三种泌尿生殖道感染病原物的联合检测基因芯片试剂盒的制作方法

文档序号:434576阅读:597来源:国知局
专利名称:三种泌尿生殖道感染病原物的联合检测基因芯片试剂盒的制作方法
技术领域
本发明涉及一种三种泌尿生殖道感染病原物的联合检测基因芯片试剂盒,属 于生物技术领域。
背景技术
在泌尿生殖道感染性病原物中,沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌的 感染率最高。据我国有关部门统计,每年性病患者有400万人左右,并在近 10年内以20-30%速度增长。其中,淋病排列首位,占性病的40.72%,非淋 菌性尿道炎第三,占性病的21.85%,在非淋菌性尿道炎中,沙眼衣原体占 40-50%,解脲支原体占20-30%,也就是说,沙眼衣原体、解脲支原体、淋 球菌的感染占感染总数的一半以上,因此上述三种病原物在临床上通常需 要同时检测。诊断是疾病治疗的基础,当前对上述三种病原物的诊断主要依靠培养 法、ELISA和PCR检测。这些方法中,培养方法周期长,灵敏度和准确度低; 免疫方法只能在抗原和抗体产生后才能检测,对感染程度较低的患者不能 达到早期检测;PCR方法存在假阳性和假阴性难以控制的问题,荧光实时定 量PCR也存在单纯PCR的固有缺陷,并且仪器及相关检测试剂价格昂贵。近几年发展起来的基因芯片技术,在感染性疾病检测领域有其特有的 优势。本发明即采用基因芯片技术研制成功沙眼衣原体(Chlamydia
trachomatis, Ct);角军脲支原体(Ureaplasma urealyticum, Uu);淋球菌 (Neisseria gonorrhoeae, Ng)基因芯片耳关合诊断试齐(J盒。发明内容-本发明的目的在于克服现有技术的不足,捉供1巾三种泌i7乂生殖道感染 病原物的联合检测基闵芯片试剂盒。本发明的基因芯片试剂盒,包括基因芯片、检测试剂和检测方法3部分。其中1. 基因芯片本发明的基因芯片由18位点组成,包括沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, Ct)、角率脲支原体(Ureaplasma urealyticum, Uu)禾口淋球菌 (Neisseria gonorrhoeae, Ng)的各5个特异的、保守的耙序列位点,2个阳 性对照位点和一个阴性对照位点。用PCR方法扩增18个检测位点的DNA 片段作为探针,用基因芯片点样仪打印在包被的载玻片上。点样时的矩阵按 探针均匀分布和重复对称排列。即每种病原物的5个检测位点与另外的病原 物的5个检测位点交替分布, 一个阳性位点和15个检测位点组成4X4的小 矩阵,4个这样的矩阵对称排列组成一个9X9的大矩阵,另外的一个阳性对 照和一个阴性对照在9X9矩阵的对称轴上。同时使得每个小矩阵的阳性位 点位于大矩阵的4个角上(见附图l)。2. 检测试剂本发明的检测试剂如下 试剂l: DNA提取试剂1XTE
试剂2:扩增试剂,包含PCR扩增过程的各种试剂试剂3:红色标记物,比如dUTP-cy5试剂4:绿色标记物,比如dUTP-cy3试剂5: TaqDNA聚合酶试剂6:杂交液,常规的杂交液即可试剂7: 20XSSC试剂8: 10%SDS四蒸水0.2ml薄壁管1.5ml离心管滤纸(120mmX40mm定性滤纸)上述试剂的用量根据包装规格确定。 3.检测方法本发明用常规的临床方法取泌尿生殖道的分泌物,并用常规方法提取 DNA。用针对检测靶位点序列和对照位点的特异PCR引物扩增检测样本 DNA,检测引物设计如图2所示,扩增反应试剂中加入阳性对照模板,而 不加阴性对照模板,扩增的同时将红色标记物标记到扩增产物中去;同时与 检测反应平行作一空白对照扩增反应,空白对照与检测反应的试剂配方一 致,只是用绿色荧光代替红色荧光标记物,并用对照处理替换检测样本 DNA。检测扩增产物与对照扩增产物按比例(见具体实施方式
)混合后与 芯片杂交。根据杂交信号判断样本中是否含有被检病原物,或含有甚么样的 被检病原物。本发明的优点 1. 基因芯片诊断能同时检测沙眼衣原体、解脲支原体和淋球菌,减少检 测反应的次数,降低检测成本;2. 可同时检测每种病原物的5个靶位点,有效地减少因个体差异或单位点检测的失误引起的检测假阴性。3. 本发明结合了PCR的高灵敏度和杂交反应的高特异性。同时加上荧 光标记,检测灵敏度较PCR方法的检测限降低2-3个数量级,可达101-102 病原物细胞/ml。4. 由于有足够的容量空间,可以设置各种对照,消除系统误差和控制 检测系统污染。


