专利名称：日本结缕草植株再生方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术，具体涉及日本结缕草的高频再生方法。
背景技术：
日本结缕草(Poa pratensis L.)是禾本科优质暖季型草坪草，采用基因工程对日本结缕草进行品种改良、新品种选育已经成为当前日本结缕草生物技术领域研究的重点。日本结缕草基因转化的受体系统主要来源于组织培养途径，作为基因转化的受体系统，要求具有很强的再生能力、较高的遗传稳定性、稳定的外植体来源、对选择性抗生素敏感、对农杆菌侵染要有敏感性等。因此，建立高效的再生体系一直是日本结缕草育种学家追寻的目标。然而日本结缕草的离体培养相对于冷季型草坪草难度更大，虽然已有日本结缕草组培再生体系建立的报道，但是还存在再生频率较低、维持愈伤胚性困难等不足，没有较系统的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供日本结缕草植株再生的方法。
本发明首先通过外植体诱导形成愈伤组织，再进一步挑选胚性愈伤组织进行继代培养或直接分化成植株。本发明通过实验获得了具体的技术参数，从而建立了日本结缕草植株高频再生体系。
本发明将外植体经预处理后，接种愈伤组织诱导培养基，从而得到愈伤组织，挑选胚性愈伤组织接种继代培养基进行继代培养，或者接种再生培养基分化成再生植株。
其中，愈伤组织诱导培养基为MS培养基加入2，4-D 3-6mg/L、6-BA或KT 0.05-0.2mg/L及CuSO42-3.5mg/L。
其中，继代培养基为MS培养基加入2，4-D 2mg/L其中，再生培养基为1/2的MS培养基加入KT 0.2mg/L上述外植体可以为成熟种子、芽尖、胚轴或根，优选为成熟种子和芽尖。对于成熟种子而言，其通过次氯酸钠处理，特别是去皮之后用次氯酸钠处理，可以显著提高诱导率。
胚性愈伤组织生长22～35天期间为旺盛生长期，是继代的最佳时期；继代时仔细挑选奶白至淡黄色、颗粒状的胚性愈伤组织，然后转接至新鲜培养基上。及时继代与仔细挑选，是保持愈伤组织胚性的关键。
本发明以愈伤组织和胚性愈伤组织诱导率来评价本发明中的各个影响因素(如选用的外植体、使用的培养基、添加的诱导物等等)。
其中，愈伤组织的诱导率＝形成愈伤的外植体数/接种的外植体数×100％；胚性愈伤率＝胚性愈伤数/愈伤数×100％。
按照本发明的方法，外植体的愈伤诱导率可达90％，胚性愈伤率可达30％，愈伤组织再生率可达45％。再生植株在有很强的分蘖、生根能力。植株经壮苗、炼苗后移栽入土壤中，成活率达87.5％以上。移栽的植株在田间能够正常扩繁生长。
图1是由日本结缕草成熟种子诱导愈伤组织；图2是继代培养的胚性愈伤组织；图3是日本结缕草胚性愈伤组织，其中，E为胚性愈伤；NE为非胚性愈伤；图4是体细胞胚胎发生(箭头所示)；图5是绿色芽点出现；图6是日本结缕草植株再生；图7是再生苗移栽入土壤；图8是日本结缕草愈伤组织生长曲线，1-5表示5个重复的‘Qingdao’愈伤组织。
具体实施例方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
1.材料与方法1.1试验材料日本结缕草品种‘Zenith’(Zoysia japonica cv.Zenith)、‘Liaoning’(Zoysia japonica cv.Liaoning)、‘Qingdao’(Zoysia japonica cv.Qingdao)、‘Lanyin 3’(Zoysia japonica cv.Lanyin3)；‘Zenith’种子购自美国TMI公司(Turf Merchants，Inc)，‘Liaoning’、‘Qingdao’品种种子购自北京市种子公司，‘Lanyin 3’品种种子购自中国热带农业科学院农牧研究所。
