专利名称：：利用重组大肠杆菌高效生产丙酮酸氧化酶的培养基的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物工程领域，更具体地，本发明涉及重组大肠杆菌高效表达丙酮酸氧化酶的发酵培养基，以及利用所述的培养基生产丙酮酸氧化酶的方法。
背景技术：
：丙酮酸氧化酶(Pyruvateoxidase,EC1.2.3.3)是一种非常重要的临床诊断用酶，其最重要的应用是用于血液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活力测定；此外还可以用于丙酮酸测定、丙酮酸激酶活性测定等。目前商业化生产的丙酮酸氧化酶主要来源于野生型植物乳杆菌，酶产量较低，仅有约120U/L。尽管现有技术中已经出现了利用重组法表达丙酮酸氧化酶的方法，采用的重组菌株例如大肠杆菌五.co/ZDH5o/pSMLPyOD;然而，目前的重组法生产丙酮酸氧化酶的产量还不够高，一些方面的生产条件还需要进行优化。因此，本领域迫切需要开发高产丙酮酸氧化酶的方法，并且进一步改进发酵培养基，提高产酶水平也显得十分紧迫。
发明内容本发明的目的在于提供一种生产丙酮酸氧化酶的方法。本发明的另一目的在于提供一种特别适合于生产丙酮酸氧化酶的培养基。在本发明的第一方面，提供一种用于培养大肠杆菌的培养基，所述的培养基含有碳源、氮源、磷源、无机盐，所述的大肠杆菌中含有表达载体，所述的表达载体中含有丙酮酸氧化酶的表达盒；其中，所述的培养基中碳源90%以上是甘油。在另一优选例中，所述的表达盒含有与启动子操作性相连的丙酮酸氧化酶基因。在另一优选例中，所述的培养基中碳源95%以上是甘油；更优选的，所述的培养基中碳源98%以上是甘油。在另一优选例中，所述的大肠杆菌是五.co"'DH5o/pSMLPyOD。在另一优选例中，所述的培养基用于发酵生产丙酮酸氧化酶。在另一优选例中，所述的氮源选自蛋白胨，酵母提取物，硫酸铵或它们的组合。在另一优选例中，所述的磷源是磷酸盐。在另一优选例中，所述的无机盐选自氯化钠，硫酸镁或它们的组合。在另一优选例中，所述的培养基的碳源是甘油。在另一优选例中，所述的培养基含有甘油蛋白胨酵母提取物硫酸铵硫酸镁磷酸盐氯化钠6-18ml/L;12-20g/L;10-16g/L;3-7g/LMg/L4-8g/L6-15g/L在另一优选例中，所述的培养基含有:甘油蛋白胨酵母提取物硫酸铵硫酸镁磷酸盐氯化钠8-16ml/L12-16g/L10-12g/L4-6g/L2-3g/L5-7g/L8-12g/L。在另一优选例中，所述的磷酸盐是复合磷酸盐，其中，K2HP04:Na2HP04:KH2P04=1:2:1。在另一优选例中，所述的培养基中还含有微量元素1-2.2ml/L(优选的是1.25-2ml/L);其中所述的微量元素含有:FeS04.7H2012.8±3g/L;ZnS04'7H202.84±1g/L;CuS045H201.6±0.5g/L;MnS04-H203.2±1g/L;CaCl20.28±0.08g/L;CoCl26H201.6±0.5g/L;H3B040.24±0.08g/L;Na2Mo0412.8±3g/L;和KI0.16±0.05g/L。在另一优选例中，所述的培养基由甘油、蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、硫酸镁、磷酸盐、微量元素、氯化钠组成。在另一优选例中，所述的大肠杆菌是五.co/ZDH5WpSMLPyOD。在本发明的第二方面，提供所述的培养基的用途，用于培养大肠杆菌，发酵生产丙酮酸氧化酶；其中，所述的大肠杆菌中含有表达载体，所述的表达载体中含有丙酮酸氧化酶的表达盒。在本发明的第三方面，提供一种生产丙酮酸氧化酶的方法，所述方法包括步骤(1)利用所述的培养基培养大肠杆菌，获得培养产物；其中，所述的大肠杆菌中含有表达载体，所述的表达载体中含有丙酮酸氧化酶的表达盒；(2)从步骤(1)获得的培养产物中分离获得丙酮酸氧化酶。在另一优选例中，在步骤(1)中，培养时间是12-20小时；或者培养的温度是28-37°C。在另一优选例中，所述的大肠杆菌是五.co/ZDH5o/pSMLPyOD。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，发现在丙酮酸氧化酶的发酵生产过程中，发酵培养基的成份是影响发酵产量的关键因素，而在培养基中利用甘油作为碳源，可极大地提高丙酮酸氧化酶的产量，并且在整个发酵过程中pH值稳定，发酵时间短。在此基础上完成了本发明。