专利名称：：冻干纳豆的生产方法
技术领域：
：本发明涉及食品，具体涉及一种冻干纳豆的生产方法。
背景技术：
：纳豆(Natto)原是日本的传统食品，食用历史已逾千余年。1986年，Sumi,H.在美国芝加哥大学筛选抗血栓药时发现，纳豆含有纳豆激酶(Nattokinase，NK)，能强烈溶解血栓，且口服有效，常食纳豆可预防血栓发生，是現今人们预防血栓最受欢迎的保健食品之一(Sumi"/.Experientia1987,43:1110-11;ActaHaematol1990,84(3):139-43;BiolPharmBull1995,sep;18(9):1194-6)。但纳豆有一股奇臭味，食用时需要拌加芥末和液体调味料(汤包)，以掩盖臭味，增加風味。即便如此，不少人仍不願食用。另外，纳豆保存需要冷藏，携带不便。为此，有人将纳豆烘干，以干纳豆形式供应市场(中国发明专利申请号01105234.1:纳豆保健粉的生产工艺；申请号01131236.x,纳豆口嚼片)。纳豆经烘干后，臭味有所减少，但质地坚硬，咀嚼困难，尤其是纳豆中最重要的保健成份一纳豆激酶会因高温干燥而损失。已知纳豆激酶在60°C以上即会失去其溶栓活性(SurniH.""/:E邓erientia1987,43:1110-11)。迄今，在纳豆生产过程中应用冷冻干燥技术，已有下列报道一"活性纳豆浓縮素的生产工艺"(中国专利申请号03127611.3)，该专利用冷冻干燥保存了纳豆缴酶活性，但它冷冻的是纳豆的浸取液，不是纳豆本身。二"一种纳豆冻干粉的制备方法"(中国专利申请号200510027740.5)，该专利应用的是直径为2-3mm的大豆粉碎物，另需用氯化锰、氯化转、氯化纳等溶液浸泡，发酵、冻干后灌入胶囊应用，并非用整粒冻千纳豆作即食品。三"低能量营養食品冻干纳豆餐包"(中国专利申请号200610013321.0)，该专利产品虽亦是即食品，但它除含有纳豆外，另混有10-40%的谷物、海产品、蔬菜、水果、调味料、辛香料及抗氧化剂等组成分，其成品的形态为方块、圆柱形或异型，亦非用整粒冻干纳豆作即食品。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种既能保持营养成份、又携带方便的纳豆即食食品生产方法。本发明则将纳豆作冷冻干燥(Freeze-drying)处理，制成冻干纳豆。由于冻干纳豆是在低温冰冻条件下干燥的，其溶栓酶--纳豆激酶不会失活。另外，纳豆经冻干后，质地疏松，老年人也能咀嚼食用。本发明在纳豆生产时另添加了调味剂，使冻干纳豆具有咸、鲜、甜等多种風味，可作即食食品，方便食用。同时，糖类、氨基酸和核苷酸等调味料也是纳豆菌的营養成分，在黄豆中添加了这些调味料，促进了纳豆菌的生长，使之产生更多的纳豆激酶。通常，纳豆在保存时水分易散失，需用塑料盒或塑料杯包装。本发明冻干纳豆系干品，不存在水分逸失问题，可用纸杯或纸筒包装，不污染环境。纳豆由黄豆发酵而成。其常规的制作工艺是先将黄豆经浸泡后蒸熟，然后，接种纳豆菌种CBiw7/M(natto)，置37。C下孵育24小时，即可。本发明对纳豆作了冷冻干燥(Freezedrying)处理，即先将纳豆在零下30-40。C预冻，让纳豆中的自由水冻结成冰，然后在低温条件下抽真空，使真空度达1-10帕(PA),这时纳豆中的冰会很快升华，24-48小时后，新鲜纳豆即被加工成冻干纳豆。冻干纳豆的生产工艺如下黄豆浸泡、蒸煮、加调味料、接种纳豆菌、发酵培养、冷冻干燥、冻干纳豆、室温贮存。