专利名称：表达sod的全蚕粉及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及基因工程生产SOD的技术和方法。具体地讲，本发明涉及含有SOD基因的重组杆状病毒穿梭载体系统感染家蚕幼虫及表达的方法，以及用表达SOD的家蚕制备的全蚕粉及其制备方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(SOD)清除超氧化物自由基。超氧化物自由基对人体可造成直接的或间接的损伤作用，如引发脂质过氧化、损伤DNA，使线粒体中的NADH脱氢酶、NADH氧化酶与三磷酸腺苷酶(ATpase)失活；间接的损伤作用有超氧化物自由基可使H2O2分解为·OH与-OH，O2-个与NO发生自由基-自由基反应，生成ONOO-，·OH与ONOO-是化学活性很强的氧自由基，损伤重要的生物分子。(《自由基生物学的理论与应用》pp178-180)超氧化物歧化酶(SOD)清除超氧化物自由基，防止对机体直接或间接的损伤作用；SOD使O2·-成为细胞内自由基的排污漕；调节机体内O2·-的水平；调节机体内NO的水平；催化反应产物H2O2的作用(《自由基生物学的理论与应用》pp178-180)。
现在市售SOD多数为从哺乳动物牛、猪等的肝脏中提取，随着疯牛病、口蹄疫、禽流感等流行，安全性有很大问题，家蚕重组病毒穿梭载体表达系统(Bac-to-Bac BaculovirusExpression System)是真核表达系统，该技术自1983年Smith等首创以来，已有千种外源基因在该系统表达(《昆虫病毒分子生物学》，1998，pp547-178)，由于有家蚕淋巴本身的大量蛋白的保护作用和一些未知机理的作用，家蚕表达的蛋白质表达后修饰加工的方式与哺乳动物接近，能识别并正确地进行信号肽切除及磷酸化、糖基化、酰基化等作用，表达产物具有很高的生物活性，其抗原性、免疫原性和功能均与天然蛋白相似。
发明内容
本发明的目的是提供一种用家蚕幼虫制备的SOD及其制作的方法。相对于已有技术从哺乳动物组织中提取的SOD来说安全、卫生，可以低成本规模化生产。
本发明提供了一种表达SOD的家蚕幼虫全虫冻干粉。
本发明表达SOD的家蚕幼虫全虫冻干粉的制备方法为以下步骤(1)通过基因工程方法获得带SOD基因的家蚕重组病毒(rBacmid/BmNPV/SOD)或含多角体蛋白的重组病毒(rBmPhBacmid/BmNPV/SOD)；(2)用家蚕重组病毒针刺接种家蚕幼虫，或用含多角体蛋白的重组病毒添食接种家蚕幼虫；(3)接种后的家蚕幼虫经96小时饲养后收集，冷冻干燥后制成粉末。
本发明对SOD基因的表达产物进行了生物活性的鉴定。用重组病毒感染家蚕培养细胞，于感染后不同时间测定培养上清中的SOD活性，在感染的第4天达到1×104IU/ml。用重组病毒穿刺接种或添食接种五龄家蚕幼虫，于感染后不同时间收集蚕血淋巴，高速离心后测血淋巴中的SOD的活性。在感染的120小时血淋巴中SOD活性达到5.0×1O5IU/ml。
为验证本发明表达SOD的家蚕幼虫全虫冻干粉的实际应用效果，本发明人在研制过程中采用家蚕杆状病毒穿梭载体表达系统，分别在家蚕细胞、家蚕幼虫中表达具有极高应用价值的超氧化物歧化酶(SOD)，制成胶囊，并进行了动物试验，即抗氧化，降血糖和增强免疫力实验。通过动物试验和人体试食，对糖尿病有显著的改善作用，并能显著提高细胞的免疫力活性，说明其在治疗糖尿病、提高免疫力药物的实际应用方面有很好的前景。
以上本发明方案中制备方法的步骤(1)可以具体分述如下提取接种后饲养家蚕幼虫的总RNA，再经RT-PCR获得SOD基因，经测序证明其核苷酸序列完全符合基因库中提供的SOD基因序列。
利用杆状病毒穿梭载体Bacmid，将SOD基因片段的克隆到供体质粒中，构成含SOD基因的杆状病毒(rBacmid/BmNPV/SOD)。
将SOD基因片段的克隆到含家蚕多角体蛋白的供体质粒中，构成含家蚕多角体蛋白的重组病毒(rBmPhBacmid/BmNPV/SOD)；以上本发明方案中制备方法的步骤(2)可以具体分述如下本发明公开了SOD基因在家蚕幼虫中的表达方法。将重组的杆状病毒rBacmid/BmNPV/SOD或rBmPhBacmid/BmNPV/SOD感染BmN细胞系进行病毒扩增，然后将扩增后的重组杆状病毒注射至5龄家蚕幼虫体内或添食5龄家蚕幼虫，分别取感染后24、48、72、96和120小时的家蚕血淋巴，经5000rpm5分钟离心取上清，稀释10倍后加等体积的蛋白上样缓冲液，取200ul进行琼脂糖凝胶浓度12％的SDS-PAGE分析，用考马斯亮蓝R250染色。结果见图2。