培养基本发明人在研究中发现，葡萄糖代谢产物乙酸对大肠杆菌的生长有明显的抑制作用，另外，以葡萄糖作为碳源时，重组菌在生长过程前期不表达目的产物丙酮酸氧化酶，只有在生长后期，碳源消耗殆尽时才开始表达，而该阶段细胞生理活性己经下降，产酶水平很难提高。经过反复的试验，本发明人发现，以甘油为碳源的培养基，可克服葡萄糖对丙酮酸氧化酶生产菌株的抑制作用，同时使得重组细胞的质粒稳定性大大提高。此外，采用该培养基能够使发酵液pH在发酵全过程稳定在6.8-7.2之间，这使得整个发酵过程省去了pH控制环节，发酵工艺大大简化。并且，采用本发明提供的发酵培养基，能够使得丙酮酸氧化酶生产菌株在发酵全过程持续表达丙酮酸氧化酶，使得批发酵时间縮短至约16-20小时之间，丙酮酸氧化酶的发酵单位也大大提高，进一步体现了基因重组技术在丙酮酸氧化酶生产中的优势。碳源是指能提供微生物营养所需碳元素的营养源。本发明的培养基中主要以甘油(占碳源的90%以上)作为碳源。作为本发明的优选方式，所述的培养基的以甘油作为唯一的碳源。作为本发明的优选方式，甘油在培养基中的含量是6-18ml/L;进一步优选的是8-16ml/L。上述用量中，所述的甘油含量以纯甘油计。此外，所述培养基中还含有氮源、磷源、无机盐或微量元素等成分。氮源是指能提供微生物营养所需氮元素的营养源。无机盐是行使构成菌体成分、酶活性基组成或维持酶活性、调节渗透压、pH等的成份。作为本发明的优选方式，所述的培养基中含有的氮源、磷源、无机盐或微量元素如表1所列。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>作为本发明的优选方式，所述的磷酸盐可选自K2HP04、Na2HP04、KH2P04、或它们的组合。更优选的，所述的磷酸盐是复合磷酸盐，其中含有K2HP04、Na2HPOjnKH2P04。进一步优选的，所述复合磷酸盐中，K2HP04:Na2HP04:KH2P04=1:2:1。作为本发明的优选方式，所述的微量元素的成分如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>作为本发明的优选方式，所述的培养基由甘油、蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、硫酸镁、磷酸盐、微量元素、氯化钠组成。经本发明人优化后的培养基配方，它含有足够的营养成份，既能满足摇瓶实验的需要，又能成功地将摇瓶发酵结果放大到发酵罐。在本发明的实施例中，所述培养基与不以甘油作为主要碳源的培养基相比，丙酮酸氧化酶的产量大大提高，并且发酵时间很短。本发明的培养基适用于不同规模的丙酮酸氧化酶生产菌的培养或发酵，包括(但不限于)用于进行发酵生产丙酮酸氧化酶的摇瓶培养；或大规模发酵生产丙酮酸氧化酶。培养方法
技术领域：
：本发明还提供了利用所述的培养基生产丙酮酸氧化酶的方法，所述方法包括步骤(1)利用所述的培养基培养可表达丙酮酸氧化酶的重组大肠杆菌，获得培养产物；(2)从步骤(1)获得的培养产物中分离获得丙酮酸氧化酶。作为本发明的优选方式，在步骤(1)中，培养时间是12-20小时；或者培养的温度是28-37"C。可用于生产丙酮酸氧化酶的重组大肠杆菌中含有至少一个表达载体(质粒)，并且，所述的表达载体中含有丙酮酸氧化酶的表达盒。所述的表达盒含有与启动子操作性相连的丙酮酸氧化酶基因，本领域人员了解如何在适当的表达载体中构建可表达丙酮酸氧化酶的基因表达盒D在本发明中，对用于表达丙酮酸氧化酶的表达载体没有限制，可以是任何适于转化进入大肠杆菌并且表达丙酮酸氧化酶的组成型表达载体。优选的表达载体是pSML。可采用常规的技术，将丙酮酸氧化酶基因克隆入表达载体的多克隆位点中，构建含有丙酮酸氧化酶表达盒的重组表达载体；再通过常规方法，将重组表达载体转化宿主菌。在本发明的一种优选方式中，使用的重组大肠杆菌是五.co/z'DH5a/pSMLPyOD。本发明的主要优点在于(1)首次发现在生产丙酮酸氧化酶时利用甘油作为碳源，能够使得重组大肠杆菌在发酵全过程持续表达丙酮酸氧化酶，发酵单位大大提高，因而极大地提高了丙酮酸氧化酶的产量。并且，采用本发明的培养基进行发酵，重组细胞的质粒稳定性大大提高。(2)采用本发明的培养基进行发酵，在整个发酵过程中pH值稳定在6.8-7.2之间，无需额外控制pH值，发酵工艺大大简化。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1五.o//DH5a/pSMLPyOD的构建从绿色气球菌(』eracoccMATCC10400基因组中扩增得到丙酮酸氧化酶基因。