专利名称：高羊茅高频基因枪转化方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及高羊茅基因枪高频转化方法。
背景技术：
高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)又称苇状羊茅，是世界温带地区的多年生冷季型草种，原产欧洲西部，具有营养丰富、生长迅速、抗干旱、抗病、耐瘠薄、适应性广等优良特性，既可放牧又可建植草坪。是欧洲和北美重要的栽培牧草之一，并与草地早熟禾并列为最重要的草坪草种。我国20世纪70年代引进，之后成为北方暖温带地区建立人工草地和补播天然草场的重要草种。近年来，高羊茅作为草坪草在我国利用发展很快，黑龙江、北京、山东、江苏、湖北、江西等地都已引种栽培，在我国的草地建设、改良、城市绿化和运动草坪建植中发挥着越来越大的作用。但草质粗糙、适口性差、无匍匐茎、易遭杂草侵害以及不耐寒冷、耐盐性差等缺点使高羊茅的栽培具有一定的局限性。长期以来，同其他牧草和草坪草一样，高羊茅新品种培育基本上都是依靠常规育种方法，工作周期长，定向性不好。另外，高羊茅的遗传学和生殖生物学研究工作薄弱以致遗传改良的研究成功率不高。植物基因工程技术的发展为高羊茅的遗传改良提供了一种很有潜力的手段，利用基因工程技术可有效改善特定性状，为高羊茅耐盐耐旱和耐寒育种开辟新途径。
近年来，在传统育种手段的基础上，采用现代生物技术如基因工程进行培育已经广泛应用于高羊茅的育种工作中。基因枪法是利用高速运动的金属微粒将附着于表面的核酸分子引入到受体细胞中的一种遗传物质导入技术。其原理是利用火药爆炸、高压放电或高压气体作为驱动力加速金属粒子，并使其进入带壁的细胞。在此过程中，携带有目的基因的质粒DNA首先粘附在微弹表面，结合有DNA分子的微弹经加速而获足够的动量，进而穿透植物细胞壁进入靶细胞。外源DNA分子也就随之导入细胞，并随机整合到寄主的基因组内。基因枪法的受体可以是各种外植体、愈伤组织及胚性细胞或细胞器，突破了基因转移的物种界限。实验操作简单易行，具有相当广泛的应用范围，已成为研究植物细胞转化和培育转基因植物的最有效的手段之一。基因枪转化法是目前质体基因工程中最常用和最有效的DNA导入技术，它避开了原生质体再生培养的困难，克服了当时所认为的农杆菌的宿主限制，受体材料来源广泛，且不受基因型限制。且具有高效表达、原核基因无需修饰改造、便于遗传操作、可实现定点整合和易保持纯系、后代不分离等优点。
草高羊茅转化过程中多采用这种方法，但是对其转化过程研究较少，一般只简单获得植株；对高羊茅进行功能基因转化的较少，抗旱、耐盐等基因转化尚属空白。我们则对基因枪具体的转化参数进行系统研究，并且把两种与抗旱、耐盐有关的功能基因转入高羊茅愈伤组织中，得到了再生植株。
发明内容
本发明的目的在于提供高羊茅高频基因枪转化方法，以提高高羊茅的转化效率。
本发明方法选择高羊茅胚性愈伤组织为转化受体通过调节基因枪轰击过程中的各项影响因素，获得适合高羊茅最佳转化体系。
具体地说，本发明的待轰击愈伤组织块直径在0.5-1mm，采用CaCl2+Sperm(亚精胺)包被质粒DNA，使用1μm金粉作为质粒DNA的载体，轰击的高度选择6cm，轰击次数为2次；轰击后愈伤组织在含有渗透剂(0.2M山梨醇和0.2M甘露醇)的愈伤诱导培养基上过夜，次日转入愈伤诱导培养基中恢复培养5d。经恢复培养的愈伤组织，在筛选压为80mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基中筛选培养40d，而后转入筛选压为40mg/L潮霉素再生培养基中续筛选的同时再生植株。
本发明成功地将DREB1A、BADH-CMO基因转入‘千年盛世’、‘凌志’、‘交战II号’和‘猎狗5号’4个品种高羊茅基因组中，从而获得移栽成活的潮霉素抗性株系。
本发明对高羊茅基因枪转化方法进行了系统的研究，获得较高的转化效率。具体包括1)基因枪转化过程中，在轰击压力一定的情况下，基因枪转化受多个因素的综合影响，本发明研究了金粉直径、受体处理、受体状态等因素的影响，并且综合考虑了轰击高度、轰击次数和渗透处理的综合效果。找到了最佳的基因枪轰击参数，建立了高效的转化体系。
2)在含有潮霉素抗性标记的外源基因转入愈伤组织后，要进行愈伤组织抗生素的筛选，本发明对不同抗生素浓度进行筛选，获得了愈伤组织筛选的临界浓度，可应用于含有潮霉素抗性标记的外源基因转入高羊茅愈伤组织后，进行外源基因的初步筛选鉴定。