1.2外植体的获得成熟种子浸在约50mL次氯酸钠溶液(北京化工厂生产，活性氯＞5％，加入1～2滴吐温20)中，在磁力搅拌器上消毒1h，以无菌水冲洗3～5次，4℃下浸泡若干天。对于由种子诱导愈伤组织，消毒处理后的种子以无菌滤纸吸干多余水分后接种于不同固体培养基上，对于由无菌苗各部位诱导愈伤组织，将消毒处理后的种子接种于无菌种子萌发培养基中，28℃黑暗或16h/d光照下培养，萌发出小苗后，取不同部位接种于不同的愈伤组织诱导培养基上。
将处理过的成熟种子消毒并置于无激素的1/2MS培养基上培养，待种子接种13天后，选取结缕草无菌苗(生长5-10天，长出茎、根后)的叶尖(5mm长)、叶段(5mm长)、茎基(5mm长)和根部作为外植体。
1.3培养基各培养基以MS基本培养基为基础，变动其它因素，pH5.8，附加植物凝胶3g/L，1/2MS培养基附加20g/L蔗糖，其余培养基蔗糖浓度为30g/L。
1.4培养方法外植体接种入诱导愈伤培养基中，，黑暗状态下28℃诱导愈伤组织。愈伤每月继代一次到愈伤组织继代培养基上，一个月后统计愈伤诱导率，2个月后统计胚性愈伤率。挑选淡黄或白色，结构致密，颗粒状的胚性愈伤组织(0.5mm大小)转入不同再生培养基，光下培养，光照强度约2000～3000Lux，光照周期16h/d，温度25～28℃，一个月后统计植株再生率。待小植株形成后，转入1/2MS培养基上壮苗。根系强壮后，打开瓶盖炼苗3天，然后以自来水小心洗去植株根部琼脂，移栽入由砂(0.25～0.5mm)与草炭土混合基质中，混合比例砂草炭土＝9∶1。
2.结果与分析2.1种子的预处理对愈伤诱导的影响日本结缕草种子经次氯酸钠消毒后，于4℃浸泡不同天数后接种于MS+2，4-D 5mg/L的培养基中，以未经过浸泡的处理作对照，一个月后统计愈伤诱导率。结果可见，随着浸泡天数的增加，愈伤诱导率也呈增长趋势，除品种‘Qingdao’未去皮种子在浸泡14d愈伤诱导率仍呈上升趋势外，其余处理在浸泡3d后愈伤诱导率开始下降。因此，除品种‘Qingdao’未去皮种子需浸泡2周以上外，其余处理种子消毒后4℃下浸泡2～3d将大大提高愈伤诱导率。
表1 4℃浸泡处理对成熟种子愈伤诱导率的影响
2.2日本结缕草种子诱导愈伤的多因素正交实验以‘Qingdao’、‘Zenith’、‘Liaoning’及‘Lanyin 3’4个品种的成熟种子为材料，确定基因型、2，4-D、KT、6-BA及CuSO45个主要影响因子，设计5因素4水平L16(45)的正交试验。正交试验表头及各因素、水平见表2，数据经反正弦变换后做方差分析，结果见表3(表中数据为各水平均值)。
表2 以日本结缕草种子为外植体诱导愈伤的正交试验设计
表3 日本结缕草种子诱导愈伤的多因素正交实验结果
注a)英文小写字母不同表示0.05水平显著；b)英文大写字母不同表示0.01水平显著。
可见，对于愈伤诱导率，2，4-D、KT、6-BA各水平差异不显著(P＞0.05)，而基因型、CuSO4对愈伤诱导率影响显著。CuSO4在2.5mg/L时愈伤诱导率极显著(α＜0.01)高于其它3个水平；品种‘Zenith’的愈伤诱导率极显著(α＜0.01)高于其它3个品种，并且‘Lanyin 3’的愈伤诱导率也极显著(α＜0.01)高于‘Liaoning’和‘Qingdao’2个品种。即，在日本结缕草组织培养中，选用品种‘Zenith’，在愈伤组织诱导培养基中添加2，4-D 5mg/L、6-BA或KT 0.1mg/L及CuSO42.5mg/L，将提高效率。
2.3以无菌实生苗各部分为外植体诱导愈伤组织的正交实验2.3.1以胚轴、根段及幼芽诱导愈伤组织的正交实验日本结缕草品种‘Zenith’种子28℃光下无菌萌发4d后，取小苗的胚轴、根段及幼芽分别接种至不同培养基中，黑暗状态下28℃培养。1个月后统计愈伤诱导率，2个月后统计胚性愈伤率，数据经反正弦变换后做方差分析。由于以幼芽为外植体的实验中，仅得到少数几个愈伤组织，而且愈伤呈水渍状，无胚性结构的出现，因此未做分析。以胚轴和根段为外植体结果分别见表4和表5，表中数据为各水平均值。
