2中的药即指解酒药。
具体实施例方式
例1一、实验材料SD大鼠6-8周龄，体重250g(购于中科院实验动物中心)伊文思蓝国药集团化学试剂有限公司四氮唑(TTC)上海灵锦精细化工有限公司氯胺酮手术器械眼科剪，止血钳，镊子，剪毛剪，持针器，三齿撑开器，接扎线，缝合线，刀片小动物呼吸机尼康相机二、实验过程1.实验分组SD大鼠分成3组(生理盐水对照组；药物组；辛伐他汀组)，每组10只。手术前三天分别用生理盐水(1ml/kg体重)灌胃，药物(50mg/kg)灌胃，腹腔注射辛伐他汀(1mg/kg体重)。
2.术前准备手术前半个小时，再次分别用生理盐水(1ml/kg体重)和药物(50mg/kg体重)灌胃组，辛伐他汀(1mg/kg体重)采用腹腔注射。观察大鼠状态。
3.建立大鼠缺血再灌注模型3.1大鼠麻醉及固定大鼠腹腔注射氯胺酮(1ml/kg体重)，约2-3分钟后，大鼠处于麻醉状态。此时用皮绳将大鼠四肢和头部固定于木板上。插入气管插管，打开呼吸机，呼吸机频率90，潮气量0.6。观察大鼠呼吸频率、深浅，是否麻醉完全，根据情况再补注少量氯胺酮。
3.2缺血再灌注酒精清洗大鼠开胸部位，左胸4-5肋间隙处开口，游离表皮和胸大肌和胸小肌，小心避开肋间动脉以防止大量出血，直至清楚暴露4-5肋间隙。钝性分离肋间隙，撑开器撑开，此时可观察到跳动的心脏。撕开心包膜，完全暴露心脏。在距冠状动脉前降支根部1-2mm处(即左心耳与肺动脉圆锥之间)，采用6/0线结扎，系一个活结，拉紧结，结扎线以下心肌组织外观苍白，心前壁跳动减弱。心电图显示ST段抬高，放松后心肌组织颜色恢复，ST段回落，表明模型建立成功。结扎30min后，松开结扎线，使冠状动脉血流再通，再灌注时间为3小时。
4.伊文思蓝和四氮唑(TTC)染色评估梗死面积大鼠经30min缺血和3小时再灌注后，再度开胸，将原结扎线收紧，以10g/L的伊文思蓝经心尖部注入心腔，以区分缺血区和非缺血区，染成蓝色的组织为非缺血区，未着色组织即红色组织为缺血区。迅速取下心脏，用生理盐水洗出心腔和冠脉内的血液，吸净表面水分。在结扎线水平下将心脏切成1mm左右的薄片5片，将切片浸入0.5mg/ml的TTC磷酸缓冲液中，37℃孵育30min，以区分缺血区(缺血心肌，包括缺血梗死区和缺血未梗死区心肌)和梗死区。
5.拍照统计心脏组织用10％的甲醛固定24h，以增强染色颜色对比。经以上处理，心肌组织被分区蓝色为正常心肌，浅红色为缺血区未梗死心肌，灰白色为缺血梗死心肌。拍照并通过计算机图像分析软件计算缺血区心肌占整个心肌面积的百分比，大于30％者表示模型建立成功，进一步计算梗死心肌占缺血区心肌的面积百分比来表示梗死程度。数学统计分析药物和辛伐他汀对缺血再灌后心肌细胞损伤的影响。
三、实验结果如图1缺血再灌注模型示意图所示，三个实验组中，缺血区占全心面积的百分比均大于30％，说明建立模型成功。进一步统计分析显示各组之间缺血区占全心面积的百分比无显著差异，说明三组间心肌缺血的程度是相当的，不存在结扎程度不同而带来的结果偏倚。
如图2 TTC染色法评价药物对缺血再灌注后心肌保护的作用示意图所示，图中分别为辛伐他汀、药物与生理盐水(n＝6)对照组在缺血再灌注后的梗死区/缺血区的比较。结果显示，辛伐他汀(n＝6)和药物组(n＝6)中细胞梗死率明显低于生理盐水对照组(p＜0.001)，二者均能显著改善缺血再灌注导致的心肌损害。
四、结论研究显示本发明所提供的药物与辛伐他汀具有同等的改善缺血再灌注导致的心肌损害的作用。众所周知，他汀类药物是羟甲基戊二酸甲酰辅酶A还原酶抑制剂。
心肌缺血时，内皮功能发生紊乱，中性粒细胞聚集，过氧化反应及炎症反应发生，内皮结构破坏，造成血管收缩，血流变慢，局部区域心肌梗死、心肌细胞凋亡、坏死。他汀类药物通过增加内皮一氧化氮(NO)合成，抑制中性粒细胞聚集，减轻炎症反应及氧化还原反应，有效减少梗死面积和缓解心肌缺血再灌注引起的损伤，减轻凋亡、减少坏死细胞数目。这在本实施例中也得到体现，而药物的保护作用与辛伐他汀相当，这预示了以该药物为代表的解酒药在改善心肌缺血及心梗后改善残存心肌功能方面具有广阔临床应用前景。
