专利名称：酿酒酵母cwy132及其在微生物发酵制备2－苯乙醇中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株酿酒酵母诱变株——酿酒酵母CWY132，及其在微生物发酵制备2-苯乙醇中的应用。
背景技术：
2-苯乙醇是一种具有玫瑰花香的芳香醇，大量应用于日用化学和食品工业中玫瑰香型和其他类型的香精配方，也是所有花香型调和香料以及高级香水中不可或缺的成分。从上世纪末以来，消费者对“天然”产品的要求越来越高，国际市场上，对天然2-苯乙醇的需求量非常可观，价格高达1000$/kg；国内由于化工产品长期占据主导地位，故化学合成的2-苯乙醇仍占绝大部分，但化学合成2-苯乙醇使用苯和苯乙烯等致癌物质作为原料，对人体健康和环境都有巨大危害，此外，化学合成的2-苯乙醇中常含有一些难以除去的副产物，严重影响了产品质量。
近年来，随着生物技术的飞速发展和人民生活水平的不断提高，特别是我国加入世界贸易组织，人们越来越重视产品的安全性，追求有机、生态、绿色产品已成为一种时尚。天然2-苯乙醇也必将顺应此趋势，不断提高其在日常生活中所占的比例。微生物发酵生产天然2-苯乙醇，具有发酵周期短、发酵效率高、低成本、高收益、环境友好等优势，开发生产的潜力巨大。
发明内容本发明即是为了提供一株可发酵生产天然2-苯乙醇，且发酵周期短、发酵效率高、低成本、收率高的酿酒酵母诱变株——酿酒酵母CWY132，及其在微生物发酵制备2-苯乙醇中的应用。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是酿酒酵母CWY132(Saccharomyces cerevisiae CWY132)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2006年12月15日，保藏编号CCTCC NOM206136。
所述酿酒酵母CWY132由如下方法获得对实验室保藏的多株不同种类的酵母(包括酿酒酵母、路德类酵母、毕赤酵母、红酵母等)进行发酵生产天然2-苯乙醇的试验，筛选得到2-苯乙醇产量最高的菌株酿酒酵母AS2.516(Saccharomyces cerevisiae AS2.516，可以在中国普通微生物菌种保藏管理中心买到)，上述菌种先后经过紫外线15W照射75秒，20KeV N+离子束注入1.2×1013ions/cm2和20KeV H+离子束注入0.8×1013ions/cm2处理，筛选高产2-苯乙醇的突变株，2-苯乙醇产量经过高效液相色谱验证，获得突变菌株CWY132。
所述酿酒酵母CWY132菌落特征和生化特性如下该菌株在固体YEPD或YPAD培养基上形成乳白色圆形饱满菌落，具有酵母特有的酒香味，以芽殖方式进行无性繁殖，可以同化和发酵蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和果糖，不同化木糖，其最适生长温度为28～35℃，最适生长pH值为5.0～6.0。
所述的酿酒酵母CWY132主要用于微生物发酵制备2-苯乙醇。
所述应用具体为将所述酿酒酵母CWY132接种于含有底物L-苯丙氨酸的发酵培养基中，进行发酵培养，发酵液经分离纯化得到所述的2-苯乙醇。通常，将发酵液过滤收集上清液，自上清液中蒸馏即可获得2-苯乙醇。当发酵培养基中的L-苯丙氨酸浓度高于6g/L时，为提高收率，可在培养基中添加聚丙二醇，发酵结束后分层，收集聚丙二醇相、自聚丙二醇相中蒸馏即可得到所述的2-苯乙醇。所添加的聚丙二醇对水相发酵体系中产生的2-苯乙醇具有高效抽提的作用，由于2-苯乙醇对多种细菌和真菌具有抑制作用，其对酵母细胞的致死浓度为3.8g/L；当培养基中添加的L-苯丙氨酸量高于6g/L时，所产生的2-苯乙醇量将达到细胞的致死浓度，非常不利于产量的进一步提高；本发明通过添加聚丙二醇，将发酵过程中产生的2-苯乙醇及时抽提到聚丙二醇相，使水相中的2-苯乙醇浓度在整个发酵过程中一直处于较低水平，不影响细胞正常的代谢活动，且2-苯乙醇在聚丙二醇相和水相中的分配系数大于30，保证了所产生的2-苯乙醇绝大部分都位于聚丙二醇相中，发酵结束后直接回收聚丙二醇即可。聚丙二醇的另一优势是它已被美国FDA列为可食用级别的溶媒，可直接作为食品添加剂使用，安全可靠。
所述发酵培养在28～35℃条件下搅拌培养36～72小时，发酵培养基中各组分终浓度为葡萄糖30～60g/L，L-苯丙氨酸3～26g/L，磷酸二氢钾2～10g/L，硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH4.5～7.0。
所述酿酒酵母CWY132接种量为5×106～2×107个细胞/mL培养基。优选为1×107个细胞/mL培养基。
