专利名称：鸡白细胞介素16基因及其真核表达质粒构建及免疫效应的制作方法
鸡白细胞介素16基因及其真核表达质粒构建及免疫效应[技术领域]本发明涉及动物医药生物工程领域，是一种鸡白细胞介素16基因及其真核 表达质粒与应用。[背景技术]细胞因子作为机体内细胞之间相互作用的主要介质，在机体的免疫应答、 炎症反应、造血功能、胚胎发育及机体的生长发育等各个方面都起重要作用。20世纪80年 代以来，随着细胞因子的研究进展，人们逐渐认识到细胞因子的免疫增强作用。细胞因子对 免疫细胞的分化和增殖、抗原的识别和提呈、抗体的产生和调节、免疫细胞之间的联络等一 系列从识别到效应的免疫应答过程都有极其重要的作用。可以说细胞因子对于免疫系统就如 激素对于内分泌系统，神经递质对神经系统一样重要。细胞因子控制着疫苗免疫和病原微生 物感染机体后免疫应答的类型和方向，其对免疫应答的调节方式最为接近机体正常的调节机 理，细胞因子作为疫苗增强剂具有其他佐剂无法比拟的优点。白细胞介素16(Interleukin-16， IL-16)，是1982年由Cruikshank实验室从抗原刺激的单 核细胞中分离提纯的，IL-16前体主要来源于外周血单核细胞由631个氨基酸构成，无生物学 活性，被白介素ie转化酶在Asp510和Ser 511位酶切后，形成121个氨基酸大小的C端分泌性 IL-16，它以非共价方式结合为四聚体结构，并具有了生物学活性。同时抑制人类和动物获得 性免疫缺陷病毒在CD4+T细胞的复制从而达到阻滞HIV感染的目的。巩艳等采用基因工程技术 重组的IL-16使Jurkat细胞表面IL-2R的表达水平上调18.54M，刺激了T淋巴细胞活化，即 rIL-16具有活化T淋巴细胞的生物学活性。已知有多种细胞能产生IL-16包括CD4+和CD8+T细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状 细胞和非免疫细胞的气道上皮细胞等。IL-16是CD4+T细胞的趋化因子，IL-16通过和CD4分子 相互作用选择性地产生对CD4+细胞的趋化作用。它能上调细胞IL-2R的表达水平，因此可诱 导对IL-2和IL-15依赖的细胞的扩增。研究表明，IL-16对Thl和Th2可能具有不同的作用。IL-16 可诱导炎症部位的Thl细胞的迁移、聚集和激活，抑制某些Th2细胞因子IL-13、 IL-5的产生。IL-16也是CD4+T细胞的一种剌激生长因子，能诱导细胞由G。期进入Gi期，但不能诱导 细胞分裂。对CD4+T细胞、单核/巨噬细胞和嗜酸粒细胞有化学趋化和免疫调节作用，诱导 IL-2R的表达。IL-16可诱导GM-CSF、TNFa和IL-6等细胞因子的合成和释放。最早的鸡IL-16 克隆及鉴定的报道来自于Min.W等(2004)，他们在艾美球虫感染鸡的肠上皮内淋巴细胞的 EST cDNA文库中克隆出IL-16的ORF后，通过Northern blot研究了各组织中IL-16的转录， 发现鸡IL-16的转录仅在淋巴组织中能检测到。将IL-16基因在COS-7细胞中表达，并证明 IL-16具有对脾淋巴细胞的诱导活性，因此，IL-16是具有较好应用前景的免疫佐剂。[具体实施方式
]1. 本发明使用的真核表达载体pcDNA3.1 (+)为Invitrogen公司的产品。鸡白细胞介素16 基因的重组质粒PCIL-16为四川大学动物疾病防控生物工程研究中心克隆并保存。使用的限 制性内切酶BamH I、 EcoR V, T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶等均购自成都天泰生命科技 有限公司。2. 引物是根据Genbank上已发表的IL-16序列(Y15006)和真核表达载体pcDNA3. 1 (+)上的 酶切位点设计并合成的，并在基因上下游分别引入酶切位点BamHI和EcoR V。引物序列为上游引物5'- ATAGG,'CATGAGCGAAGACAACAGCCAG -3 ， 下游引物5'- GCGG^7X77STTACAAAGTTTCAGATGCCTTT -3，3. 鸡白细胞介素16基因的PCR获取，以PCIL-16质粒为模板，加入Taq DNA聚合酶、上下 游引物、dNTP进行扩增反应。PCR的反应体系为10Xbuffer 5uL， 4XdNTPmix (2. 5画1/L) 4uL，上、下游引物(20umol/L)各1 y L， Mgcl2 4yL， PUCIL18质粒1 n L， ddH20 33.5 iiL， Taq酶(5u/nL) 0.5uL。反应参数为95。C处理5min，然后94。Clmin、 55。Clmin、 72'C2min，共31个循环，72'C延伸10rain。 PCR产物在2. 0%琼脂糖凝胶电泳观察，可见约为 1. 8kb的扩增条带，大小与预期的结果一致。鸡白细胞介素16的基因序列4.