例2一、实验目的通过检测转染野生和缺失型乙醛脱氢酶2(ALDH2*1/ALDH2*2)基因，对大鼠心肌细胞在缺氧状态下发生凋亡的影响，进一步证明ALDH2对心肌细胞凋亡的保护作用。
二、材料材料与例1相同。
三、实验步骤
(一)建立细胞缺氧模型，采用与例1相同方法建立细胞缺氧模型。
(二)检测细胞凋亡，比较转染野生和缺失型乙醛脱氢酶2(ALDH2*1/ALDH2*2)基因后，大鼠心肌细胞在对缺氧所致凋亡的变化。凋亡的测定通过用Hoechest 33324、免疫荧光标记的流式细胞仪(FACS)和TUNEL试剂盒检测。
四、实验结果转染ALDH2野生型和缺失型基因后再缺氧，表现为转染缺失型的心肌细胞对缺氧性损伤的耐受性明显差于野生型，细胞凋亡的改变有Hoechest 33324染色中，细胞核溶解和核碎裂P＜0.05，在FACS和TUNEL检测中，凋亡细胞明显增加P＜0.05)。
五、结论通过上述实验结果证明，ALDH2酶活性降低可增加心肌细胞对缺氧导致凋亡的易感性，ALDH2对缺氧引起的细胞凋亡损伤具有保护作用。
如图3ALDH2腺病毒颗粒的转染效率示意图所示，用携带绿荧光蛋白的空载体转染，得到的结果显示转染效率＞50％。
如图4 RT-PCR测定ALDH2病毒颗粒的转染效率示意图所示，RT-PCR测定ALDH2病毒颗粒的转染效率，RT-PCR反应转染ALDH2野生型(*1)和缺失型(*2)结果，为187bp.
如图5乙醛代谢法测定转染后ALDH2酶活性示意图所示，用分光光度计(340nm)测定转染ALDH2野生型(*1)和缺失型(*2)后的酶活性，野生型最高，缺失型最低，有显著性差异，乙醛代谢法测定转染后ALDH2酶活性P＜0.05。
2.ALDH2腺病毒颗粒对缺氧损伤的抗凋亡作用2.1采用Hoechest 33324法检测细胞凋亡如图6采用Hoechest 33324法检测细胞凋亡示意图所示，经Hoechest 33324染色，转染缺失型ALDH2基因再缺氧的心肌细胞中，核固缩核碎裂现象明显增多。
2.2采用TUNEL法检测细胞凋亡如图7采用TUNEL法检测细胞凋亡示意图所示，经TUNEL-DAB染色，转染缺失型ALDH2基因再缺氧的心肌细胞相对于野生型的凋亡细胞明显增多。
2.3采用流式细胞仪法检测细胞凋亡如图8采用流式细胞仪法检测细胞凋亡示意图所示，经FITC标记的Annexin-V测定，转染缺失型ALDH2基因再缺氧的心肌细胞相对于野生型的凋亡细胞明显增多，*P＜0.01相比于对照组，+P＜0.05相比于缺氧组，++P＜0.001相比于ALDH2*1预处理缺氧组。
酒精的代谢需要人体内的两种酶(乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶)参与。首先乙醇在乙醇脱氢酶的作用下，氧化成乙醛，然后，乙醛又在乙醛脱氢酶的作用下氧化成乙酸，这样就完成了最终的代谢。乙醛具有扩张人体血管的作用。脸红和醉酒，是乙醛在体内停留引起的。不少人缺少第二种酶，就会引起乙醛在体内堆积。
权利要求
1.一种包含有乙醛脱氢酶的解酒药的新用途，用于心脏的保护和心脏病的治疗保健食品或药物。
2.根据权利要求1所述的包含有乙醛脱氢酶的解酒药的新用途，其特征在于所述的解酒药为含有乙醛脱氢酶保健品或药物，包括海王金樽，安体普，或解酒神茶。
3.根据权利要求1或2所述的包含有乙醛脱氢酶的解酒药的新用途，其特征在于所述的心脏病包括冠状动脉粥样硬化性心脏病以及各种心脏病引起的心力衰竭。
全文摘要
本发明公开一种包含有乙醛脱氢酶的解酒药的新用途，用于心脏的保护和心脏病的治疗保健食品或药物，其原理是，解酒药能通过补充ALDH2而减轻心肌缺血/再灌注损伤，该解酒药为含有乙醛脱氢酶保健品或药物，包括海王金樽，安体普，或解酒神茶等，所述的心脏病包括冠状动脉粥样硬化性心脏病以及各种心脏病引起的心力衰竭等。
文档编号A23L1/30GK101091793SQ20071004155
公开日2007年12月26日 申请日期2007年6月1日 优先权日2007年6月1日
发明者葛均波, 孙爱军, 邹云增, 王克强, 俞佳艳, 贾剑国, 徐丹令 申请人:复旦大学附属中山医院