.-图1为点阵图。图中i、 ni为阳性对照位点,II为阴性位点,其余 编号为检测位点号。检测位点中,C1-C5表示沙眼衣原体检的5个测位点, Ul-U5表示解脲支原体的5个检测位点;Nl-N5表示淋球菌的5个检测位点。图2为检测引物和探针引物的设计。.图中内侧为探针引物、外侧为检测 引物。
具体实施例方式本发明的实施按如下程序进行l.利用internet网络搜索沙眼衣原体、解脲支原体和淋球菌的核酸序 列,并利用NIH网站上的在线工具检出沙眼衣原体、解脲支原体和淋球菌基 因组中不同于其它微生物的核酸序列,根据获得的沙眼衣原体、解脲支原体 和淋球菌特异序列,每种病原物设计了 IO个以上的个检测位点,通过PCR 扩增标临床样本获得DNA片段;2. 克隆PCR扩增的沙眼衣原体、解脲支原体和淋球菌特异DNA片段, 作为测序确定克隆DNA序列的正确性。用每种病原物的IO个左右的序列制 作检测芯片,按现有的芯片检测方法检测每个DNA片段(靶序列)的可检测 性,再从中挑选5个把序列作为基因芯片检测耙位点。3. 用PCR扩增相应的检测位点和对照位点的长度为100-150bp的DNA片 段作为检测探针,用基因芯片制作专用点样仪按附图的点阵排列点在包被的 载玻片上,即成为基因芯片。芯片制作的具体方法按现有方法制作。4. 使用时,采用与现有基因芯片检测方法基本相同的方法进^S由于样 本来源不同,前期处理有所差异。主要程序如下(1) 取样临床样品按现有临床方法区泌尿生殖道的分泌物。(l)用棉拭子按标准临床取样方法取泌尿生殖道分泌物,在试剂1中洗脱下分泌物,棉拭子靠管壁挤压干,废弃棉拭子(须经灭菌处理),洗脱液4"C保存备用(一周内检测无差异)。(2) 取上一步制备的样本40ul,与2ul阳性对照DNA加入0. 2ml薄壁管 中,放入PCR仪中按照下面程序进行热循环。热循环参数如下65"C30秒; 8。C30秒;65。C90秒;97。C180秒;8。C60秒;65。C180秒;97。C60秒; 65°C 60秒;循环2次。80°C 保持5分钟。(3) 10000rpra离心30秒钟作为临床检测模板,4"C保存备用。(4) 在进行上述操作的同时,取40ul 1XTE和2ul阳性对照DNA加入0.2ml薄壁管与临床样本同时进行上述的(2)和(3)步骤操作,获得阴性对照模板。(5) PCR扩增及标记取3. 5ul临床样本DNA,末端标记有红色荧光的所有检测位点和对照位 点的检测引物,扩增体系为12.5ul,按常规方式进行PCR扩增和标记。同时 作一空白对照反应,并用绿色荧光标记。(6) 取空白对照扩增-标记产物3ul和10ul杂交液加入临床样本扩增-标记管中,充分混匀,全部滴加在预杂交后的芯片矩阵位置;盖上盖玻片。 盖好杂交盒,放入42'C恒温箱杂交4小时。(7) 杂交信号的判断1) .单位点信号判断如果某检测为点的某个单位点的(F635-B635) /B635>2,则该单位点判 为dUTP-Cy5信号阳性,反之为阴性;如果某检测为点的某个单位点的 (F532-B532) /B532》2,则该为点判为dUTP-Cy3信号阳性,反之为阴性。2) 检测有效性判断a. 如果对照位点I的单位点中,dUTP-Cy5和dUTP-Cy3均为阳性的单位点 个数n》2b. 如果对照位点III的单位点中,dUTP-Cy5和dUTP-Cy3均为阳性的单位 点个数n》2c. 如果对照位点II的单位点中,dUTP-Cy5和dUTP-Cy3均为阴性的单位 点个数n》2同时满足上述a、 b、 c条件,该次检测有效;反之无效。 3) .检测位点单位点污染判断如果检测位点中的某个单位点的dUTP-Cy3为阳性,该检测位点的单位点 判为污染。4) 检测位点单位点阳性判断如果检测位点中的某个单位点没有污染,且该单位点dUTP-Cy5为阳性, 该单位点判为阳性,反之判为阴性;如果检测位点中的某个单位点有污染, 该单位点为无效。5) .检测位点阳性判断如果某检测位点的4个单位点中,阳性位点数》2,则判断该检测位点为 阳性,反之为阴性。6) 病原物阳性判断如果某病原物的5个检测位点中,阳性检测位点数》1,则判断该病原物 为阳性,反之为阴性。本发明的试剂盒经过昆明3家三甲医院有关科室的临床考核,灵敏度达到 97-99. 7%;特异性达到99一99, 7%。
