专利名称：一种通路克隆入门载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种通路克隆(Gateway)技术的入门载体，特别是含有光诱导型启动子(PrbcS)和GFP的Gateway入门载体，本发明还涉及该入门载体的构建及应用。
背景技术：
启动子是基因表达调控的重要元件，在数量和质量上调控基因的表达。植物基因工程中常用的启动子按其作用方式及功能可分为组成型启动子和器官特异型启动子。在植物转基因操作中，最常用的一种启动子是来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，这种启动子在植株被CaMV感染期间，指导35S RNA合成，在植物的很多组织中都能高效表达(Odell等，1985；Nature，313810-812)，大多数的研究认为CaMV35S在植物中的表达模式为组成型，它不需要任何诱导作用，也没有很强的器官组织特异性，用CaMV35S驱动的基因表达产生的目标蛋白定位于细胞质中，因此CaMV35S是组成型启动子，目前商业化能提供的植物表达载体都是含有CaMV35S启动子的质粒。用报告基因的研究结果表明CaMV35S的表达在根中最强，在茎、叶片、花和果实中较弱(Jefferson等，1987；EMBO，63901-3907)，因此要用CaMV35S实现目的基因在植物地上部分的器官如叶片中高水平表达同时使所表达的目的蛋白定位到细胞器如叶绿体中是不可能的。
1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)是植物中表达量最大的蛋白质，这种蛋白质的含量占植物细胞中可溶性蛋白的40-50％。Rubisco的小亚基(rbcS)由细胞核基因编码，控制rbcS基因表达的启动子为光诱导型启动子(PrbcS)，在PrbcS的5’上游调控区有光应答元件，此外在该启动子中还有将rbcS定位到叶绿体基质的信号肽序列，PrbcS的表达有很强的组织特异性，需要光信号的诱导，在茎中有低水平的表达，在叶片中的表达最强(Sugita et al.，1987，MGG，209247-256)。用报告基因的研究结果表明在叶片中PrbcS的活性比CaMV35S的高3-4倍，因此PrbcS是一种很强的光诱导型启动子(Jefferson等，1987；EMBO，63901-3907)，在科研工作中PrbcS常被用来实现目的基因在叶片中的高水平表达和目的蛋白在叶绿体中的定位。
Invitrogen公司根据λ噬菌体基因组和大肠杆菌基因组之间的位点专一性重组的分子机制开发了一套分子克隆新技术，即通路克隆(Gateway)技术，Gateway技术的BP反应体系是根据λ噬菌体基因组和大肠杆菌基因组之间的整合机制设计出来的，BP反应是利用PCR产物产生Gateway的入门克隆方法之一。Gateway技术的LR反应体系是根据λ噬菌体基因组从大肠杆菌的基因组中切离的机制设计出来的，利用Gateway的LR反应可以构建目的基因的表达载体。利用限制性内酶和连接酶构建质粒载体时需要对DNA进行切割并回收目标片断，然后用连接酶连接，这是一种费时间又费钱的工作。由于连接产物中被连接成功的质粒含量不高，因此要求用于转化连接产物的感受态细胞的转化效率非常高，才能获得目的基因的克隆。农杆菌介导的植物转化操作使用的表达载体都是分子量很大的质粒载体，用大分子量的质粒载体转化大肠杆菌的感受态细胞时转化效率会降低很多，因此用限制性内酶和连接酶构建大的质粒载体时，即使感受态细胞的转化效率非常高，成功的几率还是很低的。用Gateway技术构建质粒载体时不需要利用限制性内酶和连接酶，它只需要把两种质粒DNA混合并加入DNA整合或切离所需要的蛋白质就能完成新质粒的构建，因此可以节省很多时间。但是目前Invitrogen公司开发的Gateway技术体系中没有植物表达载体，而比利时的VIB/Gent公司开发的Gateway植物表达载体用的启动子都是CaMV35S，这就极大地限制了Gateway技术在植物基因工程操作中的应用。叶片是植物的光合作用器官，在叶绿体中有很多的代谢途径，如果要使目的基因在叶片中获得高水平表达，用PrbcS控制目的基因的表达往往会获得理想的结果。利用Gateway的BP反应可以产生Gateway的入门克隆，但是在实践操作中本申请人发现使用这种技术操作的PCR产物片断较大时成功的几率不高。Invitrogen公司还开发了另外两种产生Gateway入门克隆的方法，其中之一是TOPO克隆技术，但是这种技术的成本较高，如果PCR产物片断较大时成功的机率也不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种通路克隆(Gateway)技术的入门载体，该载体含有光诱导型启动子(PrbcS)和GFP报告基因，同时提供本发明载体在构建含有光诱导型启动子(PrbcS)的目的基因入门克隆质粒中的应用和在利用通路克隆技术的LR反应构建目的基因光诱导型植物表达载体中的应用，以及该载体的构建方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案 通路克隆入门质粒载体，其中含有绿色荧光蛋白GFP基因，还含有1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基基因的光诱导型启动子(PrbcS)。
所述通路克隆入门质粒载体为pENTR-2B*-PrbcS-*T-GFP，还含有Gateway的LR反应所需的attL1和attL2序列。
上述的的载体中绿色荧光蛋白GFP基因可用其它基因代替。
上述通路克隆入门质粒载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP，由下述方法构建而成 (1)用限制性内切酶SphI将pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(由Sugita等构建并提供，Sugita etal.，1987，MGG，209247-256)中的rbcS-3C切割出来，再用连接酶重新连接不含rbcS-3C的载体DNA片断，产生一个中间载体pUC118-PrbcS-T； (2)利用一对互补引物NcoI5和NcoI3，通过点突变技术在pUC118-PrbcS-T的叶绿体定位序列起始密码处引入NcoI位点产生中间载体pUC118-PrbcS-*T； (3)利用一对互补引物HindIII5和HindIII3，通过点突变技术把Gateway的入门载体pENTR-2B多克隆位点中的XmnI位点改为HindIII产生中间载体pENTR*-2B，然后用HindIII和EcoRI切开pENTR*-2B和pUC118-PrbcS-*T，回收pENTR*-2B被切割后产生的载体片断pENTR*及pUC118-PrbcS-*T被切割产生的启动子DNA片断PrbcS-*T，用连接酶把pENTR*和PrbcS-*T连接起来获得中间载体pENTR*-Prbcs-*T； (4)以pGFP为模板，用GFP基因上下游特异性引物扩增GFP基因，获得的PCR产物亚克隆于T载体pUCm-T中，获得中间载体pUCm-T-GFP； (5)用SphI和BamHI切割pENTR*-PrbcS-*T和pUCm-T-GFP，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片断和GFP基因片断，用连接酶连接PENTR*-PrbcS-*T和GFP，获得入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP。