4 日本结缕草胚轴诱导愈伤的多因素正交实验结果
注a)英文小写字母不同表示0.05水平显著；b)英文大写字母不同表示0.01水平显著。
对于以胚轴为外植体诱导愈伤组织，2，4-D在2～5mg/L水平内对愈伤诱导率和胚性愈伤率都没有显著影响(P＞0.05)；KT浓度为0时的愈伤诱导率极显著(α＜0.01)高于其它2个水平，而各水平间对胚性愈伤诱导无显著影响；6-BA浓度在0～0.05mg/L范围内的愈伤诱导率显著(α＜0.05)高于0.1mg/L的浓度处理，在浓度为0.05mg/L时胚性愈伤率显著(α＜0.05)高于不含的6-BA处理，因此添加6-BA有利于胚性愈伤组织的诱导；含0.025mg/L CuSO4处理的愈伤诱导率显著高于其它2个水平，而且各水平间对胚性愈伤率无显著影响(P＞0.05)，说明MS培养基中的CuSO4浓度(0.025mg/L)已经适于由胚轴诱导愈伤组织，无需再额外添加CuSO4。可见，在以日本结缕草胚轴为外植体诱导愈伤组织的实验中，可以选用2～5mg/L的2，4-D，添加0.05mg/L 6-BA。
表5 日本结缕草根段诱导愈伤的多因素正交实验结果
注a)英文小写字母不同表示0.05水平显著；b)英文大写字母不同表示0.01水平显著。
以日本结缕草根段为外植体诱导愈伤的实验中，2，4-D在2～5mg/L范围内对愈伤诱导率无显著影响(P＞0.05)；KT和6-BA反应相似，0mg/L的处理相比于其它两水平可以极显著(α＜0.01)提高愈伤诱导率；0.025mg/L的CuSO4与1.25mg/L的处理对愈伤诱导率无显著差异，但显著好于2.5mg/L。而2，4-D、KT、6-BA及CuSO4各水平间对胚性愈伤率均无显著影响。实验中也观察到，由根段诱导得到的愈伤组织很容易在继代后失去胚性，这可能是由根中的激素水平导致的结果。因此，根段不适于日本结缕草的组织培养。
2.3.2以芽尖诱导愈伤组织的正交实验日本结缕草消毒处理后的种子接种在种子萌发培养基上，28℃黑暗条件下培养，使种子萌发出黄化苗。因为光会抑制胚轴的生长，因此绿色小苗的芽尖位于种子附近，不利于操作，而黑暗状况有利于胚轴的伸长，黄化苗的芽尖部分距离种子较远，有利于芽尖的拨取。种子萌发后，在体视显微镜下以解剖针拨取黄化苗的芽尖部位，接种至含有不同浓度2，4-D、KT及CuSO4的MS培养基上诱导愈伤组织，1个月后统计愈伤诱导率，2个月后统计胚性愈伤率，数据经反正弦变换后做方差分析，实验结果见表6，表中数据为各水平均值。
表6 日本结缕草芽尖诱导愈伤的多因素正交实验结果
经方差分析得出，2，4-D、KT及CuSO4在本实验取值范围内，对日本结缕草芽尖诱导愈伤组织的愈伤诱导率和胚性愈伤率都没有显著(P＞0.05)影响。原因可能是因为芽尖部分是草坪草叶原基所在之处，由细胞分裂旺盛的分生组织组成，而草坪草组织培养中分裂越旺盛的细胞越有利于愈伤组织的诱导与胚性愈伤的形成，因此受各因素影响较小，与种子、胚轴、根段等其它外植体相比，愈伤诱导率和胚性愈伤率都很高，最有利于日本结缕草胚性愈伤组织的诱导，但由于萌发苗太小，芽尖的拨取要在体视显微镜下操作，费时费力且容易对芽尖造成损伤从而影响愈伤组织的诱导，需要有经验的人才能熟练操作，因此应用受到限制。
2.4愈伤组织生长曲线的测定愈伤组织继代后经过恢复期、旺盛生长期而达到增殖顶峰而后生长缓慢。愈伤组织的继代培养最合适时间是愈伤组织即将达到顶峰之前，这时愈伤组织中的细胞处于旺盛分裂中，继代后容易进入生长阶段。若长时间不继代，培养基中各种养分被吸收殆尽，无法满足继续生长所需，从而影响愈伤组织的质量。为了找出日本结缕草愈伤组织的最佳继代时期，对5个重复的‘Qingdao’愈伤组织进行12次称重，三天一次。其中重复5在第8次称重后污染。如附图8所示，愈伤组织在转接到新的培养基上后重量开始增加，在第8次(继代第24天)称重后，愈伤增重率较大，说明愈伤组织进入旺盛生长状态，在第11次称重后(继代33天后)，愈伤增重持平，表明培养基中的养分已消耗殆尽，不足以维持愈伤组织的旺盛生长，此时如果再不继代，会影响到愈伤组织的生长。