上游引物(SEQIDNO:1):AATTAACATC-3'(划线部分为Ncol酶切位点，同时添加对应9个氨基酸残基MGMHHHHHH(SEQIDNO:3)的核苷酸序列，可用于Ni亲和层析)；下游引物(SEQIDNO:2)(划线部分为BamHI酶切位点》以爿erococctwWnWfl/wATCC10400基因组为模板，采用以上引物对，PCR扩增得到Jv尸少OZ)基因，鉴定PCR扩增产物，经鉴定获得序列正确的JW^(9Z)扩增产物。常规方法纯化该PCR扩增产物。用限制性内切酶Ncol和BamHI酶切上述PCR扩增产物，将酶切后的产物连接入经过NcoI和BglII酶切的质粒pSML104(购自中国科学院生化细胞所)中，获得重组表达质粒pSMLPyOD。采用常规的方法，将重组质粒pSMLPyOD转化E.coliDH5a感受态细胞。由于转化有重组表达质粒pSMLPyOD的目的转化子表达丙酮酸氧化酶，丙酮酸氧化酶催化丙酮酸产生过氧化氢，过氧化氢从菌体细胞渗透到胞外，在辣根过氧化物酶的酶催化下，过氧化氢与联大茴香胺作用产生棕褐色色素物质，从而使阳性转化子形成棕褐色的菌落。因此，将上述转化后的细胞在含四环素的选择性指示平板上生长的菌落置4'C显色，具有四环素抗性又呈现棕褐色的菌落即为含有表达质粒pSMLPyOD的细胞，经验证该重组细胞能够组成型表达丙酮酸氧化酶。实施例2培养基的配制所述的培养基的几种配方见表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>其中，微量元素母液的组成为FeS04'7H2012.8g/L;ZnS04'7H202.84g/L;CuS04'5H201.6g/L;MnS04'H203.2g/L;CaCl20.28g/L;CoCl2.6H201.6g/L;H3B040.24g/L;Na2Mo0412.8g/L;KI0.16g/L。复合磷酸盐为K2HP04、Na2HPOjPKH2P04，且它们的比例是K2HP04:Na2HP04:KH2P04=l:2:1。实施例3采用发酵培养基2摇瓶培养丙酮酸氧化酶发酵培养基l:配方如实施例2中培养基1，pH7。将硫酸镁以外的其它组分按照所述浓度混合，以30ml/瓶装入250ml摇瓶中，经121。C,.20分钟灭菌，冷却。将硫酸镁分开灭菌(过滤除菌法灭菌)，接种前按照所述浓度加入。甘油管保存的五.co//DH5a/pSMLPyOD按1%接种量接入盛有100mlLB培养基(含50mg/L四环素)的500ml摇瓶，37°C，220RPM培养过夜后，按10%接种量接入上述发酵培养基摇瓶，37°C，220RPM培养12小时后，将发酵温度降至30。C，继续培养至16小时左右发酵终了，经检测，此时发酵液中丙酮酸氧化酶活性达到1100U/L。实施例4采用发酵培养基1发酵生产丙酮酸氧化酶发酵培养基2:配方如实施例2中培养基1，pH7.2。将硫酸镁以外的其它组分按照所述浓度混合，3升上述培养基加入5升发酵罐后，经12rC、15分钟灭菌，冷却。将硫酸镁分开灭菌(过滤除菌法灭菌)，接种前按照所述浓度加入。种子同实施例l，按10%接种量接入上述5升发酵罐，32'C发酵培养，初始搅拌转速200RPM，通气量5L/Min，进入对数生长期后，通过调整搅拌转速和通气量将DO控制在30。/。以上。14小时左右发酵终了，经检测，此时发酵液中丙酮酸氧化酶活性达到1300U/L。实施例5采用以葡萄糖为碳源的培养基发酵生产丙酮酸氧化酶发酵培养基3(/L):配方见表4，pH7。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>其中，微量元素母液的组成为FeS04'7H2012.8g/L;ZnS04'7H202.84g/L;CuS04.5H201.6g/L;MnS04'H203.2g/L;CaCl20.28g/L;CoCl2'6H201.6g/L;H3B040.24g/L;Na2Mo0412.8g/L;KI0.16g/L。复合磷酸盐为.-K2HP04、Na2HPCX^PKH2P04，且它们的比例是K2HP04:Na2HP04:KH2P04=1:2:1。将硫酸镁和葡萄糖以外的其它组分按照所述浓度混合，以100ml/瓶装入500ml摇瓶，经121'C，20分钟灭菌。硫酸镁和葡萄糖单另灭菌，接种前按照所述浓度加入。甘油管保存的co/iDH5a/pSMLPyOD按1%接种量接入盛有100mlLB培养基(含50mg/L四环素)的500ml摇瓶，37°C，220RPM培养过夜后，按10%接种量接入上述发酵培养基摇瓶，37°C，220RPM培养12小时后，将发酵温度降至3(TC，继续培养至16小时左右发酵终了，此时发酵液中基本未检测到丙酮酸氧化酶活性。