本发明的通路克隆入门质粒载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP的构建方法为 (1)用限制性内切酶SphI将pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(由Sugita等构建并提供，Sugita etal.，1987，MGG，209247-256)中的rbcS-3C切割出来，再用连接酶重新连接不含rbcS-3C的载体DNA片断，产生一个中间载体pUC118-PrbcS-T； (2)利用一对互补引物NcoI5和NcoI3，通过点突变技术在pUC118-PrbcS-T的叶绿体定位序列起始密码处引入NcoI位点产生中间载体pUC118-PrbcS-*T； (3)利用一对互补引物HindIII5和HindIII3，通过点突变技术把pENTR-2B多克隆位点中的XmnI位点改为HindIII产生中间载体pENTR*-2B，然后用HindIII和EcoRI切开pENTR*-2B和pUC118-PrbcS-*T，回收pENTR*-2B被切割后产生的载体片断pENTR*及pUC118-PrbcS-*T被切割产生的启动子DNA片断PrbcS-*T，用连接酶把pENTR*和PrbcS-*T连接起来获得中间载体pENTR*-Prbcs-*T； (4)以pGFP为模板，用GFP基因上下游特异性引物扩增GFP基因，获得的PCR产物亚克隆于T载体pUCm-T中，获得中间载体pUCm-T-GFP； (5)用SphI和BamHI切割pENTR*-PrbcS-*T和pUCm-T-GFP，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片断和GFP基因片断，用连接酶连接PENTR*-PrbcS-*T和GFP，获得入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP。
本发明的通路克隆入门质粒载体在构建含有光诱导型启动子(PrbcS)序列的目基因入门克隆质粒中的应用；以及在利用通路克隆技术的LR反应构建目的基因光诱导型植物表达载体中的应用。
本发明利用限制性内酶和连接酶的技术把PrbcS启动子和GFP报告基因插入到Gateway入门载体pENTR-2B的多克隆位点中，获得一个含有光诱导型启动子(PrbcS)序列和GFP报告基因的Gateway入门载体，用其他目的基因替换该载体中的GFP基因，通过Gateway的LR反应就能快速地构建目的基因的光诱导型植物表达载体，在所获得的表达载体中目的基因的表达受PrbcS的控制。
本发明使用的光诱导型启动子(PrbcS)是从番茄的基因组中分离出来的rbcS-3C的启动子，是一个由HindIII切割产生的1.7kb的DNA片断，已经亚克隆于pUC118中(Sugita et al.，1987，MGG，209247-256)，该亚克隆的质粒载体名称为pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(图1)。
本发明采用Gateway的入门载体pENTR-2B(图2)为基本骨架构建一个含有光诱导型启动子(PrbcS)序列的Gateway入门载体。本发明使用的报告基因GFP来自Invitrogen公司的pGFP中的GFP(图4)。
在构建该入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP时，首先用限制性内切酶SphI将pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS-3C切割出来，然后用连接酶重新连接不含rbcS-3C的载体DNA片断，产生一个中间载体pUC118-PrbcS-T(图1)。
为了能够建由启动子PrbcS控制，表达的目的蛋白能定位在叶片细胞质中的目的基因的植物表达载体，本发明还利用一对互补引物(图1)，通过点突变技术在pUC118-PrbcS-T的叶绿体定位序列起始密码处引入NcoI位点产生中间载体pUC118-PrbcS-*T。
本发明还利用一对互补引物(图2)，通过点突变技术把pENTR-2B多克隆位点中的XmnI位点改为HindIII产生中间载体pENTR*-2B，然后用HindIII和EcoRI切开pENTR*-2B和pUC118-PrbcS-*T，回收pENTR*-2B被切割后产生的载体片断pENTR*及pUC118-PrbcS-*T被切割产生的启动子DNA片断PrbcS-*T，用连接酶把pENTR*和PrbcS-*T连接起来获得中间载体pENTR*-Prbcs-*T(图3)。
以pGFP为模板，用GFP基因上下游特异性引物扩增GFP基因，获得的PCR产物亚克隆于T载体pUCm-T中，获得中间载体pUCm-T-GFP(图4)。
用SphI和BamHI切割pENTR*-PrbcS-*T和pUCm-T-GFP，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片断和GFP基因片断，用连接酶连接PENTR*-PrbcS-*T和GFP，获得入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP(图6)。
图1中间载体pUC118-PrbcS-*T的构建策略 用SphI把pUC118-Prbcs-rbcS-3c中的rbcS-3C切除，并使载体自连接形成pUC118-Prbcs-T，通过点突变技术在叶绿体定位序列的起始密码子附近相入Ncol位点。
图2中间载体pENTR*-2B的构建策略 通过点突变技术把pENTR2B多克隆位点中的Xmnl改变为HindIII。
图3中间载体pENTR*-Prbcs-*T的构建策略 把PrbcS-T亚克隆于pENTR2B*中产生pENTR*-Prbcs-*T。
图4GFP基因的TA克隆策略 以pGFP为模板通过PCR扩增GFP基因并亚克隆于T载体中。
图5GFP基因的核苷酸序列和TA克隆 A电泳检测GFP的PCR产物。1,500bp DNA Maker；2-4，GFP的PCR产物。BpUCm-T-GFP质粒的电泳检测。1，正对照(分子量为3.4kb的质粒)；2～4，pUCm-T-GFP质粒。CpUCm-T-GFP质粒的酶切检测。1,500bpDNA Maker；2-4，用PstI酶切pUCm-T-GFP质粒。
图6入门载体pENTR*-Prbcs-*T-GFP的构建策略 把GFP亚克隆于pENTR*-Prbcs-*T中产生pENTR*-Prbcs-*T-GFP。
图7pENTR*-Prbcs-*T-GFP的构建 ApENTR*-PrbcS-*T-GFP质粒的电泳检测。1-2，pENTR*-PrbcS-*T-GFP；3正对照(分子量为4.7kb的质粒)。BpENTR*-PrbcS-*T-GFP质粒的酶切检测。1-2，用SphI和BamHI酶切pENTR*-PrbcS-*T-GFP质粒；3DNA Marker。CpENTR*-PrbcS-*T-GFP的PCR检测。1-2，以pENTR*-rbcS-*T-GFP为模板用引物GFP5和GFP3扩增到的PCR产物；3，正对照(以pUCm-T-GFP质粒为模板扩增到的PCR产物)；4，DNA Marker。
图8通过Gateway的LR反应产生pK2-35S-PrbcS-*T-GFP的策略； 图9pK2-35S-PrbcS-*T-GFP质粒的构建 A电泳检测pK2-35S-PrbcS-*T-GFP。1-2，pK2-35S-PrbcS-*T-GFP质粒；3，正对照(分子量为12.5kb的质粒)。BpK2-35S-PrbcS-*T-GFP质粒的酶切检测。1，DNA Maker；2，用HindIII和EcoRI酶切pK2-35S-PrbcS-*T-GFP质粒；3，用HindIII和EcoRI酶切pENTR*-PrbcS-*T-GFP；4，用HindIII和EcoRI酶切pK2GW7。CPCR检测pK2-35S-PrbcS-*T-GFP。1，DNA Maker；2-4，以pk2-35S-PrbcS-*T-GFP质粒为模板，用引物attB1和GUS3扩增到的PCR产物。