特别的，当发酵培养基中的L-苯丙氨酸浓度高于6g/L时，发酵培养基中还可含有体积为发酵培养基体积0.1～1倍的聚丙二醇，发酵结束后离心或静置分层，收集聚丙二醇相、蒸馏得到所述的2-苯乙醇。所述聚丙二醇可在发酵之前添加，也可在发酵过程中添加。
所述聚丙二醇优选为聚丙二醇1000～2000，最优选为聚丙二醇1500。
为使发酵的效果更好，所述酿酒酵母CWY132在接种至发酵培养基之前可先进行活化和扩大培养先将酿酒酵母CWY132斜面培养活化，培养为固体平皿菌种，再将固体平皿中的单菌落培养为液体菌种，液体菌种经过至少二级液体种子培养后，再接种到发酵培养基中进行发酵培养。
具体的，所述的应用按如下顺序步骤进行(1)斜面培养将酿酒酵母CWY132菌种接种于YEPD或YPAD固体斜面上，在28～35℃条件下培养36～60小时，得斜面活化种子，4℃下保存备用；(2)固体平皿培养将酿酒酵母CWY132的斜面活化种子划线接种于YEPD或YPAD固体平皿上，在28～35℃条件下培养36～48小时，长出单菌落，即为固体平皿菌种；(3)液体培养将酿酒酵母CWY132的固体平皿菌接种于YEPD或YPAD液体培养基中，在28～35℃条件下搅拌培养12～20小时，即为液体菌种；(4)种子放大培养将液体菌种按5～15％体积比的接种量接入YEPD或YPAD液体培养基中，在28～35℃条件下搅拌培养12～20小时，即为一级种子培养液；将一级种子培养液按5～30％体积比接种入种子培养基中，在28～35℃条件下搅拌培养20～30小时，即为二级种子培养液；所述种子培养基中各组分终浓度为葡萄糖30～60g/L、L-苯丙氨酸3～5g/L、磷酸二氢钾2～10g/L、硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH 5.5；(5)发酵培养以5×106～2×107个细胞/mL培养基的接种量，将二级种子培养液接种至发酵培养基中，并加入体积为发酵培养基体积1/3的聚丙二醇1000～2000，28～35℃下搅拌培养36～72小时；所述发酵培养基中各组分终浓度为葡萄糖30～60g/L，L-苯丙氨酸6～26g/L，磷酸二氢钾2～10g/L，硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH4.5～7.0；(6)分离纯化发酵液离心或静置分层，取聚丙二醇相，蒸馏，得到所述2-苯乙醇。
优选的，所述的应用按如下顺序步骤进行(1)斜面培养将酿酒酵母CWY132菌种接种于YEPD或YPAD固体斜面上，在28℃条件下培养60小时，得斜面活化种子，4℃下保存备用；(2)固体平皿培养将酿酒酵母CWY132的斜面活化种子划线接种于YEPD或YPAD固体平皿上，在28℃条件下培养48小时，长出单菌落，即为固体平皿菌种；(3)液体培养将酿酒酵母CWY132的固体平皿菌接种于YEPD或YPAD液体培养基中，接种量为1环/100mL培养基，在28℃条件下搅拌培养16小时，即为液体菌种；(4)种子放大培养将液体菌种按8％体积比的接种量接入YEPD或YPAD液体培养基中，在28℃条件下搅拌培养16小时，即为一级种子培养液；将一级种子培养液按10％体积比的接种入种子培养基中，在28℃条件下搅拌培养20小时，即为二级种子培养液；所述种子培养基中各组分终浓度为葡萄糖30g/L、L-苯丙氨酸3g/L、磷酸二氢钾6g/L、硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH5.5；
(5)发酵培养以1×107个细胞/mL培养基的接种量，将二级种子培养液接种至发酵培养基中，并加入体积为发酵培养基体积1/3的聚丙二醇1500，32℃下搅拌培养60小时；所述发酵培养基中各组分终浓度为葡萄糖30g/L，L-苯丙氨酸15g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH5.0；(6)分离纯化发酵液离心或静置分层，取聚丙二醇相，蒸馏，得到所述2-苯乙醇。
本发明的诱变株——酿酒酵母CWY132，经过多次诱变，具有高效转化L-苯丙氨酸生产天然2-苯乙醇的特性。当所添加的L-苯丙氨酸量小于6g/L时，摩尔转化率可达90％以上；当所添加的L-苯丙氨酸量高于6g/L时，向培养基中加入聚丙二醇，最终的摩尔转化率达50％～90％，可以进行工业化生产。
本发明使用的发酵底物是葡萄糖和L-苯丙氨酸，适当添加磷酸二氢钾和硫酸镁，即可进行正常生产，所添加的聚丙二醇也价格低廉，方法简单，成本低廉。而天然2-苯乙醇国际市场的价格为1000$/kg，具有很好的市场前景。
本发明的有益效果主要体现在发酵周期短，正常发酵的温度范围较宽，该方法对发酵设备及条件没有特殊要求，一般的醇类发酵工厂的设备和条件均可生产，生产投资较少，收率高，利于工业化生产。