因此，愈伤组织在第8次至第11次间(24～33天)为旺盛生长期，是继代的最佳时期。该结论也与平时的肉眼观察相符合，从胚性愈伤的生长来看，经过恢复期的生长，在继代后约25天左右，可在原来的愈伤旁边看到颗粒状的胚性愈伤长出，并在以后的一星期内迅速增殖。而愈伤生长30多天后若再不继代，原培养基中的2，4-D浓度已下降至不足以控制胚性愈伤的生长，而胚性愈伤开始继续体细胞胚的发育阶段，此时胚性愈伤已有分化的趋势，甚至见到芽丛长出。因此，对于愈伤胚性的维持，及时继代非常重要。
2.5不同培养基对日本结缕草植株再生的影响挑选状态相同的日本结缕草‘Zenith’和‘Qingdao’两品种的胚性愈伤组织，转接入不同再生培养基中，观察不同培养基对植株再生的影响。一星期后愈伤出现绿色芽点，并逐渐分化为小植株，全部为正常的绿色植株。日本结缕草植株的再生可能是由愈伤的状态决定的，各培养基对成苗率影响不大。这可能是因为实验中严格挑选胚性的愈伤组织转接入各种培养基，胚性愈伤经过体细胞胚发生途径再生植株，而不是依赖于激素的作用。在实践中也发现，胚性愈伤组织具有很强的分化趋势，在愈伤组织继代培养基上需要以较高浓度的2，4-D控制体胚的发生，一旦2，4-D浓度降低或消除，胚性愈伤便会迅速发育，这就是如果愈伤继代间隔较长，即原培养基中2，4-D浓度已急剧下降时，经常会见到芽丛产生的原因。
虽然各培养基中成苗率相差不多，但在1/2MS+KT 0.2mg/L培养基中，根与芽更趋向于同时分化，符合体细胞胚发育途径，而不需经芽分化与根分化两个独立的阶段，从而缩短了培养时间。植株经壮苗、炼苗后移栽入土壤中，成活率达87.5％以上。
表7 不同培养基对植株再生的影响
3.该再生体系应用实例采用基因枪转化法，轰击由此再生体系培养出的胚性愈伤组织，经过继代与分化培养，成功将提高植物抗旱、耐寒、耐盐性的DREB1A基因转入日本结缕草，获得了转基因植株。
权利要求
1.日本结缕草愈伤组织诱导方法，其包括步骤1)将外植体预处理；2)接种愈伤组织诱导培养基，其中所述的愈伤组织诱导培养基含有2，4-D 3-6mg/L、6-BA或KT 0.05-0.2mg/L及CuSO42-3.5mg/L。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的愈伤组织诱导培养基含有2，4-D 5mg/L、6-BA或KT 0.1mg/L及CuSO42.5mg/L。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的外植体为成熟种子。
4.日本结缕草植株再生方法，其特征在于，通过权利要求1～3所述的方法诱导得到愈伤组织，挑选胚性愈伤组织接种再生培养基，其中所述的再生培养基为1/2的MS培养基加入KT 0.2mg/L。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，挑选胚性愈伤组织经继代培养后接种再生培养基。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述的继代培养所用的培养基为MS培养基加入2，4-D 2mg/L。
全文摘要
本发明提供了日本结缕草植株再生方法。该方法将外植体经预处理后，接种愈伤组织诱导培养基，从而得到愈伤组织，挑选胚性愈伤组织接种继代培养基进行继代培养，或者接种再生培养基分化成再生植株，其中愈伤组织诱导培养基含有2，4－D 3－6mg/l、6－BA或KT 0.05－0.2mg/l及CuSO
文档编号C12N5/04GK101015281SQ20071006424
公开日2007年8月15日 申请日期2007年3月7日 优先权日2007年3月7日
发明者韩烈保, 齐春辉, 梁小红, 方文娟, 曾会明 申请人:北京林业大学, 韩烈保, 齐春辉