图10GUS基因的扩增与TA克隆策略 图11GUS基因的核苷酸序列与TA克隆 A电用检测GUS基因的PCR产物。1，DNA Makerer；2-4，GUS基因的PCR产物。B电泳检测pUCm-T-GUS质粒。1，正对照(分子量为4.7kb的质粒)；2-3，pUCm-T-GUS质粒。CpUCm-T-GUS质粒的酶切检测。1，λDNA/HindIII；2-3，用SphI和BamHI酶切pUCm-T-GUS质粒。
图12用GUS基因替换pENTR*-PrbcS-*T-GFP中的GFP产生pENTR*-Prbcs-*T-GUS的策略 图13入门克隆pENTR*-Prbcs-*T-GUS的构建 A电泳检测pENTR*-PrbcS-*T-GUS。1-2，pENTR*-PrbcS-*T-GUS；3正对照(分子量为6.2kb的质粒)。
BpENTR*-PrbcS-*T-GUS质粒的酶切检测。1，DNA Maker；2-3，用HindIIII和BamHI酶切pENTR*-PrbcS-*T-GUS质粒。CPCR检测pENTR*-PrbcS-*T-GUS质粒。1-3，以pENTR*-PrbcS-*T-GUS质粒为模板，用引物GUS5和GUS3扩增到的PCR产物；4DNA Maker。
图14通过Gateway的LR反应产生pK2-35S-Prbcs-T-GUS的策略 图15pK2-35S-Prbcs-T-GUS质粒的构建 A电泳检测pK2-35S-PrbcS-*T-GUS质粒。1-3，pK2-35S-PrbcS-*T-GUS；4正对照(分子量为14kb的质粒)。BPCR检测pK2-35S-PrbcS-*T-GUS质粒。1，DNA Maker；2-4，以pK2-35S-PrbcS-*T-GUS质粒为模板，用引物GUS5和GUS3扩增得到的PCR产物。CpK2-35S-PrbcS-T-GUS质粒的酶切检测。1，λDNA/HindIII；2-4，用pstI酶切pK2-35S-PrbcS-*T-GUS质粒。
图16GFP的组成型和诱导型植物表达载体 图17GUS的组成型和诱导型植物表达载体 图18农杆菌转化子菌落的PCR检测 AGFP的农杆菌菌落PCR产物。1，DNA Maker；2，转化pPZP211-PrbcS-*T-GFP的农杆菌；3，转化pK2-35S-PrbcS-*T-GFP的农杆菌；4，转化pK2-35S-GFP的农杆菌。BGUS的农杆菌菌落PCR产物。1，正对照(以pK2-35S-PrbcS-*T-GUS质粒为模板扩增得到的PCR产物)；2，转化pPZP211-PrbcS-*T-GUS的农杆菌；3，转化pK2-35S-PrbcS-*T-GUS的农杆菌；4，转化pK2-35S-GUS的农杆菌；5，DNA Maker。
图19GFP基因转基因愈伤组织的荧光观察 A转化pPZP211-PrbcS-*T-GFP的天竺葵叶柄(诱导型表达)。B转化pK2-35S-PrbcS-*T-GFP的天竺葵叶柄。C转化pK2-35S-GFP的天竺葵叶柄(组成型表达)。D转化pPZP211-PrbcS-GFP的烟草叶盘(诱导型表达)。E转化pK2-35S-PrbcS-*T-GFP的烟草叶盘。F转化pK2-35S-GFP的烟草叶盘(组成型表达)。G对照烟草(未经农杆菌转化的叶盘)。H对照天竺葵(未经农杆菌转化的叶柄)。
图20GFP在转基因烟草中的插入情况和转录水平检测 A用PCR(引物为GFP5和GFP3)检测GFP在转基因烟草中的插入情况。1，DNA marker；2wt(未转基因的野生型植物)；3-5组成型表达株系；6-8，转pK2-35S-PrbcS-*T-GFP烟草株系；9-11诱导型表达株系；12正对照(以pK2-35S-PrbcS-*T-GFP质粒为模板扩增得到的PCR产物)。BRT-PCR(引物为GFP5和GFP3)检测GFP在转基因烟草中的转录水平。1，DNA markerIII；2，wt(未转基因的野生型)；3，组成型表达株系；4-5，转pK2-35S-PrbcS-*T-GFP烟草；6，诱导型表达株系；7正对照(以pK2-35S-PrbcS-*T-GFP质粒为模板扩增得到的PCR产物)。CGFP组成型表达的RT-PCR检测(引物为attB1和GFP3)。1，正对照(以pK2-35S-GFP质粒为模板扩增得到的PCR产物)；2-3，转化pK2-35S-GFP烟草株系；4，DNA marker。D转pK2-35S-PrbcS-*T-GFP烟草GFP组成型表达转录物的RT-PCR检测(引物为attB1和GFP3)。1，DNA marker；2～4，引物为attB1和GFP3；6～8PCR引物为rbcS5和GFP3；5和9，正对照(以pK2-35S-PrbcS-*T-GFP质粒为模板扩增得到的PCR产物)。
图21GUS在转基因烟草中的插入情况和转录水平检测 AGUS基因在转基因烟草中的插入情况的PCR检测(引物为GUS5和GUS3)。1，DNA marker；2～4，转pK2-35S-PrbcS-*T-GUS烟草株系；5wt(未转基因的野生型)；6正对照(以pK2-35S-PrbcS-*T-GUS质粒为模板扩增得到的PCR产物)。BRT-PCR(引物为GUS5和GUS3)检测GFP在转基因烟草中的转录水平。1，DNA marker；2-3，转pK2-35S-PrbcS-*T-GUS烟草株系；4，正对照；5wt。
图22转基因植物的GUS染色分析 Awt(未转基因的野生型叶片)；B转pK2-35S-GUS的叶片；C转pPZP211-PrbcS-*T-GUS的叶片； D转pK2-35S-PrbcS-*T-GUS的叶片。
图23GFP和GUS基因表达水平的定量分析 A转GFP天竺葵植株叶片的GFP荧光定量分析；B转GUS烟草植株叶片的GUS定量分析。
具体实施例方式 下面结合附图用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明。
本发明下述实施例中所用到的试剂与仪器为 试剂主要为分子生物学实验试剂，其余试剂均为国产分析纯。
仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。
本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、中间载体pUC118-T-PrbcS的构建 用质粒抽提试剂盒(博大泰克)纯化(按试剂盒说明书操作)pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(由Sugita等构建并提供，Sugita et al.，1987，MGG，209247-256)，用限制性内切酶SphI(Fermentas)将pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS-3C切割出来，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体pUC118-PrbcS-T和rbcS-3C片段，回收4.6kb的载体pUC118-PrbcS-T，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接(按试剂盒说明书操作)不含rbcS-3C的载体DNA片断，产生一个中间载体pUC118-PrbcS-T(图1)，用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素(Amp，100μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒，用SphI进行酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上只产生一条4.6kb条带，选出连接成功的质粒载体pUC118-PrbcS-T，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。