3)将2种功能基因通过此体系转入高羊茅愈伤组织中，经过分化再生，获得了转基因的高羊茅植株，证明了这种方法的可行性。
本发明方法转化效率高达6％，并且育种时间仅需半年，与传统育种相比大大缩短了高羊茅育种的时间。
图1是GUS显色示意图，A、B是转化的愈伤组织，C是未转化的愈伤组织；图2是PCR产物的电泳图，图中1是未转基因的植株，M是marker，24是质粒对照，2～23是转基因植株；图3是转基因高羊茅植株。
具体实施例方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1高羊茅的基因枪转化1.受体材料准备供试高羊茅品种为猎狗5号(Houndog5，购自北京中种草业有限公司)，交战II号(Crossfire II，购自北京中种草业有限公司)，凌志(Barlexas，购自百绿集团百绿草种公司)，千年盛世(Millennium，购自北京绿冠草业科技发展中心)诱导的胚性愈伤组织。经诱导培养基诱导和继代培养的胚性愈伤组织作为基因枪转化的靶材料。挑取年龄3-5个月的胚性愈伤组织，用镊子分成直径约0.5-1mm的小块，置于含有渗透剂的培养基中央，紧密排列出一个直径2cm的圆。
2.筛选剂浓度和筛选时间的确定将愈伤接种到含有不同浓度的潮霉素的培养基上，称取其质量，20天后再称取质量，将愈伤转移到新的培养基中，再过20天再称取。根据质量及愈伤状态的变化判断所用潮霉素的适宜浓度及确定适宜的筛选时间，得到潮霉素浓度为80mg/L，筛选时间为40天。
3.包裹DNA微弹(1)称取30mg直径1μm的金粉，置于1.5ml离心管中，加入1ml 70％乙醇，涡旋3-5min(混匀)，静置15min，瞬时离心1-5s，弃上清。(2)重复以下步骤三次加入1ml无菌水洗涤金粉，涡旋1min，静置1min，瞬时离心，弃上清。(3)加500μl 50％无菌甘油，金粉浓度约为60mg/ml，室温下可保持两周。(4)涡旋保存在甘油中的金粉5min。(5)吸取50μl(3mg)于1.5ml离心管中，吸取过程保持涡旋，冰上操作；(6)依次加入5μl携带有目的基因的质粒DNA(1μg/μl)，50μl 2.5M CaCl2、20μl 0.1M亚精胺，持续涡旋2-3min，静置1min，瞬时离心2s；(7)弃上清，加入140μl 70％乙醇；(8)弃上清，加入140μl无水乙醇；(9)弃上清，加入48μl无水乙醇，轻轻敲击离心管数次悬浮金粉，低速涡旋2-3s，此时金粉可以用于轰击之用。
4.轰击处理所用基因枪为Biorad公司PDS1000/He型，将其放置于一个较大型的超净工作台上，以利于操作。工作台、真空室、微弹载体和阻挡网等均需用70％酒精消毒，然后吹干。将微弹载体装入载体架上，取6μl包被质粒DNA的金粉悬浮液，均匀涂抹于微弹载体膜中心，干燥10min。将载有包被质粒DNA的金粉颗粒的微弹载体及阻挡网装入微弹发射装置中，将盛有欲转化愈伤组织的培养皿置于基因枪样品室内，可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，氦气压力为1100psi，真空度28inchHg，微弹飞行距离在6cm轰击2次。
5.过渡培养和筛选培养将轰击后的愈伤组织在含有渗透剂(0.2M山梨醇和0.2M甘露醇)的愈伤诱导培养基中过夜，次日进行gus基因化学组织染色，按照Jefferson(Jefferson Richard A，Tony A.Kanvanagh and MichaelW.Bevan.Gus fusionsβ-glucuronidaseand a sensitive and versatilegene[J].The EMBO Journal，1987，6(13)3901-3907)的方法进行。将愈伤组织转入愈伤诱导培养基中恢复培养5d，再转入加有80mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基中筛选培养20d，25℃暗培养，连续筛选两次，即筛选培养40d。
6.植株再生培养挑取存活愈伤转入含有40mg/L潮霉素的分化培养基(分化培养基是指1/2MS+0.2mg/L KT(激动素)中续筛选30d，25℃光照16h培养。挑取部分愈伤组织进行gus基因化学组织染色。将长出的小芽转入到不含筛选剂的分化培养基中待小苗长到3-4片叶时转入生根培养基(生根培养基是指1/2MS+0.5mg/L NAA+0.2mg/L KT)中，壮苗生根。
