专利名称：：一种鹿茸细胞培养方法
技术领域：
：本发明涉及一种鹿茸细胞培养方法。具体而言，本发明涉及一种从鹿茸中分离细胞进行工业化培养技术和方法。
背景技术：
：自从1985年以来，我国学者及有关研究单位，用现代医药学试验手段作了许多专题研究工作检试鹿茸的药理作用，寻找药化活性物质，阐明了鹿茸的物质基础和作用机理，确认具有抗疲劳、促生长、抗衰老强壮作用。1、氨基酸作为蛋白质的组成成分在滋补强壮药中占一定地位，研究测出鹿茸含有17种以上游离氨基酸，包括7种人体必需氨基酸和2种半必需氨基酸，尤以牛磺酸含量甚高。但在鹿茸不同部位含有氨基酸种类和数量差异较大。2、微量元素至少含17种，磷、钙丰富。3、多胺是鹿茸中刺激蛋白质、RNA、DNA合成的重要活性物质，多胺有腐胺(Putrescine)、精脒(Spermindine)、精胺(Spermine)三种，鹿茸不同部位含量不同，茸尖含量最多，茸根部甚少。鹿茸氨基酸测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>4、核酸碱基成分，从鹿茸的沸水抽出的正丁醇溶性部分，得到次黄嘌呤(hypoxantnine)抗衰老活性物质。5、脂质类鹿茸中含有大量滋养神经组织的脂类物质。将梅花鹿茸生药粉末分别用水，55%乙醇和70%乙醇抽出，各抽出物再分别用乙醚、正丁醇依次抽出得到A、B、C三部分。从正丁醇溶性部分用HPLC法测出次黄嘌呤。从醚溶性组分分离出雌二醇、17B孕酮、睾丸酮。另外，分离出滋补神经组织的成分有蛋白脂质(Proteolipids)卵磷脂(lec池in)、脑磷质(Cephalen)、神经节苷脂(genglioside)、糖质(glycolipid)等15种之多。6、酶类有过氧化氢酶、过氧化物酶。7、糖类用抗补体模型，从乙醇抽出残渣，再经热水抽出等得到活性多糖A—2，它与硫酸软骨素相似、活性更强。对鹿茸药化分析测定的新成果不再列举，各方面研究显示出鹿莺是贵重的药物宝库，其药用价值现已被世人所公认。但是鹿茸不便分析提取难以制出精品药物。特别是生产数量有限，价格不低，鹿茸很难进入普通家庭。茸尖腊层高效部位更显稀少、珍贵。这些现实问题有待于新的突破。本发明详细描述长命百岁、延年益寿是人类美好的梦想，历史和科学的局限性，让与之奋斗者难以美梦成真。生物技术诞生，生命科学的迅猛发展，超极限的提高人的生命力，己有可能。提高机体器官功能，促进代谢产生能量，战胜和恢复疲劳，修复损伤提高再生能力，在不断科技创新中都将成为可能。经过10余年的探索，我们实现了采药寻宝计划。摘取鹿茸角尖部生茸细胞用细胞反应罐大规模生产鹿茸活性物质获得成功。研究检试鹿茸细胞培养物所含活性物质和药理作用，均与鹿茸一致，经专家鉴定得到完全肯定，认为两者相同或相似，替代鹿茸可用于保健品。鹿茸细胞培养生产鹿茸物质是生产方式的改革。由摘取鹿茸细胞开始到完成大规模培养乃致达到细胞反应罐生产是由多项新技术应用，组成一套综合工程项目和规范化生产工艺。本发明技术方案如下1、细胞种子选择悬浮培养的细胞源于东北长白山梅花鹿或马鹿，从百头以上的种群中挑选3-7周岁健康强壮的质量突出的个体，检疫无疾病。在最佳生长时期，从二杠或三杈採取原始材料，进行细胞培养。2、建立细胞库在GMP条件下将种原细胞做静态和动态培养，经严格选拔，找出理想者大量增殖，做不同代数观察和保存，符合标准者存入细胞库，编号备用。3、悬浮培养购入美国细胞反应罐(1.5L，10L)灌注种细胞、搅拌培养，向细胞生长液调节气体、PH、温度等给予适宜条件，待生长达到最佳数量时多次灌注液体和分批收获。4、收获良好生长状态的细胞达到数量要求时，收集后取样质量检验。在低温条件下保存。5、品质检查光学显微镜下细胞形态呈前成软骨细胞状。超微结构观察细胞核完整核膜清晰，线粒体和内织网量较高，细胞表面有纤突，活力好，生命力强，证明有繁衍能力。体积与原鹿茸细胞基本相同。人工培养鹿茸细胞细胞染色体检査原代及传代细胞的染色体数量呈二倍体或一部分呈亚二倍体、超二倍体。与梅花鹿体细胞相同。实施例1种子细胞获取及建立悬浮培养鹿茸细胞系(株)中国梅花鹿、马鹿，年龄215岁所生长的初角、二杠、三杈鲜活鹿茸，从鹿茸的生长(生发)部位间充质层摘取种源组织细胞。方法为以无菌手术机械法切割鹿茸组织，使其成为细小组织块，置入生长液在培养箱培养，收集足够的单层细胞，再以搅动式培养瓶培养。搅拌速度每35天传代一次，连续传代2040次(或以上)细胞量达106/！111。实施例2鹿茸细胞悬浮培养法使用(乃至30L)细胞培养罐配合中空纤维柱构成细胞连续培养系统。培养罐工作体积1.2L，培养条件要求37。