实施例2、利用点突变技术在中间载体pUC118-T-PrbcS中引入NcoI位点 以纯化质粒pUC118-Prbcs-T为模板，根据叶绿体定位序列设计一对用于点突变的互补引物(NcoI5和NcoI3，图1)，委托TaKaRa合成。在点突变反应混合液中加入25ng的纯化质粒pUC118-PrbcS-T作为模板，同时加入125ng的点突变引物NcoI5和NcoI3、1μldNTP(2.5mM)，5μl的10×KOD反应Buffer和1μl的KOD聚合酶(日本东洋纺)，加双蒸水使反应终体积为50μl。在PCR仪上于95℃加热30秒，然后按照95℃、30秒，55℃、1分钟，68℃、10分钟的程序进行15个循环的反应，最后在68℃延长反应10分钟，合成含突变位点的子链。反应完成后把反应混合液置于冰上冷却2分钟，向反应混合液加入1μl的限制性内切酶Dpn I(10U/μl)和5μl的Dpn I反应缓冲液，于37℃保温1小时，降解不含突变位点的母链。用反应混合液转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素(Amp，100μg/ml)的平板上，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒，用NcoI(Fermentas)进行酶切检测，突变成功的质粒可被NcoI切开并在琼脂糖凝胶电泳图上产生一条4.6kb的条带，选出突变成功的质粒载体pUC118-PrbcS-*T，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。在pUC118-PrbcS-T的叶绿体定位序列起始密码处引入NcoI位点后，为构建由启动子PrbcS控制，表达的目的蛋白定位在叶片细胞质中的目的基因的植物表达载体奠定基础。
实施例3、利用点突变技术把Gateway的入门载体pENTR-2B多克隆位点中的XmnI改变为HindIII 以纯化质粒pENTR-2B(购自invitrogen公司)为模板，根据XmnI附近的序列设计一对(HindIII5和HindIII3)用于点突变的互补引物(图2)，委托上海申能博采合成。在点突变反应混合液中加入25ng的纯化质粒pENTR-2B作为模板，同时加入125ng的点突变引物HindIII5和HindIII3、1μldNTP(2.5mM)，5μl的10×KOD反应Buffer和1μl的KOD聚合酶(日本东洋纺)，加双蒸水使反应终体积为50μl。在PCR仪上于95℃加热30秒，然后按照95℃、30秒，55℃、1分钟，68℃、10分钟的程序进行15个循环的反应，最后在68℃延长反应10分钟，合成含突变位点的子链。反应完成后把反应混合液置于冰上冷却2分钟，向反应混合液加入1μl的限制性内切酶Dpn I(10U/μl)和5μl的Dpn I反应缓冲液(晶美)，于37℃保温1小时，降解不含突变位点的母链。用反应混合液转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素(Amp，100μg/ml)的平板上，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒，用HindIII(晶美)进行酶切检测，突变成功的质粒可被HindIII切开并在琼脂糖凝胶电泳图上产生一条3.5kb的条带，选出突变成功的质粒载体pENTR*-2B，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。
实施例4、中间载体pENTR*-Prbcs-*T的构建 用HindIII和EcoRI切开纯化的质粒载体pENTR*-2B和pUC118-PrbcS-*T，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，回收pENTR*-2B被切割后产生的载体片断pENTR*(2.3kb)及pUC118-PrbcS-*T被切割产生的启动子DNA片断PrbcS-*T(1.7kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTR*和PrbcS-*T产生中间载体pENTR*-Prbcs-*T(图3)。用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒，用HindIII和SphI双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上只产生两条带，一条为2.3kb的载体带，另一条为1.7kb的插入片段PrbcS-*T。选出连接成功的质粒载体pENTR*-PrbcS-*T，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。
实施例5、GFP基因的扩增与TA克隆 以纯化质粒pGFP为模板，根据GFP基因序列(图5)设计一对(GFP5和GFP3)特异性引物(图4)，委托北京博迈德公司合成。在PCR反应混合液中加入20ng的纯化质粒pGFP作为模板，同时加入75ng的特异性引物GFP5和GFP3、4μldNTP(2.5mM)，5μl的10×Extaq反应Buffer和0.25μl的Extaq(5U/μl)聚合酶(日本宝生物)，加双蒸水使反应终体积为50μl。在PCR仪上于94℃加热2分钟，然后按照94℃、30秒，55℃、30秒，72℃、1分钟的程序进行30个循环的反应，最后在72℃延长反应10分钟，扩增GFP基因。反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离GFP的PCR扩增产物(图5A)，回收GFP基因的DNA片断，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接GFP基因的DNA片断和上海申能博采的T载体pUCm-T，获得GFP基因的TA克隆质粒pUCm-T-GFP(图4)。用反应混合液转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素(Amp，100μg/ml)的平板上，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒(图5B)，在T载体pUCm-T的两个多克隆位点中都有PstI，但在GFP基因中没有这一酶切位点，因此选用PstI(晶美)对重组质粒进行酶切检测，连接成功的质粒可被PstI切开并在琼脂糖凝胶电泳图上产生一条2.7kb的载体带和一条0.7kb的GFP基因条带(图5C)，选出连接成功的质粒载体pUCm-T-GFP，用GFP基因上下游特异性引物GFP5和GFP3进行PCR检测，都能扩增出一条0.7kb的条带，再次确认是连接成功的质粒，然后重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pUCm-T-GFP。