由本法制得的冻干纳豆，不同与在高温下干燥的烘干纳豆，由于冻干纳豆是在-30-40"温下进行的，因此其纳豆激酶不会失活，经测定冻干纳豆中仍保留着全部的纳豆激酶，仍对血栓具有强烈的酶解活性(見图1)本发明另发現在接种纳豆菌前添加调味料，不会影响纳豆菌的正常发酵，也不会降低纳豆中的溶栓酶的活力从而可制得甜、咸、鮮等多种口味的冻干纳豆。本发明提供了一种冻干纳豆的生产方法，该方法包括下列步骤O)取黄豆，清洗后用2-12倍量w/v的水浸泡10-16小时，浸泡期间换水1-3次；(2)浸泡后的黄豆，沥去浸水，置压力锅内于0.5-1.1Kgf/cm2，蒸煮15-30分种;(3)取纳豆菌种粉加入100-300倍量w/v的水，调匀成悬浮液；(4)在步骤(2)的熟黄豆中均匀拌入调味料甜味剂、鲜味剂或咸味剂及步骤(3)的纳豆菌悬浮液成混合物；纳豆菌悬浮液拌入量以每公斤干黄豆计为150-250ml;(5)步骤(4)的混合物分装于有盖的瓶、缸或盒内，于温度为35-37°C、相对湿度为80-90%下发酵24-30小时；(6)发酵后的纳豆置于干燥真空瓶内，于零下30-4(TC下预冻结6-12小时；(7)预冻结的纳豆于冷冻干燥机上，在真空度为l-10帕(PA)，温度为零下40-60。C，干燥24-72小时，即得冻干纳豆；(8)经溶栓活力测定合格后，分袋、封口、贮存。本发明生产方法所用的黄豆和纳豆菌种CB咖7/船(natto)可以市售得到。生产冻千纳豆添加的甜味剂，可以用葡萄糖、果糖等单糖；海藻糖(Treharose)、三氯蔗糖(Sucralose)等双糖；果寡糖(Fructooligosaccharide)、木寡糖(Xylooligosaccharide)等低聚糖；赤藓糖醇(Erythritol)、木糖醇等糖醇；阿斯巴甜(Aspartame).阿力甜(Alitame)等二肽甜味剂及蛋白糖等复合甜味剂。用量0.5-8%(以干黄豆重量计)。鲜味剂可用谷氨酸纳、门冬氨酸纳等氨基酸；或5'-鸟苷酸、5'-肌苷酸等核苷酸；蘑菇、水产品等动植提取物;及醤油、豆鼓汁等发酵品。常用量以干黄豆重量计的0.5-5%。咸味剂可用氯化纳、氯化钾等，常用量为干黄豆重量计的1-5%。上述调味料可用一种，也可用数种配伍而成，后者能使冻干纳豆富有多种風味。纳豆激酶的活性测定，已有琼脂糖-纤维蛋白平板法(简称平板法)、纤维蛋白块溶解時间法(简称凝块酶解法，CLT法)、血清板法、四肽底物法及酶联免疫吸附法等多种方法，但以平板法和凝块溶解法应用最多(山东轻工业学院学报，第21巻第1期，2007年3月，60-63)。所谓平板法是先将牛纤维蛋白原(Fibrinogen)和牛凝血酶(Thrombin)溶液经混和后制成的人工血栓板，然后滴加纳豆提取液及纳豆激酶(Nattokinase,NK)或尿激酶(Urokinase,UK)或链激酶(Streptokinase,SK)等溶栓酶标准品，然后置37。C下孵育18小时，凡有溶栓活性的，必在其滴加处呈現透明的溶栓圈。在一定浓度下溶栓酶活力越强，溶栓圈越大。(见图1.市售纳豆和冻干纳豆提取物及尿激酶标准溶液(20IU/ml)在人工血栓平板上的溶栓情况，市售纳豆和冻干纳豆呈現相似的溶栓圈。)表1左例，是用平板法测定的市售纳豆和冻干纳豆的溶栓酶效价，市售纳豆(鲜)中的溶栓酶效价(以尿激酶计)为60IU/g，折成干品为153IU/g,而四品不同口味冻干纳豆(实施例1-4)中的溶栓酶效价(以尿激酶计)，分别为266、231、367和244IU/g，可見纳豆经冻干处理后，其溶栓活性不仅不会降低，反而有所增加。