酿酒酵母CWY132(Saccharomyces cerevisiae CWY132)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2006年12月15日，保藏编号CCTCC NOM206136。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1利用酿酒酵母CWY132发酵生产天然2-苯乙醇，步骤如下1、斜面培养将酿酒酵母CWY132接种于YPAD固体斜面上，在28℃条件下培养60小时后，放入4℃冰箱保存；2、固体平皿培养将斜面保存的酿酒酵母CWY132用接种环挑一环划线接种于YPAD固体平皿上，在28℃条件下培养48小时，形成成熟单菌落，即为固体平皿菌种；3、液体培养将固体平皿上的酿酒酵母CWY132，用接种环挑取一个单菌落接种于装有100毫升YPAD液体培养基的三角瓶中，在28℃条件下搅拌培养16小时，即为液体菌种；4、一级液体种子培养将液体菌种按8％的接种量接入装有500毫升YPAD液体培养基的三角瓶中，在28℃条件下搅拌培养16小时，得到一级种子培养液；5、二级液体种子培养一级种子培养液按10％的接种量接入装有3升种子培养基的种子培养罐，在28℃条件下搅拌培养20小时，得到二级种子培养液；所述种子培养基各组分终浓度为葡萄糖30g/L、L-苯丙氨酸3g/L、磷酸二氢钾6g/L、硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH为5.5；6、发酵培养二级种子培养液按1×107个细胞/毫升的接种量接入装有8升发酵培养基的10升发酵罐中，在28℃条件下搅拌培养36小时；发酵培养基各组份终浓度葡萄糖浓度30g/L，L-苯丙氨酸浓度5g/L，磷酸二氢钾浓度6g/L，硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱(武汉天源生物技术有限公司生产，下同)0.17g/L，培养基的pH为5.5；7、分离纯化将得到的发酵液进行过滤，收集上清液；上清液蒸馏获得2-苯乙醇，最终的摩尔转化率为95.3％。
实施例2利用酿酒酵母CWY132发酵生产天然2-苯乙醇，步骤如下1、斜面培养将酿酒酵母CWY132接种于YEPD固体斜面上，在30℃条件下培养48小时后，放入4℃冰箱保存；2、固体平皿培养将斜面保存的酿酒酵母CWY132用接种环挑一环划线接种于YEPD固体平皿上，在30℃条件下培养36小时，形成成熟单菌落，即为固体平皿菌种；3、液体培养将固体平皿上的酿酒酵母CWY132，用接种环挑取一个单菌落接种于装有100毫升YEPD液体培养基的三角瓶中，在30℃条件下搅拌培养14小时，即为液体菌种；4、一级液体种子培养将液体菌种按10％体积比的接种量接入装有500毫升YEPD液体培养基的三角瓶中，在30℃条件下搅拌培养14小时，得到一级种子培养液；5、二级液体种子培养一级种子培养液按15％体积比的接种量接入装有3升种子培养基的种子培养罐，在30℃条件下搅拌培养20小时，得到二级种子培养液；所述种子培养基各组份终浓度为葡萄糖40g/L、L-苯丙氨酸5g/L、磷酸二氢钾6g/L、硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH为5.5；6、发酵培养将二级种子培养液按5×106个细胞/毫升的接种量接入装有7升发酵培养基的10升发酵罐中，再向其中加入1.5升聚丙二醇1000；将上述发酵体系在30℃条件下搅拌培养50小时；发酵培养基各组份终浓度为葡萄糖40g/L，L-苯丙氨酸浓度9g/L，磷酸二氢钾浓度6g/L，添加0.5g/L硫酸镁，0.17g/L去除了氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱，培养基的pH为6.0；7、分离纯化将发酵液离心，使水相和聚丙二醇相分层，收集聚丙二醇相，蒸馏获得2-苯乙醇，最终的摩尔转化率为72.3％。