实施例6、Gateway入门克隆载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP的构建 用SphI和BamHI切开纯化的质粒载体pENTR*-PrbcS-*T和pUCm-T-GFP(图6)，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pENTR*-PrbcS-*T被切割后产生的载体片断(4.0kb)及pUCm-T-GFP被切割产生的GFP基因的DNA片断(0.7kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTR*-PrbcS-*T和GFP基因的DNA片断产生入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP(图6)。用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒(图7A)，用SphI(Fermentas)和BamHI(Fermentas)双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上只产生两条带，一条为4.0kb的载体带，另一条为0.7kb的GFP片段(图7B)。选出连接成功的质粒载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP，用GFP上下游的特异性引物GFP5和GFP3进行PCR检测，都能扩增出一条0.7kb的GFP条带(图7C)，确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pENTR*-PrbcS-*T-GFP。
实施例7、GFP基因植物表达载体的构建 通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-GFP亚克隆到植物表达载体pK2GW7(Gateway的目的载体，购自比利时VIB/Gent公司)中(图8)。具体的做法是用质粒抽提试剂盒纯化Gateway的目的载体pK2GW7，在Gateway的LR反应体系中加pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pK2GW7各150ng，1ul LR Clonase II Enzyme Mix(Invitrogen)，混均于25℃反应过夜，通过整合酶的作用把PrbcS-*T-GFP整合到pK2GW7中获得GFP的植物表达载体质粒pK2-35S-PrbcS-*T-GFP(图8)。用反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落，从Spe抗性重组子菌落中提取质粒(图9A)，用HindIII(Fermentas)和EcoRI(Fermentas)双酶切检测，整合成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生三条带，第一条为9.6kb的载体带，第二条为2.4kb的PrbcS-*T-GFP片段，第三条为0.4kb的P35S启动子带(图9B)。选出整合成功的质粒载体pK2-35S-PrbcS-*T-GFP，用attB1位点的特异性引物attB1和GFP基因下游特异性引物GFP3进行PCR检测，能扩增出一条2.4kb的PrbcS-*T-GFP条带(图9C)，确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。pK2GW7携带的筛选标记基因为卡那霉素抗性基因(Km)，这样可用加有Km的平板筛选转基因植物。
实施例8、GUS基因的扩增与TA克隆 为了验证入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP的应用价值，用另一个报告基因GUS替换pENTR*-Prbcs-*T-GFP中的GFP，通过这种方法快速构建GUS的植物表达载体，然后通过GUS染色观察它的表达水平。以纯化质粒pENTR-GUS(购自Invitrogen)为模板，根据GUS基因序列(图11)设计一对(GUS5和GUS3)特异性引物(图10)，委托赛百盛合成。在PCR反应混合液中加入20ng的纯化质粒pENTR-GUS作为模板，同时加入75ng的特异性引物GUS5和GUS3、4μldNTP(2.5mM)，5μl的10×Extaq反应Buffer和0.25μl的Extaq(5U/μl)聚合酶(日本宝生物)，加双蒸水使反应终体积为50μl。在PCR仪上于94℃加热2分钟，然后按照94℃、30秒，55℃、30秒，72℃、2分钟的程序进行30个循环的反应，最后在72℃延长反应10分钟，扩增GUS基因。反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离GUS的PCR扩增产物(图11A)，回收GUS基因的DNA片断，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接GUS基因的DNA片断和上海申能博采的T载体pUCm-T，获得GUS基因的TA克隆质粒pUCm-T-GUS(图10)。用反应混合液转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素(Amp，100μg/ml)的平板上，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒(图11B)，用SphI(Fermentas)和BamHI(Fermentas)进行双酶切检测，连接成功的质粒可被SphI和BamHI切开并在琼脂糖凝胶电泳图上产生二条带，一条为2.7kb的载体带，令一条为1.8kb的GUS带(图11C)，选出连接成功的质粒载体pUCm-T-GUS，用GUS基因上下游特异性引物进行PCR检测，再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pUCm-T-GUS。
实施例9、Gateway入门克隆载体pENTR*-PrbcS-*T-GUS的构建 用SphI(Fermentas)和BamHI(Fermentas)切开纯化的质粒载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pUCm-T-GUS，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段(图12)，从凝胶中回收pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割后产生的载体片断pENTR*-PrbcS-*T(4.0kb)及pUCm-T-GUS被切割产生的GUS基因的DNA片断(1.8kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTR*-PrbcS-*T和GUS基因的DNA片断产生入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GUS(图12)。用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒(图13A)，用HindIII(Fermentas)和BamHI(Fermentas)双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生两条带，一条为2.3kb的载体带，另一条为3.5kb的插入片段PrbcS-*T-GUS(图13B)。选出连接成功的质粒载体pENTR*-PrbcS-*T-GUS，用GUS基因上下游特异性引物进行PCR检测(图13C)，再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pENTR*-PrbcS-*T-GUS。