凝块酶解法则通过血栓溶解的快慢，来评定溶栓酶的活力。此法是测定尿激酶的标淮方法，已收入中华人民共和药典。(药典2005年版，二部，P.279-280)。标水浴中，然后加入尿激酶标准溶液或纳豆提取液及牛凝血酶和牛纤维蛋白溶酶原的混合溶液，立即摇匀、计时。这時由于凝血酶的作用，牛血纤维蛋白将凝结成块，随后，又由于溶栓酶的作用将凝块分解。当酶解产生的气泡上升至l/2体积时再计時，酶活力越强，酶解時间越短。也可按张菁等的方法[南京大学学报(自然科学)，第37巻第4期，2001年，第416-419頁]，在血纤维蛋白凝结成块时上置玻璃球l粒，以反应开始至玻璃珠因凝块溶解而堕落底部的时间作酶活强度标淮，球堕落時间越短，示溶栓酶话力越强。结果市售纳豆(鲜)中的溶栓酶效价(以尿激酶计)为125IU/g，折成干品为19IU/g，而四品不同風味冻干纳豆中的溶栓酶效价(以尿激酶计)，分别为432、374、528和382IU/g,均髙于市售纳豆(表l右列)。表1.冻干纳豆的溶栓酶活力测定<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>按照本发明生产的冻干纳豆，先前已作了调料，食用时毋需再添加芥末和汤包调味料，食用方便。另外，由于纳豆用冷冻升华法干燥，其剩余水分只有2-5%.故不易质变。生产冻干纳豆的成本虽比生产普通纳豆为高，但冻干纳豆的货架期长，又毋需冷藏，故貯藏和运输成本会大大下降。另外，冻干纳豆已基本无氨臭，质地松脆，携带方便，是理想的旅遊即食食品。现将市售纳豆和本专利的冻干纳豆特性列表比较如下:表2.市售纳豆和冻干纳豆的特性比较<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在零度下貯存的，食用前另需解冻包装用塑料盒或塑料杯包装用纸筒或纸杯包装，友好环境图l冻干纳豆在血栓平板上的溶栓圈比较图中1为尿激酶标准液(20IU)，2为市售纳豆提取物，3-6为冻干纳豆提取图2不同浓度尿激酶在血栓平板上的溶栓圈图中UK5为5IU/ml尿激酶的溶栓圈，UK10为10IU/ml尿激酶的溶栓圈，余类推图3尿激酶标准曲线(平板法)横座标为不同尿激酶浓度的对数值，纵座标为溶栓圈两垂直直径的对数值图4尿激酶标准曲线(凝块酶解法)横座标为不同尿激酶浓度的对数值，纵座标为凝块酶解時间的对数值具体实施例方式实施例一1.取黄豆lKg，淘洗后用12Kg水浸泡12小时，浸泡期间換水l-2次；2.将浸泡后的黄豆，沥去浸水，置压力锅内，在UKg/cm2下蒸煑25分种,要求豆粒熟而不烂；3.取纳豆菌粉(含纳豆菌1010/g以上)lg，加200ml冷开水，调匀成悬浮液；4.在上述步骤2熟黄豆中，均匀拌入30g海藻糖、10g赤鮮糖醇、lg三氯蔗糖及200ml纳豆菌悬浮液；5.然后分装入洁净的玻瓶内，装料厚5cm，瓶口用食品级封口纸包扎；6.置温度为37。C，濕度为90%条件下发酵24小时；7.将发酵成的纳豆，置冷冻干燥真空瓶中，在一30'C下冻结8小时；8.开启VirTis冷冻干燥机，待冷阱温度达-40-3(TC，真空度达1托(torr)以下时，将预冻过的纳豆置于冷冻干燥机上，在低温下继续抽真空48小时，直至纳豆干燥；9.经溶栓活力测定合格后，即可装盒、封口，即得甜味冻干纳豆；10.