C，pH7.1，60-80rpm转速，溶解氧50%、空气饱和通气量0.1Lpm。鹿茸细胞接种浓度为1.10X104，经过静止期细胞培增，第5天达6.4X105，第5天开始连续灌注新培养基，灌注率每天0.92，第9天细胞数由降低又回升到4.0X105/1111。随着细胞数不断增加，逐步增加灌注量，第12天从培养罐中直接排出1.2L细胞悬液，收集细胞可达1.4X101Q/ml。在培养罐中留下0.2L细胞悬液，补充1.2L新培养基，继续灌注连续培养将灌注率从0.92逐渐提高到3.08。在第21天活细胞浓度又达到1.04X107,此时，再次排放1.2L悬液收集到活细胞1.30X10,剩的悬液进入第3周期培养(灌注率为3.85)，第29天细胞又可达到1.02X107，每7天收获1次。实施例3鹿茸细胞培养基配方:MEM(JORLIK改良MEM)基础液，补充1.5g/L葡萄糖，O.Olmmol/L非必须氨基酸，510%小牛血清。实施例4鹿茸细胞纯化将所获细胞悬液称量(称重)1000rpm离心5-10分钟，倾上清，加PBS洗后离心称重，分装冻存于一4(TC。实施例5鹿茸细胞培养物氨基酸及微量元素测定用氨基酸自动分析仪，从人工培养物中检出17种以上氨基酸包括7种人体必需氨基酸和2种人体半必需氨基酸，一般高于鹿茸含量，总量高于鹿莺。使用原子分光光度计检测了微量元素，被检的7种微量元素分别是Co、Ni、Mn、Cr、Zn、Cu、Fe各微量元素均高于鹿茸，其中Fe、Mn、Co、Cu尤为突出。实施例6鹿茸细胞培养物蛋白质测定鹿茸含氮量为7.9%，鹿茸培养物为6.03%，鹿莺含蛋白质49.35%，鹿茸培养物蛋白质含量为37.67%，两者相似或略低。实施例7鹿茸细胞培养物总糖用酚一硫酸法和DNS法测鹿茸总糖量为0.544%，鹿茸细胞培养物总糖含量则为1.433%比鹿茸高三倍总糖测定<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>据报道鹿茸多糖腹腔注射100mg/kg的抗炎作用，相当于30mg/kg强地松作用。可见鹿茸多糖对炎症确有抑制作用。实施例8鹿茸细胞培养物有机磷测定两者主要含有机磷，仅有少量无机磷，总磷量低于鹿茸。实施例9鹿茸细胞培养物多胺含量检测用高效液相色谱法，以乙二胺为内标对鹿茸培养物及鹿茸中的多胺含量进行测定。由于多胺是2个或2以上氨基或亚氨基长链脂肪组化合物，为便于测定釆用了酰衍生法，使成为高消光物质的苯甲酸衍生物。检试结果，鹿茸细胞培养物中的多胺含量远高于鹿茸。三种物质中腐胺含量最多，精脒次之，精胺含量虽比前二种较少，也可超出鹿茸含量10倍。见表多胺含量测定(CnM/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>多胺是一类活性较强的生理活性物质，大量分布于鹿茸生长带的组织细胞中，特别是生长活跃的鹿茸母细胞浓度更高。多胺不仅对RNA、DNA及蛋白质的代谢有重要影响，而且腐胺能够促进组织生长，损伤组织再生和修复，改变体内代谢状态及炎症的病理过程均有密切关系。是鹿茸和鹿茸细胞培养物最具代表性的活性物质。权利要求1.一种鹿茸细胞培养方法，优选为梅花鹿。其特征为采用鹿茸细胞进行悬浮培养以获取更多的鹿茸细胞。2.根据权利要求1所述的鹿茸细胞，其特征在于来源于梅花鹿以及马鹿的二杠茸。3.根据权利要求1所述的鹿茸细胞是以无菌手术机械法切割鹿茸组织，使其成为细小组织块，置入生长液在培养箱培养，收集足够的单层细胞，再以搅动式培养瓶培养。搅拌速度每35天传代一次，连续传代2040次所得。4.按权利要求1所述的悬浮培养是调节鹿茸细胞生长液中气体、pH、温度等适宜条件，待生长达到最佳数量时多次灌注液体和分批收获。5.按权利要求1所述的悬浮培养鹿茸细胞培养基配方MEM(JORLIK改良MEM)基础液，补充1.5g/L葡萄糖，0.01mmol/L非必须氨基酸，510%小牛血清。6.按权利要求1所述的鹿茸细胞纯化将所获细胞悬液称量(称重)1000rpm离心5-10分钟，倾上清，加PBS洗后离心称重，分装冻存于一40°C。全文摘要本发明一种鹿茸细胞培养方法，提供一种采用Celligen细胞培养罐进行鹿茸细胞悬浮培养，规模化生产富含多种活性物质、能够替代鹿茸组织的鹿茸母细胞。其生产周期为7天，细胞浓度可达1.04×10<sup>7</sup>/ml，可连续高密度培养。细胞可用于保健品生产。具有良好的经济效益和社会效益。文档编号C12N5/06GK101265463SQ20071006448公开日2008年9月17日申请日期2007年3月16日优先权日2007年3月16日发明者申大为,郑海发,伟高申请人:郑海发;高伟