实施例10、GUS基因植物表达载体的构建 通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-GUS亚克隆到植物表达载体pK2GW7(Gateway的目的载体，购自比利时VIB/Gent公司)中。具体的做法是用质粒抽提试剂盒纯化Gateway的目的载体pK2GW7，在Gateway的LR反应体系中加pENTR*-PrbcS-*T-GUS和pK2GW7各150ng，1μl LRClonase II Enzyme Mix(Invitrogen)，混均于25℃反应过夜，通过整合酶的作用把PrbcS-*T-GUS整合到pK2GW7中获得GUS的植物表达载体质粒pK2-35S-PrbcS-*T-GUS(图14)。用反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落，从Spe抗性重组子菌落中提取质粒(图15A)，用GUS上下游的特异性引物GUS5和GUS3进行PCR检测(图15B)。选出整合成功的质粒载体pK2-35S-PrbcS-*T-GUS，用PstI(Fermentas)酶切检测，整合成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生二条带，一条为9.6kb的载体带，第二条为3.5kb的PrbcS-*T-GUS片段(图15C)，能扩增出一条1.8kb的GUS条带，确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。
实施例11、GFP基因植物组成型表达和诱导型表达载体的构建 为了能比较用本发明方法构建出来的GFP基因的植物表达载体的表达效率与GFP基因的组成型表达和诱导型表达的差异，还构建了GFP基因的植物组成型表达载体和诱导型表达载体。具体的做法是以pGFP为模板，用高保真的KOD聚合酶(日本东洋纺)通过PCR(94℃、30秒，55℃、30秒，68℃、1分钟的程序进行30个循环的反应)扩增GFP基因，用琼脂糖凝胶电泳分离回收GFP的PCR产物，利用TOPO克隆技术亚克隆于pENTR/SD/D-TOPO(购自Invitrogen公司)载体中获得GFP的Gateway入门克隆载体pENTR-GFP，通过Gateway的LR反应使入门克隆载体pENTR-GFP和pK2GW7发生整合作用，用GFP替换pK2GW7中的GW7获得GFP基因的组成型表达载体pK2-35S-GFP(图16)，在该载体中GFP的表达受组成型启动子CaMV35S的控制。用HindIII和BamHI切开纯化的质粒载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pPZP211(Hajdukiewicz等构建并提供，Hajdukiewicz et al.，Plant Mol.Biol.25，989(1994))，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割后产生的DNA片断PrbcS-*T-GFP(2.4kb)及pPZP211被切割产生的载体DNA片断(8.5kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接载体DNA片断和PrbcS-*T-GFP的DNA片断产生GFP基因的诱导型表达载体pPZP211-PrbcS-*T-GFP(图16)。用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe，100μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落，从抗性重组子菌落中提取质粒PZP211-PrbcS-*T-GFP。
实施例12、GUS基因植物组成型表达和诱导型表达载体的构建 同样为了能比较用本发明方法构建出来的GUS基因的植物表达载体的表达效率与GUS基因的组成型表达和诱导型表达的差异，还构建了GUS基因的植物组成型表达载体和诱导型表达载体。具体的做法是通过Gateway的LR反应使入门克隆载体pENTR-GUS(购自Invotrogen)和pK2GW7发生整合作用，用GUS替换pK2GW7中的GW7获得GUS基因的组成型表达载体pK2-35S-GUS(图17)，在该载体中GFP的表达受组成型启动子CaMV35S的控制。用HindIII(Fermentas)和BamHI(Fermentas)切开纯化的质粒载体pENTR*-PrbcS-*T-GUS和pPZP211，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pENTR*-PrbcS-*T-GUS被切割后产生的DNA片断PrbcS-*T-GUS(3.5kb)及pPZP211被切割产生的载体DNA片断(8.5kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接PrbcS-*T-GUS和载体DNA片断产生GUS基因的诱导型表达载体pPZP211-PrbcS-*T-GUS(图17)。用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe，100μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落，从抗性重组子菌落中提取质粒pPZP211-PrbcS-*T-GUS。
实施例13、用GFP和GUS基因的植物表达载体转化农杆菌 制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-GFP、pK2-35S-GFP、pPZP211-PrbcS-*T-GFP、pK2-35S-PrbcS-*T-GUS、pK2-35S-GUS、pPZP211-PrbcS-*T-GUS转入农杆菌(C58Cl(pPMP90))中，在加有壮观霉素的平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电转化仪(BIO-RAD)滑槽中，用1mm的电击杯和200欧姆，2.5kV/0.2cm的参数进行电击，电击后立即取出电转化杯，迅速加入0.5mlSOC培养基，混匀，转移到1.5ml的离心管中；28℃，200rpm摇床培养3-5h；室温下，7500rpm离心1min，弃大部分上清，保留100μl将细胞悬浮；把农杆菌涂布于有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的LB固体培养基上，28℃培养2天获得单菌落；首先用牙签挑取农杆菌菌落放入20μl ddH2O中，98℃处理15分钟后取出10μl农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。用GFP和GUS基因上下游特异性引物作PCR检测，转化成功的菌落均能扩增出0.7kb的GFP(图18A)和1.8kb的GUS基因条带(图18B)，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。
实施例14、用含有GFP和GUS基因植物表达载体的农杆菌转化植物 挑取携带有pK2-35S-PrbcS-*T-GFP、pK2-35S-GFP、pPZP211-PrbcS-*T-GFP、pK2-35S-PrbcS-*T-GUS、pK2-35S-GUS、pPZP211-PrbcS-*T-GUS质粒的农杆菌单菌落接种于50ml的LB培养基中(含Spe，100μg/ml)，180rpm，28℃培养24h，待菌液OD600至1.0左右，离心10min(3000rpm)，沉淀菌体。再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，离心10min(3000rpm)，沉淀菌体。重复以上操作2～3次。最后加入一定体积的MS液体培养基重悬浮，使菌体的OD600值为0.5。选取两种容易转化的植物烟草和天竺葵作转化试验。制备烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanth)和天竺葵(Pelargonium sp.frensham)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，用叶柄法转化天竺葵，然后通过组织培养获得小苗，进一步筛选获得所需的转基因植物。把无菌烟草的叶片切成小片叶盘，把天竺葵的叶柄切成小段，在制备好的农杆菌菌液中浸染15-20min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MS1(MS+NAA02.1μg/ml+BAPO.02μg/ml)上黑暗共培养2天，将外植体转移至含卡那霉素(50μg/ml)的芽诱导培养基MS4(MS+NAA0.53μg/ml+BAP0.5μg/ml)上进行芽的诱导，约15天继代一次。待有芽生成后，转入含卡那霉素(50μg/ml)的MS培养基上进行根的诱导。