冻干纳豆中溶栓酶活性可用平板法测定一、血栓平板制备(1)称琼脂糖50mg,加生理盐水5ml，加热使融，然后在5CTC水浴下保温；(2)取牛纤维蛋白原，用pH7.8的巴比妥-氯化钠缓冲液配成2mg/ml的纤维蛋白原溶液5ml;置于小烧杯中；(3)在小烧杯中依次加入牛凝血酶(40BP/ml)溶液125ul和上述在5(TC水浴下保温的琼脂糖溶液，快速混匀，並倒入9cm2的平皿中，放置60min后即得血栓平板。二、样品制备(1)冻干纳豆和烘干纳豆提取液的制备将冻干纳豆和烘干纳豆分别粉碎后，各取2.0g,置于巴比妥-氯化钠缓冲液(pH7.8)50ml中，超声提取30分钟，然后在离心30min(离心力为6941RCF)，取上清液。(2)尿激酶标准液的制备取尿激酶标准品(中国药品生物制品检定所产品，1280IU/支)，用巴比妥-氯化钠缓冲液配成每毫升含5、10、20、40、60和80单位的尿激酶标准溶液(1)精密吸取冻干纳豆和烘干纳豆提取液和不同浓度的尿激酶标准溶液各10ul，滴加在血栓平板上，加盖后，置37下维持18小时，比较测定各样品的溶栓圈大小。(2)精確量取各尿激酶溶栓圈的两个垂直直径，以其乘积的对数为纵坐标，浓度对数为横坐标，制得尿激酶的标准曲线。其回归方程为y=0.4399x+1.7353，r2=0.9959，r二0.998(图2、3)。(3)精確量取冻干纳豆(图l)提取液的溶菌圈直径，以其两垂直径的对数，从尿激酶标准曲线上计算得溶栓酶效价。四、.结果(1)在5-80IU/ml浓度范囲内，尿激酶的溶栓圈直径，随浓度增加而增大。(2)市售纳豆提取物的溶栓圈两垂直直径之积的对数为2.311，按照尿激酶标准曲綫，市售纳豆(鲜品)的溶栓活性为60.3IU/g，折干品后为153.2IU/g。(3)本实施例冻干纳豆提取物的溶栓圈两垂直直径之积的对数为2.443、按照尿激酶标准曲綫,本实施例的溶栓活性为266IU/g，高于市售纳豆。(4)另用本法测定了实施例2、3和4冻干纳豆的酶活性，结果其各自的溶栓圈两垂直直径之积的对数，分别为2.360、2.448和2.369，对照尿激酶标准曲綫，实施例2、3和4冻干纳豆的酶活效价分为231、367和244IU/g，均高于市售纳豆中的酶活效价。实施例二1.取黄豆1000g，淘洗后用水浸泡，至黄豆充分胀泡，增重至2200-2300g为止。2.将浸泡后的黄豆，滤去浸水。然后均匀拌入门冬氨酸纳10g、5'鸟苷酸和肌苷酸(l:l)10g、氯化钠15g;3.置压力锅内，在1.1Kg/cm2压力下蒸煑15-20分种,要求豆粒熟而不烂；4.称纳豆菌1克，悬浮于200ml冷开水中，制成种子液；5.用喷雾器将上述种子液，均匀地喷入熟黄豆中，边喷边拌；6.将接种了纳豆菌的熟黄豆，分装入洁净的塘瓷盘内，料厚5-7cm，加盖后置37'C下发酵24小时；7.将发酵成的纳豆置于冷冻干燥真空瓶中，在一3(TC下冻结12小时；8.开启VirTis冷冻干燥机，待冷阱温度达-40'C，真空度达1托(torr)时，将上述预冻过纳豆置于冷冻干燥机上，然后在低温下继续抽真空48小时，直至纳豆干燥；9.将经冷冻干燥的纳豆作溶栓酶活力测定，合格后，即可分装干纸筒中，成为咸鮮味的冻干纳豆。10.冻干纳豆中的溶栓酶活力测定，也可用凝块酶解法测定(1).试剂配制牛纤维蛋白原溶液取牛纤维蛋白原，加巴比妥-氯化钠缓冲液(pH7.8)配成每lml中含6.67mg可凝结蛋白的溶液。牛凝血酶溶液取牛凝血酶，加巴比妥-氯化钠缓冲液(pH7.8)配成每毫升会6.0单位的溶液。