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110〉华东理工大学<120〉利用重组大肠杆菌高效生产丙酮酸氧化酶的培养基<130>076428<160>3<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉54〈212>DNA<213>人工序列<220><221〉misc—feature<223>引物<400>1catgccatgggaatgcatcaccatcaccatcactcagataacaaaattaacatc54<210>2<211〉45<212〉DNA<213>人工序列<220><221>raise—feature<223〉引物<400〉2cgcggatccttatcatttgatgtatttagattctaagccttcagc45<210〉3<211〉9<212〉PRT<213>人工序列<220〉<221〉MISC—FEATURE<223>肽<400〉3MetGlyMetHisHisHisHisHisHis1权利要求1.一种用于培养大肠杆菌的培养基，所述的培养基含有碳源、氮源、磷源、无机盐；所述的大肠杆菌中含有表达载体，所述的表达载体中含有丙酮酸氧化酶的表达盒；其特征在于，所述的培养基中碳源90％以上是甘油。2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的培养基的碳源是甘油。3.如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述的培养基含有甘油6-18ml/L;蛋白胨12-20g/L;酵母提取物10-16g/L;硫酸铵3-7g/L;硫酸镁1-4g/L;磷酸盐4-8g/L;氯化钠6-15g/L。4.如权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述的磷酸盐是复合磷酸盐，其中，K2HP04:Na2HP04:KH2P04=1:2:1。5.如权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述的培养基中还含有微量元素1-2.2ml/L;其中所述的微量元素含有FeS04.7H2012.8士3g/L;ZnS04-7H202.84±1g/L;CuS045H201.6±0.5g/L;MnS04H203.2±1g/L;CaCl20.28±0.08g/L;CoCl26H201.6±0.5g/L;H3B040.24±0.08g/L;Na2Mo0412.8±3g/L;和KI0.16±0.05g/L。6.如权利要求l所述的培养基，其特征在于，所述的大肠杆菌是EDH5a/pSMLPyOD。7.权利要求1所述的培养基的用途，其特征在于，用于培养大肠杆菌，发酵生产丙酮酸氧化酶；其中，所述的大肠杆菌中含有表达载体，所述的表达载体中含有丙酮酸氧化酶的表达盒。8.—种生产丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(1)利用权利要求1所述的培养基培养大肠杆菌，获得培养产物；其中，所述的大肠杆菌中含有表达载体，所述的表达载体中含有丙酮酸氧化酶的表达合.XOL，(2)从步骤(1)获得的培养产物中分离获得丙酮酸氧化酶。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，培养时间是12-20小时；或者培养的温度是28-37'C。10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的大肠杆菌是五.co/ZDH5a/pSMLPyOD。全文摘要本发明属于生物工程领域，提供一种培养基，所述的培养基主要以甘油为碳源。本发明还提供了一种利用所述培养基生产丙酮酸氧化酶的方法。本发明首次揭示在生产丙酮酸氧化酶时利用甘油作为碳源，能够使得重组大肠杆菌在发酵全过程持续表达丙酮酸氧化酶，极大地提高了丙酮酸氧化酶的产量；并且，采用本发明的培养基进行发酵，在整个发酵过程中pH值稳定，发酵工艺大大简化。文档编号C12N1/21GK101182486SQ200710047750公开日2008年5月21日申请日期2007年11月2日优先权日2007年11月2日发明者炬储,庄英萍,张嗣良,王永红,袁中一,劼赵申请人:华东理工大学