实施例15、GFP的荧光观察 待烟草叶盘和天竺葵叶柄在MS4培养基上生长1-2周后，选取部分用GFP的表达载体转化的烟草叶盘和天竺葵叶柄产生的愈伤组织，放置于载玻片上，使用连续变倍体视显微镜观察GFP的表达情况。先用显微镜光源观察愈伤组织(明场)的生长情况并拍照。然后关掉光源，使用紫外灯(便携式紫外灯)照射愈伤组织观察(暗场)愈伤组织中的GFP亮点并拍照。结果观察到用本发明的方法构建的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-GFP(图19C和F)转化的植物产生的愈伤组织和用pK2-35S-GFP(图19B和E)及pPZP211-PrbcS-*T-GFP(图19A和D)转化植物后产生的愈伤组织一样有GFP的荧光(图19)，荧光的亮度一样，说明用载体pK2-35S-PrbcS-*T-GFP转化植物组织后可以实现GFP基因的正常表达，未转化的烟草叶盘和天竺葵叶柄产生的愈伤组织在同样的条件下观察没有GFP的荧光(图19G和H)。
实施例16、GFP和GUS基因在转基因植物的插入情况和转录水平的检测 为了确认从转化的烟草叶盘产生的转基因烟草株系确实含有GFP基因和GUS基因，用PCR方法对筛选到的转基因烟草作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组称取植物叶片100mg左右置于1.5ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入900μl预热到65℃的2×CTAB缓冲液(Tris-HCl pH 7.5100mM，EDTA 20mM，NaCl 1.4M，CTAB 2％)，65℃度水浴加热20分钟后取出冷却；加入500μl氯仿-异戊醇混合液(24∶1)摇匀，4℃离心10min(7500rpm)后转移上清至1.5ml EP管；再次加入500μl氯仿-异戊醇混合液(24∶1)摇匀，4℃离心10min(7500rpm)；取出上清置于新的EP管中，加入1/10体积3MpH5.2醋酸钠和等体积异丙醇，摇匀后4℃离心20min(12000rpm)；弃上清，用75％乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase的TE缓冲液溶解并降解RNA。以植物基因组DNA为模板，用GFP基因和GUS基因上下游特异性引物作PCR检测，成功转入GFP基因的植株均能扩增出0.7kb的GFP条带(图20A)，成功转入GUS基因的植株均能扩增出1.8kb的GUS条带(图21A)。经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析。
为了考察在含有GFP基因和GUS基因的转基因烟草株系中GFP基因和GUS基因的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA，反转绿成cDNA后用于RT-PCR分析，检测GFP基因和GUS基因在转基因植物中的转录水平。采用TRIzoL Reagent(Invitrogen)提取RNA，取植物嫩叶约0.1g，加入1ml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡混匀，离心15min(12000rpm)，转移上清液至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min，4℃离心10min(12000rpm)，弃上清，沉淀用75％乙醇1ml清洗，4℃离心5min(7500rpm)，弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解RNA。使用RevertAidTM M-MuLVReverse Transcriptase Kit(Fermentas)进行cDNA的合成，取植物总RNA约0.1μg-5μg，oligo(dT)50ng，10mM dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl(5×reaction buffer 4μl，25mM MgCl2 4μl，0.1MDTT 2μl，RNA酶抑制剂1μl)，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μl RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用GFP和GUS基因上下游特异性引物作PCR，成功转入GFP的植株均能扩增出0.7kb的GFP(图20B)，成功转入GUS基因的植株均能扩增出1.8kb的GUS条带(图21B)，证明GFP和GUS基因可以在转基因植物中成功地转录。经RT-PCR确认的转基因植株用于GFP的定量分析和GUS的染色分析。由于在pK2-35S-PrbcS-*T-GFP中有35S启动子，用一个位于35S转录起始点下游的引物(attB1)和位于PrbcS启动子内部的另一个引物(rbcS5)及GFP3引物作RT-PCR分析，考察转化pK2-35S-PrbcS-*T-GFP的转基因植物中是否有GFP的组成型转录物。结果证明只有在转化pK2-35S-GFP的转基因烟草中有GFP的组成型转录物(图20C)，而在转化pK2-35S-PrbcS-*T-GFP的烟草中没有GFP的组成型转录物(图20D)，说明在该载体中的35S启动子没有作用，而只有诱导型启动子PrbcS起作用。
实施例17GUS的染色分析 GUS的染色分析按照(Zhao等，2001；Science，291306-309)的方法进行，选取在无菌条件下于MS培养基上生长的烟草植株的第三张(自上往下数)叶片浸入GUS染色液(80mM硫酸钠盐缓冲液(pH7.0)，0.4mM亚铁氰化钾，0.4mM铁氰化钾，8mMEDTA，0.05％ Triton-100，0.8mg/ml X-Gluc，20％甲醇)中，抽真空30min，37℃保温过夜，去除GUS染色液，加入75％乙醇，37℃脱色3小时，重复2～3次。结果观察到用本发明的方法构建的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-GUS(图22D)转化烟草叶盘产生的转基因植株叶片和用pPZP211-PrbcS-*T-GUS(图22C)转化烟草叶盘产生的转基因植株的叶片一样，GUS的染色范围很广，着色的程度很深，说明在用载体pK2-35S-PrbcS-*T-GUS转化植物产生的转基因烟草叶片中GUS基因的表达水平可以达到诱导型表达的水平，用pK2-35S-GUS转化烟草叶盘产生的转基因植株的叶片仅有很少的部位能染上色(图22B)，再次证明用组成型启动子很难实现目的基因在叶片中的高水平表达，没有转染的烟草叶片没有着色(图22A)。