7.抗性植株的移栽将根叶完全的壮苗室温下炼苗3d后，清洗掉基部的培养基，直接栽入到花盆(基质为沙∶土∶草炭＝1∶1∶1)中，自然光下生长。(图3)实施例2转化植株的检测通过实施例1的方法将DREB1A基因通过pCAMBIA1301(CAMBIA)载体(包含DREB1A和Gus基因，分别由ubi及CaMV35S启动子驱动，筛选基因为hpt)转入高羊茅胚性愈伤组织，并获得抗性植株。转化效率为6.12％。
1、GUS表达的检测转化后40h，对转化的受体进行组织化学染色，观测愈伤组织中GUS基因的瞬时表达，在Olympus体视显微镜下观察染色情况；2个月后，对潮霉素抗性愈伤组织进行组织化学染色，观测GUS基因的稳定表达。染色方法参考Jefferson方法(Jefferson，1987)，以未转化愈伤组织作对照，结果如图1所示，图1中A、B是转化的愈伤组织，C是未转化的愈伤组织。
2、抗性植株的分子检测提取抗性植株DNA进行PCR检测，DREB1A引物序列为引物F5’＞AAA GGA TCC TTA CCC GGG TTC TGA TCA ATGAAC TCA TTT TCT G＜3’，引物R5’＞AAA GGT ACC AAT CCC GGG GTT TTA ATA ACTCCA TAA CGA TAC G＜3’反应体系采用25μl反应体系，具体如下
10×Taq buffer2.5μLdNTP 2.0μL引物F+R 2×1.0μLTaq酶 0.5μL模板(质粒和代测植物)DNA 1μLddH2O 17μL总体积25μL反应条件热盖 105℃94℃预变性 4min 72℃延伸10min4℃保存PCR产物进行电泳检测，结果如图2所示，抗性植株中全部检出DREB1A基因；将PCR产物克隆载体后测序，测序正确。
权利要求
1.高羊茅高频基因枪转化方法，其特征在于，选择胚性愈伤组织作为转化受体进行基因枪转化，采用CaCl2+亚精胺包被质粒DNA，使用1μm金粉作为质粒DNA的载体，轰击高度6cm，轰击2次。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，转化的外源基因是DREB1A或BADH-CMO。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化使用DREB1A-GUS双基因表达载体。
4.一种制备转基因高羊茅的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1)选择胚性愈伤组织作为转化受体进行基因枪转化，采用CaCl2+亚精胺包被质粒DNA，使用1μm金粉作为质粒DNA的载体，轰击高度6cm，轰击2次；2)轰击后的愈伤组织在含有0.2M山梨醇和0.2M甘露醇的愈伤诱导培养基上培养4h，转入愈伤诱导培养基中恢复培养5d。3)经恢复培养的愈伤组织，在筛选压为80mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基中筛选培养40d，而后转入筛选压为40mg/L潮霉素再生培养基中继续筛选培养直至再生出植株。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，转化的外源基因是DREB1A或BADH-CMO。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转化使用DREB1A-GUS双基因表达载体。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转化使用含有潮霉素抗性标记的表达载体。
8.如权利要求4～7所述的方法，其特征在于，转化受体为‘千年盛世’、‘凌志’、‘交战II号’或‘猎狗5号’的胚性愈伤组织。
全文摘要
本发明提供了高羊茅高频基因枪转化的方法。本发明选择胚性愈伤组织作为转化受体进行基因枪转化，采用CaCl
文档编号C12N15/87GK101024844SQ20071006358
公开日2007年8月29日 申请日期2007年2月5日 优先权日2007年2月5日
发明者韩烈保, 王维飞, 曾会明, 齐春晖, 方文娟 申请人:北京林业大学, 韩烈保, 王维飞