检测靶位点序列Organization ApplicantStreet :昆明市髙新区北区9号路,云南省大学科技园A2-507-508 City :昆明市 State :云南省 Country :中国 PostalCode : 650106 PhoneNumber : 0871-8314895 FaxNumber : 0871-8314895 EmailAddress : <110> OrganizationName :昆明云大生化科技有限责任公司Application Project<120〉 Title : <130> A卯FileReference : <140> CurrentAppNumber : <141> CurrentFilingDate :Sequence〈213> OrganismName :沙眼衣原体 <400> PreSequenceString ■■ggaggtaaac gctcctctga agtcttaagc ttggagatta gtcagatttg tttccaacaa 60 gctaccattt ctttctccca gctt犯g幼c cgtcagacag a肪agaggat tattataact 120 tatcctcaga agtttatgca ctttctacaa gagtacatcg gtc肪cgaag aggttttgtc 180 ttcgtaactc gctccggaaa aatg 204 <212> Type : DNA 〈211〉 Length : 204SequenceName :沙眼衣原体检测位点1SequenceDescription :Sequence<213〉 OrganismName :沙眼衣原体 <400> PreSequenceString :tatctttttc tggcggcact gcgtccttgt taaagccaga caagatgtcc tgtagcaatt 60aatggcctga ggaatgtctt gcaagtaa犯gcagccttaa tcgag犯cat gtcgttcaat 120gctcgagacc ataacaaaat tttcttattc tcgtaaagtt gataagaaaa acgttcgtcc 180caggaagaag cccttaagcg 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权利要求
1、三种泌尿生殖道感染病原物的联合检测基因芯片试剂盒,包括基因芯片、检测试剂和检测方法,其特征在于本发明的基因芯片由18位点组成,即选择沙眼衣原体、解脲支原体和淋球菌每种病原物的5个特异的、保守的检测靶序列作为检测位点,同时加入2个为阳性对照位点和1个阴性对照 位点;用PCR方法扩增检测靶位点和对照位点的DNA片段作为探针固定于 包被的载玻片上制成检测基因芯片,然后按基因芯片检测方式检测临床样本 中是否带有病原物。
全文摘要
本发明涉及三种泌尿生殖道感染病原物的联合检测基因芯片试剂盒,属于生物技术领域。本发明的基因芯片由18位点组成,即选择沙眼衣原体、解脲支原体和淋球菌每种病原物的5个特异的、保守的检测靶序列作为检测位点,同时加入2个为阳性对照位点和1个阴性对照位点;用PCR方法扩增检测靶位点和对照位点的DNA片段作为探针固定于包被的载玻片上制成检测基因芯片。芯片矩阵为9X9,每个监测位点重复4次,并按均匀分布排列。试剂盒保证检测过程的全部试剂需要。检测方法包括PCR扩增、分子杂交和荧光标记相结合。本发明具有检测成本低,可消除检测样本的污染,检测特异性和灵敏度高等优点。临床实际应用表明,本发明的灵敏度达到97-99.7%;特异性达到99-99.7%。
文档编号C12Q1/68GK101121946SQ200710065769
公开日2008年2月13日 申请日期2007年4月4日 优先权日2007年4月4日
发明者任永富, 敏 余, 谭德勇, 赖建华, 马明星 申请人:昆明云大生化科技有限责任公司
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