以上本发明方案中制备方法的步骤(3)可以具体分述如下本发明提供了含SOD基因表达产物的制作方法，接种含SOD基因重组的家蚕幼虫，感染96小时后收集，-20℃冷藏，在冷冻干燥机中干燥，完全干燥后制粉，装入胶囊中。
综上所述，本发明的优点如下，与哺乳动物组织提取的SOD在临床应用中有种种不足(例如排异，疯牛病等，交叉感染)相比，在家蚕幼虫的SOD更具有临床价值；家蚕是可以无菌大规模生产的昆虫，可以低成本大规模的饲养。蚕体中有多种天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物稳定，家蚕生产的蛋白可以制成胶囊，为患者解除了注射的痛苦和被感染的威胁。
附图1SOD的供体质粒结构图。
附图2家蚕表达产物的SDS-PAGE和western blot分析图谱说明重组病毒(rBacmid/BmNPV/SOD)接种于5龄幼虫第一天，接种后96小时收集家蚕血液，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色。再以6×His-抗体和辣根过氧化物酶标记的兔IgG抗体进行western blot分析。
附图3家蚕表达的SOD活性图谱说明重组病毒(rBacmid/BmNPV/SOD)接种于5龄幼虫第一天，接种后每隔24小时收集家蚕血液，3000×g，4℃.离心10分钟。取上清液以氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化还原法测定SOD活力。SOD活性单位定义为抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活力单位(U)。
具体实施例方式
本发明通过以下实施例作进一步阐述。
实施例1、SOD基因的PCR扩增合成以家蚕N4蚕品种为材料，取5龄第3天幼虫以RNA抽提试剂盒(TRIzol RNA extractionreagent kit)提取总RNA，经电泳检测。
设计SOD引物。正向引物5’-atcgaattcATGTTAATGTCACAAAGGATTG-3’，反向引物5’-gatggtaccgcCTTGAGCGCTTTTTCATATCTCTG-3’.为便于克隆正反向引物5’端分别引进EcoRI和KpnI酶切位点。
以总RNA为模板，在通用引物oligo-dT18和反向转录酶(Super script II reversetranscriptase)作用下合成单链cDNA，再以此为模板在SOD正反向引物下合成SOD基因，PCR合成的条件为94℃预变性5分钟，再以94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，共35个循环，最后72℃延长10分钟。合成的SOD基因经乙醇沉淀和EcoRI和KpnI双酶切，电泳并切胶回收。
实施例2、含SOD基因的家蚕杆状病毒供体质粒构建将SOD基因与pFastBacHTa以连接试剂盒连接并转化XL-Blue细胞，挑斑在含氨苄青霉素的LB培养基中培养繁殖，提取重组供体质粒pFastBacHTa-SOD并经ABI PRISM 310GeneticAnalyzer测序仪测序确认。
实施例3、含SOD基因的重组杆状病毒的获得将重组供体质粒pFastBacHTa-SOD转化E.coli DH10Bac/BmNPV，并在含抗生素平板(50ug/ml kanamycin，7ug/ml gentamicin and 10ug/ml tetracycline，100ug/ml X-gal andthe inducer，40ug/ml IPTG)培养基上进行蓝白筛选，获得重组杆状病毒rBacmid/BmNPV/SOD。
将上述重组杆状病毒rBacmid/BmNPV/SOD DNA在脂质体FuGENE 6介导下导入转染家蚕培养细胞(BmN)，获得重组病毒，避光保存于-4℃备用。
实施例4、SOD基因在家蚕幼虫中的表达5龄第1天幼虫注射病毒液约5μl(计每头幼虫2×105病毒粒子)，继续饲养96小时，收集血液，进行SDS-PAGE，WESTERN BLOTTING和SOD活性测定。其余蚕96小时收集保存于-20℃，以制作全蚕粉。