实施例3利用酿酒酵母CWY132发酵生产天然2-苯乙醇，步骤如下1、斜面培养将酿酒酵母CWY132接种于YPAD固体斜面上，在32℃条件下培养40小时后，放入4℃冰箱保存；2、固体平皿培养将斜面保存的酿酒酵母CWY132用接种环挑一环划线接种于YPAD固体平皿上，在32℃条件下培养30小时，形成成熟单菌落，即为固体平皿菌种；3、液体培养将固体平皿上的酿酒酵母CWY132，用接种环挑取一个单菌落接种于装有100毫升YPAD液体培养基的三角瓶中，在32℃条件下搅拌培养16小时，即为液体菌种；4、一级液体种子培养将液体菌种按12％体积比的接种量接入装有500毫升YEPD液体培养基的三角瓶中，在32℃条件下搅拌培养16小时，得到一级种子培养液；5、二级液体种子培养一级种子培养液按20％体积比的接种量接入装有3升种子培养基的种子培养罐，在32℃条件下搅拌培养25小时，得到二级液体种子培养物；所述种子培养基中各组分终浓度为葡萄糖50g/L、L-苯丙氨酸5g/L、磷酸二氢钾8g/L、硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH 5.5；6、发酵培养将二级液体种子培养物按1×107个细胞/毫升的接种量接入装有6升发酵培养基的10升发酵罐中，再向其中加入2升聚丙二醇2000；将上述发酵体系在32℃条件下搅拌培养60小时；发酵培养基各组份终浓度为葡萄糖50g/L，L-苯丙氨酸浓度15g/L，磷酸二氢钾浓度8g/L，硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH5.0；7、分离纯化将发酵液静置24h，使水相和聚丙二醇相分层，收集聚丙二醇相，蒸馏，获得2-苯乙醇，最终的摩尔转化率为79.1％。
实施例4利用酿酒酵母CWY132发酵生产天然2-苯乙醇，步骤如下1、斜面培养将酿酒酵母CWY132接种于YPAD固体斜面上，在35℃条件下培养48小时后，放入4℃冰箱保存；2、固体平皿培养将斜面保存的酿酒酵母CWY132用接种环挑一环划线接种于YPAD固体平皿上，在35℃条件下培养36小时，形成成熟单菌落，即为固体平皿菌种；
3、液体培养将固体平皿上的酿酒酵母CWY132，用接种环挑取一个单菌落接种于装有100毫升YPAD液体培养基的三角瓶中，在35℃条件下搅拌培养20小时，即为液体菌种；4、一级液体种子培养将液体菌种按15％体积比的接种量接入装有500毫升YEPD液体培养基的三角瓶中，在35℃条件下搅拌培养20小时，得到一级液体种子培养液；5、二级液体种子培养一级种子培养液按30％体积比的接种量接入装有3升种子培养基的培养罐，在35℃条件下搅拌培养30小时，得到二级种子培养液；所述种子培养基各组份终浓度为葡萄糖60g/L、L-苯丙氨酸5g/L、磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH为5.5；6、发酵培养将二级液体种子培养物按2×107个细胞/毫升的接种量接入装有5升发酵培养基的10升发酵罐中，再向其中加入3升聚丙二醇1500；将上述发酵体系在35℃条件下搅拌培养72小时；发酵培养基各组份终浓度为葡萄糖60g/L，L-苯丙氨酸浓度20g/L，磷酸二氢钾浓度10g/L，硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH为6.5；7、将发酵液离心，使水相和聚丙二醇相分层，收集聚丙二醇相蒸馏，获得2-苯乙醇，最终的摩尔转化率为82.4％。
权利要求
1.酿酒酵母CWY132(Saccharomyces cerevisiae CWY132)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2006年12月15日，保藏编号CCTCC NOM206136。
2.如权利要求1所述的酿酒酵母CWY132在微生物发酵制备2-苯乙醇中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为将所述酿酒酵母CWY132接种于含有底物L-苯丙氨酸的发酵培养基中，进行发酵培养，发酵液经分离纯化得到所述的2-苯乙醇。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养在28～35℃条件下搅拌培养36～72小时，发酵培养基中各组分终浓度为葡萄糖30～60g/L，L-苯丙氨酸3～26g/L，磷酸二氢钾2～10g/L，硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH4.5～7.0。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述酿酒酵母CWY132接种量为5×106～2×107个细胞/mL培养基。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于发酵培养基中还含有体积为发酵培养基体积0.1～1倍的聚丙二醇，发酵结束后离心或静置分层，收集聚丙二醇相、蒸馏得到所述的2-苯乙醇。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述聚丙二醇为聚丙二醇1000～2000。