牛纤维蛋白溶酶原溶液取牛纤维蛋白溶酶原，加三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH9.0)配成每毫升含1.2酪蛋白单位的溶液。混合溶液临用前取10ml的牛凝血酶溶液和10ml牛纤维蛋白溶酶原溶液，混匀。(2).标准品溶液的制备取尿激酶标准品，加巴比妥-氯化钠缓冲液1.21111，制成60IU/ml的溶液。(3).供试品溶液的制备取冻干纳豆提取物加巴比妥-氯化钠缓冲液(pH7.8)适量，超声20分钟，加巴比妥-氯化钠缓冲液(pH7.8)至刻度，摇匀，制成10mg/ml的溶液，8000r/min离心30min，吸取上层液，即得。(4).标准曲线的制作取试管4支，各加牛纤维蛋白原溶液0.3ml，置37'C士0.rC水浴中，分别加入巴比妥-氯化钠缓冲液(pH7.8)0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml，依次加尿激酶标准品溶液0.4ml、0.3ml、0.2ml、O.lml，再分别加混合溶液0.4ml，摇匀，分别记时。反应系统在1分钟凝结，2分钟后将玻璃珠加于凝结块上，以玻璃珠落到试管底部为反应终点，记时。以尿激酶浓度的对数为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标，制作标准曲线。(5).供试品溶液的效价测定供试品溶液按上法测定，在标准曲线上求得单位效价，计算出每lmg供试品的效价单位(6).结果a.尿激酶6、12、18、24IU/g的凝块酶解反应時间分别为14.5、10.2、8.1和7.0分钟，其反应时间的对数分别为1.2、1.0、0.9禾B0.8。求回归方程y=-0.5265x+1.715,R2=0.9993，产0.9996(图4)。b.冻干纳豆提取物中纳豆激酶的活性按上述尿激酶标准曲线，本实施例冻干纳豆的凝块酶解時间为72分，经计算，其效价为374IU/g;而市售纳豆(鲜品)的凝块酶解時间为10.2分,效价为125IU/g，折干后的效价为319IU/g，冻干纳豆和市售的纳豆(以干品计)的溶栓活性相差无几。c.另用本法测定了实施例l、3和4冻干纳豆的凝块酶解時间，並对照尿激酶标淮曲綫(凝块酶解法)，计算得实施例1、3和4的溶栓酶效价为432、528和382IU/g，均髙于市售纳豆(折干)的效价，凝块酶解法的测定进一步证实纳豆经本专利技术冻干后，其溶栓酶活性不仅不损失，反而有明显提髙。实施例三1.取黄豆lKg，用水浸泡，直至黄豆不再吸水，豆重增至2.2Kg为止；2.取纳豆菌粉(含纳豆菌1010/g以上)lg，加250ml冷开水，调勺成悬浮液;3.将浸泡后的黄豆，沥除浸水。然后均匀拌入干贝素(干贝提取物)100g,氯化纳30g，门冬氨酸纳30g,海藻糖30g，蛋白糖10g;4.置压力锅内，在1.1Kg/cm2下蒸煑25分种；5.取纳豆菌液(每毫升含纳豆菌108以上)200ml;拌入刚蒸煑过的熟黄豆中；6.将接种了纳豆菌的蒸熟黄豆，分装入洁净盛盘内，装料厚7cm，加盖或封后置37"C下发酵24小时；7.将发酵成的纳豆置冷冻干燥真空瓶中，在一3(TC下冻结10小时；8.开启VirTis冷冻干燥机，待冷阱温度达-40-30。C,待真空度达1托(torr)以下时，将上述预冻过纳豆置冷冻干燥上，在低温下继续抽真空60小时，直至纳豆干燥;9.将冻干纳豆分装入纸筒中，封口装盒后即为海鲜味冻干纳豆。实施例四1.