实施例5、用表达SOD基因的全蚕粉的动物试验A，实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10倍，400mg/kg作为高剂量组；另设200mg/kg、100mg/kg两个剂量组，以溶剂蒸馏水作为阴性对照；每组12只，受试样品配成悬浮液，以灌胃形式给予小鼠0.5ml，每天一次，连续给予45天。
B，经四氧嘧啶造模成功后的小鼠，灌胃经冷冻干燥制得的SOD全蚕粉，设三个剂量组和阴性对照组给小鼠灌胃30天；并设立同品种同时制作的正常全蚕粉，结果均能增加小鼠的糖耐量水平，并且抑制小鼠的空腹血糖值的升高，与对照相比达到显著水平；C，在家蚕体内表达SOD基因后，经冷冻干燥制得SOD全蚕粉，设三个剂量组和阴性、阳性对照组给小鼠灌胃30天；经口给予小鼠不同剂量的SOD全蚕粉30天，能增加小鼠血和肝脏中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，降低小鼠肝脏中丙二醛含量。经口给予小鼠不同剂量的SOD全蚕粉30天，经统计学处理，其脾脏/体重比值在低、中、高剂量组与对照组间比较均无显著性差异(P＞0.05)，其胸腺/体重比值在低、中、高剂量组与对照组间比较均有显著性差异(P＜0.05)，SOD全蚕粉能提高小鼠的胸腺/体重比值，并提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力。
D，在家蚕体内表达SOD基因后，经冷冻干燥制得SOD全蚕粉，根据保健品的安全性要求，对SOD全蚕粉进行急性毒性检验和长期性毒性检验。经对小鼠进行人体推荐量360倍的急性毒性检验，和90天的长期性毒性检验，小鼠生长正常，各器官无异常现象发生，经人体试食，无异常情况发生，因此认定SOD全蚕粉对于人是安全的。
E，在家蚕体内表达SOD基因后，经冷冻干燥制得SOD全蚕粉，设三个剂量组和阴性对照组给小鼠灌胃30天；经口给予小鼠不同剂量的SOD全蚕粉30天，能提高小鼠迟发型变态反应能力，在高剂量组达到显著水平，但与阳性对照(黄芪组)有较明显的差距。在家蚕体内表达SOD基因后，经冷冻干燥制得SOD全蚕粉，设三个剂量组和阴性对照组给小鼠灌胃30天；经口给予小鼠不同剂量的SOD全蚕粉30天，能提高小鼠迟发型变态反应能力，在高剂量组达到显著水平。
F，SOD全蚕粉能明显增加小鼠淋巴细胞转化率；与阴性对照组比较，低剂量组的SI增加最大，但高剂量组作用也明显(P＜0.05)，SI平均值由2.33升至2.99，说明SOD全蚕粉有增加小鼠机体细胞免疫功能的作用。
G，SOD全蚕粉灌胃各剂量组NK细胞杀伤活性与蒸馏水对照组比较有非常显著性增高P＜0.01)，SOD全蚕粉灌胃后能显著提高NK细胞杀伤活性，100mg/kg剂量组NK细胞杀伤活性比蒸馏水对照组增长38.91％，200mg/kg剂量组NK细胞杀伤活性比蒸馏水对照组增长45.57％，400mg/kg剂量组NK细胞杀伤活性比蒸馏水对照组增长48.55％，黄芪阳性对照组NK细胞杀伤活性比蒸馏水对照组增长39.44％。
权利要求
1.表达SOD的全蚕粉，其特征在于一种表达SOD的家蚕幼虫全虫冻干粉。
2.表达SOD的全蚕粉的制备方法，其特征在于以下步骤(1)通过基因工程方法获得带SOD基因的家蚕重组病毒(rBacmid/BmNPV/SOD)或含家蚕多角体蛋白的重组病毒(rBmPh/Bacmid/BmNPV/SOD)；(2)用家蚕重组病毒穿梭载体系统针刺接种家蚕幼虫，或用含多角体蛋白的重组病毒添食接种家蚕幼虫；(3)接种后的家蚕幼虫经96小时饲养后收集，冷冻干燥后制成粉末。
全文摘要
本发明公开了一种表达SOD的家蚕幼虫全虫冻干粉以及这种SOD家蚕幼虫全虫冻干粉的制备方法。主要步骤包括(1)用基因工程方法获得带SOD基因的家蚕重组病毒(rBacmid/BmNPV/SOD)或含多角体蛋白的重组病毒(rBmPhBacmid/BmNPV/SOD)；(2)用家蚕重组病毒针刺接种家蚕幼虫，或用含多角体蛋白的重组病毒添食接种家蚕幼虫；(3)接种后的家蚕幼虫经96小时饲养后收集，冷冻干燥后制成粉末。用本发明的冻干粉对小鼠进行辅助降血糖和增加免疫细胞活性试验获得成功。相对于从哺乳动物组织中提取的SOD来说，本发明的产品安全、卫生，可以低成本规模化生产。
文档编号C12N9/02GK101015569SQ20071006666
公开日2007年8月15日 申请日期2007年1月10日 优先权日2007年1月10日
发明者缪云根, 岳万福, 刘剑梅 申请人:浙江大学