鸡白细胞介素16基因真核表达质粒pDNAIL-16的构建，将鸡白细胞介素16基因的PCR产 物用酚氯仿抽提纯化，乙醇沉淀，干燥后用TE溶解。鸡白细胞介素16基因的PCR纯化产物 用BamHI、 EcoRV进行双酶切处理，胶回收1. 8kb的条带。以同样的方法对pcDNA3. 1 (+)质粒 进行双酶切处理，胶回收5.4kb左右DNA片段。分别取5 u L双酶切后胶回收的鸡白细胞介素16基因片段，加入10xT4 DNA Ligase buffer luL， T4DNA连接酶luL，酶切处理载体pcDNA3.1 (+) 1 u L， ddH202uL， 16。C连接18小 时。将连接产物转化DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37。C培养。5. 鸡白细胞介素16基因真核表达质粒pDNAIL-16的双酶切鉴定，在含有氨苄青霉素的LB平 板上挑取单个菌落，抽提质粒DNA进行双酶切鉴定。将鸡白细胞介素16基因真核表达质粒 pDNAIL-16分别用BamHI、 EcoRV进行双酶切，酶切产物在0. 8%琼脂糖凝胶电泳观察，PCIL18 双酶切后产生约为5. 4kb和1. 8kb左右的两条带，证明己经成功构建了鸡白细胞介素18基因 真核表达质粒pDNAIL-16。6. 鸡白细胞介素16基因真核表达质粒pDNAIL-16的PCR鉴定，在含有氨苄青霉素的LB平板 上挑取单个菌落，抽提质粒DNA进行PCR鉴定。以pDNAIL-16质粒为模板，加入Taq DNA聚 合酶、上下游引物、dNTP进行扩增反应。PCR的反应体系为10Xbuffer 5uL， 4XdNTPmix(2. 5mmol/L) 4yL，上、下游引物(20umol/L)各1 u L， Mgcl2 4uL， PCIL18质粒luL， ddH20 33.5pL， Taq酶(5u/uL) 0.5uL。反应参数为95。C处理5min，然后94。Clmin、 55。Clmin、 72。C2min，共31个循环，72。C延伸10min。 PCR产物在2. 0%琼脂糖凝胶电泳观察， 可见约为1.8kb的扩增条带，证明已经成功构建了鸡白细胞介素16基因真核表达质粒 p腿IL-16。7. 鸡白细胞介素16基因真核质粒pDNAIL-16的研制。从LB固体培养基中挑取单菌落，接种 于盛有10ml液体培养基的三角瓶中，37。C震荡过夜培养。在1000ml的三角瓶中加入100ml 的发酵培养基，接入5ml的菌种，37°C， 200rpm/min，培养20h.。用常规提取质粒的碱裂 解方法进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附方法进行纯化。电泳鉴定质粒的纯度和含量。质 粒用PBS缓冲液稀释到lmg/ml，即为鸡白细胞介素16基因分子佐剂pDNAIL-16。该分子佐剂 与DNA疫苗混合，质脂体包裹后用肌肉注射的方法进行预防接种。8.用该分子佐剂与禽传染性支气管炎DNA疫苗联合应用，免疫SPF鸡，通过检测血清IBV 特异性抗体、CD4+、 CD8+、 CD3+T淋巴细胞百分含量来检测其对禽传染性支气管炎DNA疫苗的 免疫增强作用。将2日龄健康SPF雏鸡140只，随机分成7个组，每组20只，分别用PBS液(0. 2ml)、IBV灭活疫苗(0.2ml)、 IBV弱毒疫苗(0.2ml)、 pcDNA3. 1 (150ug)、 IBVDNA疫苗(150ug)、)、 IBV DNA疫苗+pDNAIL-16 (150ug+50ug)进行免疫，于免疫后7、 14、 21、 28、 35天，随机取5只颈静脉釆血，分离血清。采用间接ELISA法检测血清IBV特异性抗体； 同时采取抗凝血分离淋巴细胞，用流式细胞仪进行淋巴细胞亚类CD4+、 CD8+、 CD3+T淋巴细胞 百分含量的测定，于免疫后35天用IBV强毒进行攻毒保护实验。测定结果发现，pDNAIL-16+DNA 组血清IBV特异性抗体水平在免疫后14天与弱毒苗组、灭活苗组比较出现差异极显著，21天达 到其最高峰值，与所有实验组比较出现差异极显著，28天时与DNA疫苗组比较无明显差异， 与pcDNA3.1组、pDNAIL-16组、灭活苗组和弱毒苗组比较出现差异极显著；测定CD3+T淋巴 细胞结果表明，在免疫后21天pDNAIL-16+IBVDNA组和与DNA疫苗组比较差异显著，与其 它实验组比较均出现差异极显著，28天与灭活苗组、弱毒苗和PBS苗组比较出现差异极显著； 研究CD4+结果表明，免疫后7天pDNAIL-16+IBVDNA组和pcDNA3.1组、灭活苗组、弱毒苗组 和PBS苗组比较差异极显著，在免疫后14天，与pDNAIL-16组比较差异显著，与其它实验组 比较差异极显著，在免疫后28天与灭活苗组差异显著，与pcDNA3.1组、弱毒苗组和PBS苗组 差异极显著，在免疫35天与pDNAIL-16组差异显著，且与灭活苗组、PBS苗组和弱毒苗组差 异极显著；研究CD8+结果表明，在免疫后7天pDNAIL-16+IBVDNA组与灭活苗组差异显著， 在免疫后14天pDNAIL-16+IBVDNA组和DNA疫苗组，pDNAIL-16组与所有实验组差异显著， 在免疫后21天与所有组比较均出现差异极显著，在免疫后28天与PBS组差异极显著，在免疫 后35天与pDNAIL-16组差异显著。