8.如权利要求2～7之一所述的应用，其特征在于先将酿酒酵母CWY132斜面培养活化，培养为固体平皿菌种，再将固体平皿中的单菌落培养为液体菌种，液体菌种经过至少二级液体种子培养后，再接种到发酵培养基中进行发酵培养。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用按如下顺序步骤进行(1)斜面培养将酿酒酵母CWY132菌种接种于YEPD或YPAD固体斜面上，在28～35℃条件下培养36～60小时，得斜面活化种子，4℃下保存备用；(2)固体平皿培养将酿酒酵母CWY132的斜面活化种子划线接种于YEPD或YPAD固体平皿上，在28～35℃条件下培养36～48小时，长出单菌落，即为固体平皿菌种；(3)液体培养将酿酒酵母CWY132的固体平皿菌接种于YEPD或YPAD液体培养基中，在28～35℃条件下搅拌培养12～20小时，即为液体菌种；(4)种子放大培养将液体菌种按5～15％体积比的接种量接入YEPD或YPAD液体培养基中，在28～35℃条件下搅拌培养12～20小时，即为一级种子培养液；将一级种子培养液按5～30％体积比接种入种子培养基中，在28～35℃条件下搅拌培养20～30小时，即为二级种子培养液；所述种子培养基中各组分终浓度为葡萄糖30～60g/L、L-苯丙氨酸3～5g/L、磷酸二氢钾2～10g/L、硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH5.5；(5)发酵培养以5×106～2×107个细胞/mL培养基的接种量，将二级种子培养液接种至发酵培养基中，并加入体积为发酵培养基体积1/3的聚丙二醇1000～2000，28～35℃下搅拌培养36～72小时；所述发酵培养基中各组分终浓度为葡萄糖30～60g/L，L-苯丙氨酸6～26g/L，磷酸二氢钾2～10g/L，硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH4.5～7.0；(6)分离纯化发酵液离心或静置分层，取聚丙二醇相，蒸馏，得到所述2-苯乙醇。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的应用按如下顺序步骤进行(1)斜面培养将酿酒酵母CWY132菌种接种于YEPD或YPAD固体斜面上，在28℃条件下培养60小时，得斜面活化种子，4℃下保存备用；(2)固体平皿培养将酿酒酵母CWY132的斜面活化种子划线接种于YEPD或YPAD固体平皿上，在28℃条件下培养48小时，长出单菌落，即为固体平皿菌种；(3)液体培养将酿酒酵母CWY132的固体平皿菌接种于YEPD或YPAD液体培养基中，接种量为1环/100mL培养基，在28℃条件下搅拌培养16小时，即为液体菌种；(4)种子放大培养将液体菌种按8％体积比的接种量接入YEPD或YPAD液体培养基中，在28℃条件下搅拌培养16小时，即为一级种子培养液；将一级种子培养液按10％体积比的接种入种子培养基中，在28℃条件下搅拌培养20小时，即为二级种子培养液；所述种子培养基中各组分终浓度为葡萄糖30g/L、L-苯丙氨酸3g/L、磷酸二氢钾6g/L、硫酸镁0.5g/L，不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH5.5；(5)发酵培养以1×107个细胞/mL培养基的接种量，将二级种子培养液接种至发酵培养基中，并加入体积为发酵培养基体积1/3的聚丙二醇1500，32℃下搅拌培养60小时；所述发酵培养基中各组分终浓度为葡萄糖30g/L，L-苯丙氨酸15g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁0.5g/L，不合氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L，pH5.0；(6)分离纯化发酵液离心或静置分层，取聚丙二醇相，蒸馏，得到所述2-苯乙醇。
全文摘要
本发明提供了一株酿酒酵母诱变株——酿酒酵母CWY132，及其在微生物发酵制备2－苯乙醇中的应用。所述酿酒酵母CWY132(Saccharomyces cerevisiae CWY132)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2006年12月15日，保藏编号CCTCC NOM206136。本发明的有益效果主要体现在发酵周期短，正常发酵的温度范围较宽，该方法对发酵设备及条件没有特殊要求，一般的醇类发酵工厂的设备和条件均可生产，生产投资较少，收率高，利于工业化生产。
文档编号C12P7/02GK101016517SQ20071006688
公开日2007年8月15日 申请日期2007年1月23日 优先权日2007年1月23日
发明者崔志峰, 杨霄, 汪琨, 朱廷恒 申请人:浙江工业大学