实施例18GFP的定量分析和GUS的定量分析 通过GFP荧光定量分析可以更准确地了解GFP在转基因植物叶片中的表达水平，具体的做法是取1g新鲜烟草叶片，加入1ml蛋白抽提液(50mM Tris-HCl pH7.5，10％甘油，10mM β-巯基乙醇，1mMPMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)，2mMEDTA，10％PVP(polyvinylpyrrolidone))，研磨。于12000rpm，4℃，离心25min，取上清。用Bradford方法测定植物上清中的蛋白质浓度。取1mg蛋白样品加入纯水到终体积2ml，使用荧光分光光度计(发射光488nm，吸收光510nm)测定510nm处的吸收峰值。结果说明在转化pK2-35S-PrbcS-*T-GFP的转基因植物叶片中GFP的荧光强度与转化pPZP211-PrbcS-*T-GFP的转基因植物相似，是转化pK2-35S-GFP的植物2-3倍(图23A)。
通过GUS定量分析可以更准确地了解GUS在转基因植物叶片中的表达水平，GUS的定量分析按照(Jefferson等，1987；EMBO，63901-3907)的方法进行，具体做法是称取新鲜烟草叶片组织0.5-1g，在液氮中磨碎植物组织，加入100ul抽提缓冲液(50mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.0，10mMEDTA，0.1％ Triton X-100，0.1％十二烷基肌酸钠，10mM β-巯基乙醇)。15000rpm离心5min 4℃，转移上清，用Bradford方法测定上清液中蛋白质的浓度。在新的EP管中加入100μg蛋白质溶液和assay buffer(1mM MUG(4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronic acid)，37℃保温)到终体积为200ul，混匀。在0时刻，取出20μl混合液加入180μl 0.2M stop Buffer(0.2M Na2CO3)终止反应此时为计为T0。其余混合物37℃保温，在12小时时刻，取出20μl加入180μl 0.2M stopBuffer终止反应此时计为T12。用荧光分光光度计(BIO-RAD VersaFlourTMFluorometer)确定MU(Methylumbelliferone)的浓度(发射光365nm，吸收光455nm)。用1mM MU按10μM，1μM，500nM，100nM，50nM，10nM(分别加入0.2M Na2CO3)梯度制备MU的标准曲线。结果说明在转化pK2-35S-PrbcS-*T-GUS的转基因植物叶片中GUS的活性与转化pPZP211-PrbcS-*T-GUS的转基因植物相似，是转化pK2-35S-GUS的植物1-2倍(图23B)。
权利要求
1、通路克隆入门质粒载体，其中含有绿色荧光蛋白GFP基因。
2、权利要求1的载体，其中还含有1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基基因的光诱导型启动子(PrbcS)。
3、权利要求1或2的载体，所述载体是如图6所示的pENTR*-PrbcS-*T-GFP载体。
4、权利要求1或2的载体，其中绿色荧光蛋白GFP基因可用其它基因代替。
5、权利要求1的载体，由下述方法构建而成
(1)用限制性内切酶SphI将pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS-3C切割出来，再用连接酶重新连接不含rbcS-3C的载体DNA片断，产生一个中间载体pUC118-PrbcS-T；
(2)利用一对互补引物NcoI5和NcoI3，通过点突变技术在pUC118-PrbcS-T的叶绿体定位序列起始密码处引入NcoI位点产生中间载体pUC118-PrbcS-*T；
(3)利用一对互补引物HindIII5和HindIII3，通过点突变技术把Gateway的入门载体pENTR-2B多克隆位点中的XmnI位点改为HindIII产生中间载体pENTR*-2B，然后用HindIII和EcoRI切开pENTR*-2B和pUC118-PrbcS-*T，回收pENTR*-2B被切割后产生的载体片断pENTR*及pUC118-PrbcS-*T被切割产生的启动子DNA片断PrbcS-*T，用连接酶把pENTR*和PrbcS-*T连接起来获得中间载体pENTR*-Prbcs-*T；
(4)以pGFP为模板，用GFP基因上下游特异性引物扩增GFP基因，获得的PCR产物亚克隆于T载体pUCm-T中，获得中间载体pUCm-T-GFP；
(5)用SphI和BamHI切割pENTR*-PrbcS-*T和pUCm-T-GFP，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片断和GFP基因片断，用连接酶连接PENTR*-PrbcS-*T和GFP，获得入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP。
6、通路克隆入门质粒载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP的构建方法
(1)用限制性内切酶SphI将pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS-3C切割出来，再用连接酶重新连接不含rbcS-3C的载体DNA片断，产生一个中间载体pUC118-PrbcS-T；
(2)利用一对互补引物NcoI5和NcoI3，通过点突变技术在pUC118-PrbcS-T的叶绿体定位序列起始密码处引入NcoI位点产生中间载体pUC118-PrbcS-*T；
(3)利用一对互补引物HindIII5和HindIII3，通过点突变技术把pENTR-2B多克隆位点中的XmnI位点改为HindIII产生中间载体pENTR*-2B，然后用HindIII和EcoRI切开pENTR*-2B和pUC118-PrbcS-*T，回收pENTR*-2B被切割后产生的载体片断pENTR*及pUC118-PrbcS-*T被切割产生的启动子DNA片断PrbcS-*T，用连接酶把pENTR*和PrbcS-*T连接起来获得中间载体pENTR*-Prbcs-*T；
(4)以pGFP为模板，用GFP基因上下游特异性引物扩增GFP基因，获得的PCR产物亚克隆于T载体pUCm-T中，获得中间载体pUCm-T-GFP；
(5)用SphI和BamHI切割pENTR*-PrbcS-*T和pUCm-T-GFP，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片断和GFP基因片断，用连接酶连接PENTR*-PrbcS-*T和GFP，获得入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP。
7、权利要求1至6的通路克隆入门质粒载体在构建含有光诱导型启动子(PrbcS)的目的基因入门克隆质粒中的应用。
8、权利要求1至6的通路克隆入门质粒载体在通过通路克隆技术的LR反应构建目的基因光诱导型植物表达载体中的应用。
全文摘要
本发明公开一种通路克隆(Gateway)技术入门质粒载体(Entry vector)，该载体含有1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基基因的光诱导型启动子(PrbcS)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因。本发明还公开上述载体的构建方法和应用，通过该载体可以利用通路克隆技术快速构建目的基因的光诱导型植物表达载体，实现目的基因在植物叶片中的高水平表达，目的基因的表达受光强度的调节，所表达的目的蛋白可以定位到叶绿体或细胞质中。
文档编号C12N15/82GK101302530SQ20071006642
公开日2008年11月12日 申请日期2007年12月5日 优先权日2007年12月5日
发明者陈丽梅, 李昆志, 莉 马, 宋中邦, 胡清泉 申请人:昆明理工大学