攻毒实验结果表明，pDNAIL-16+IBVDNA组相对保护率(80%) 高于IBVDNA疫苗组(7(E)，与弱毒苗组的保护率相当(80y。)，但低于灭活苗组的保护率(10(Fo)。 实验结果说明分子佐剂pDNAIL-16对IBV DNA疫苗具有一定的免疫增强作用。鸡白细胞介素16基因序列表Organization ApplicantStreet: City: State : Country : PostalCode : PhoneNumber : FaxNumber : EmailAddress : <110> OrganizationName :四川大学Application Project<120> Title: —种鸡白细胞介素16基因及其真核表达质粒构建及免疫效应 <130> AppFileReference : <140> CurrentAppNumber : <141> CurrentFilingDate :_Sequence<213> OrganismName : Gallus gallus <400> PreSequenceString :atgagcgaag acaacagcca cttagatttg caacccggca tcgacgcaaa tgaaggacat 60gaaaatcgaa gcagctcaga ggcagttctg cagaaatcag aatcagaaat agtcagttcc 120aaagtgctaa aatcagatga aaatgacgct gtaaaaaagg gccctcctgt tgcacctaag 180ccagtctggt ttcgccaaag tctgaaagga ctgaggaaag cgaattcaga cctcaaacca 240caggcagatc aaagtccttc tgaccttcag agtgtttcca ccaaagaact gcaatccagt 300ttatcccgtc tgccttccag gggatcatcg atcaaacaga gaataagttc atttgaatct 360ttgagtgctc cgcagtcacc tgaaaaagta caccgaaggc tcagcccaaa accatcagtc 420cagaaggaac agtctccctc tgcaaaatgg tcagaagggg ctccagacca tttcagccaa 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权利要求
1.一种鸡白细胞介素16基因及其真核表达质粒构建及免疫效应，其特征在于用分子生物学方法将鸡白细胞介素16基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建能表达鸡白细胞介素16基因的真核表达质粒，研制分子佐剂pDNAIL-16，该佐剂可用于作为鸡传染病DNA疫苗的免疫增强剂。
2. 根据权利要求l所述的真核表达质粒pDNAIL-16,其特征在于用鸡白细胞介素 16基因经BamH I和EcoR V双酶切后，插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构 建真核表达质粒，研制DNA疫苗分子佐剂pDNAIL-16。
3. 权利要求2所述的真核表达质粒pDNAIL-16用于作为鸡传染病DNA疫苗的免 疫增强剂。
全文摘要
本发明是一种鸡白细胞介素16基因及其真核表达质粒构建与免疫效应。本发明根据Genbank中注册的鸡白细胞介素16蛋白基因序列设计引物，以鸡白细胞介素16蛋白基因的重组质粒PCIL-16为模板，用PCR方法扩增鸡白细胞介素16，并将PCR产物经BamH I和EcoR V双酶切定向插入以BamH I和EcoR V双酶切处理的真核表达载体pcDNA3.1(+)中，成功的构建了鸡白细胞介素16成熟蛋白真核表达质粒，研制出分子佐剂pDNAIL-16。该分子佐剂可作为禽类DNA疫苗的免疫增强剂。通过检测血清IBV特异性抗体、CD4+、CD8+、CD3+百分含量，研究了该分子免疫佐剂对禽传染性支气管炎DNA疫苗的免疫增强作用。结果发现分子佐剂pDNAIL-16对IBV DNA疫苗具有一定的免疫增强作用。
文档编号C12N15/24GK101235375SQ20071005044
公开日2008年8月6日 申请日期2007年11月8日 优先权日2007年11月8日
发明者余协中, 夏青青, 毅 张, 徐永莉, 王红宁, 田国宝 申请人:四川大学