取黄豆1Kg，用3.0L调味液在4'C下浸泡12小時，3.0调味液由下例组成分组成蛋白糖10g,海藻糖300g，赤鲜糖醇100g;2.取纳豆菌粉(含纳豆菌101()/g以上)lg,加250ml冷开水，调勺成悬浮液；3.将浸泡后的黄豆，沥除多余浸水，置压力锅内，在l.lKg/cm2下蒸煑25分种；4.将上述纳豆菌液拌入刚蒸煑过的熟黄豆中；5.将接种了纳豆菌的蒸熟黄豆，分装入洁净盛盘内，装料厚7cm，加盖后置37'C下发酵24小时；6.将发酵成的纳豆置冷冻干燥真空瓶中，在一30'C下冻结IO小时；7.开启VirTis冷冻干燥机，待冷阱温度达-40-30。C，待真空度达1托(torr)以下时，将上述预冻过纳豆置冷冻干燥上，在低温下继续抽真空60小时，直至纳豆干燥；8.将冻干纳豆经溶栓酶检验合格后，分装入纸筒中，封口、装盒，即得。权利要求1、一种冻干纳豆的生产方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)取黄豆，清洗后用2-12倍量w/v的水浸泡10-16小时，浸泡期间换水l-3次；(2)浸泡后的黄豆，沥去浸水，置压力锅内于0.5-1.1Kgf/cm2，蒸煮15-30分种；(3)取纳豆菌粉加入150-300倍量w/v的水，调匀成悬浮液；(4)在步骤(2)的熟黄豆中均匀拌入调味料甜味剂、鲜味剂或咸味剂以及步骤(3)的纳豆菌种悬浮液成为混合物；纳豆菌悬浮液拌入量以每公斤干黄豆计为150-250ml;(5)步骤(4)的混合物分装于有盖的瓶、缸或盒内，于温度为35-37°C、相对湿度为80-90%下发酵24-30小时，得到发酵的纳豆；(6)发酵后的纳豆置于干燥真空瓶内，于零下30-4(TC下预冻结6-12小时；(7)预冻结的纳豆于冷冻干燥机上，在真空度为1-10帕，温度为零下40-60'C,干燥24-72小时，即得冻干纳豆；(8)经溶栓酶活力测定合格后，分袋、封口、贮存。2、根据权利要求1所述的一种冻干纳豆的生产方法，其特征在于其中所述调味料中的甜味剂为葡萄糖、果糖、海藻糖、三氯蔗糖、果寡糖或木寡糖；赤藓糖醇或木糖醇；阿斯巴甜或阿力甜或蛋白糖，用量为以干黄豆重量计的0.5-8%。3、根据权利要求1所述的一种冻干纳豆的生产方法，其特征在于其中所述调味料中的鲜味剂为谷氨酸纳、门冬氨酸纳、5'-鸟苷酸、5'-肌苷酸；蘑燕或水产品动植提取物;醤油或豆鼓汁，用量为干黄豆重量计的0.5-5%。4、根据权利要求1所述的一种冻干纳豆的生产方法，其特征在于其中所述调味料中的咸味剂为氯化纳或氯化钾，用量为干黄豆重量计的1-5%。5、根据权利要求1所述的一种冻干纳豆的生产方法，其特征在于其中所述调味料中的甜味剂、鲜味剂或咸味剂，在使用时可以选择它们中的一种或多种混合物。全文摘要本发明提供了一种冻干纳豆的生产方法。本发明生产方法包括黄豆浸泡、蒸煮、调味、发酵、预冷冻、真空冷冻干燥等步骤。本发明的冻干纳豆是在低温冰冻条件下干燥的，其溶栓酶—纳豆激酶不会失活，在纳豆生产时添加调味剂，使冻干纳豆具有咸、鲜、甜等多种风味，还能促进纳豆菌的生长，使之产生更多的纳豆激酶。另外，纳豆经冻干后，质地疏松，可作即食食品，老年人也能咀嚼食用方便。冻干纳豆系干品，可用纸杯或纸筒包装，不污染环境。文档编号A23L1/29GK101120762SQ20071004611公开日2008年2月13日申请日期2007年9月19日优先权日2007年9月19日发明者冯慧琴,杨庆尧,杨晓彤,可糜申请人:上海师范大学