专利名称：能在体捕获内皮祖细胞的生物人工血管的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术，具体是关于一种能在体捕获自体循环血内皮祖细胞的生物人工血管。
背景技术：
在过去的几十年中，血管移植材料的发展经历了小牛血管、涤纶制品、人脐静脉、膨体聚四氟乙烯、自体大隐静脉等几个阶段，对于大血管，虽然PTFE(聚四氟乙烯)等人工血管可在一定程度上满足临床需要，但不能降解，一直作为异物存在人体内，且抑制血管细胞的再生功能。PTFE等人工血管的抗凝血机理是让血液在人工血管内壁形成一层血栓膜，因此这种人工血管的内径通常不能小于6mm，否则其早期就可发生血栓而导致管腔堵塞，6个月后通畅率小于40％。用人工材料构建小直径血管不易成型，同时很难做到顺应性相匹配。目前在人工血管表面进行抗凝修饰能一定程度抑制血栓形成，但植入血管需终生使用，其长期的抗凝效果不甚理想，因而如何改善移植人工血管的力学特性及生物相容性，防止血管闭塞，是构建小直径人工血管面临的主要问题。
由于内皮细胞在抗血栓形成、抑制血小板聚集、分泌血管活性因子等方面的重要作用，人工血管的内皮化是最终解决血管血栓形成及内膜增生的最有效方法。如何有效促进人工血管的内皮化是目前人工血管研究的热点和难点。人工血管的内皮化分离体和在体，以往人工血管的内皮化不甚理想，究其原因在于血管内皮细胞的再生能力非常有限，宿主内皮细胞由吻合口向人工血管内迁徙仅限于吻合口周2cm。由于以往对毛细血管通过管壁的长入、循环内皮在人工血管表面的沉积原因、机制认识不清，将新鲜获取或体外培养的内皮细胞种植于人工血管的内表面，成为首选的努力方向。离体内皮化需要取病人的细胞，同时存在培养周期以及体外易污染等因素，人工血管用于急性血管损伤治疗或用于一些不能提供合适种子细胞的病人，构建的人工血管不能用自体细胞种植需要耐受同种移植。因而人工血管的内皮化是困扰人工血管应用的难题。
20世纪50年代问世的Dacron是最早应用的人工血管，由于它对凝血系统有激活作用而只能对大口径血管有较短的替代作用。以后又开发利用聚四氟乙烯(PTFE)、聚氨基甲酸乙酯、膨体聚四氟乙烯(e-PTFE)等，并通过多种方法改变材料的物理性状、表面特点，以达到血管植入的要求。但由于PTFE等人工血管不利于细胞的附着、分裂、增殖；同时亲水性差，细胞吸附力较弱，不能降解、重塑，不利于内皮化，从而达不到长期抗凝的目的，一些合成高分子可降解材料如聚乳酸、聚乙二醇酸、聚丙醇酸等及上述材料的共聚物具有低毒、无免疫反应、安全性较好且有很好的生物相容性的特性得到广泛应用。这些材料尽管有许多优点，但也存生物相容性、生物活性、生物降解性及与宿主血管力学匹配等方面的缺点，且在孔隙率及孔径大小等方面的仿生制作还有一定难度，同时某些人工材料(如聚乳酸等)大量使用时在体内降解过程中产生的酸性物质堆积，不利于细胞的附着、分裂、增殖；同时亲水性差，细胞吸附力较弱，机械强度不足。另外作为合成类高分子材料缺乏细胞识别信号，其昂贵的价格也限制了其广泛应用。因此，支架材料已成为妨碍人工血管内皮化研究进程的主要问题。
生物人工血管所需要的基质材料应具有足够的机械张力，适合外科缝合的特性及生物相容性。采用各种可降解涂层以减轻血小板及血细胞的粘集，Satoshiniu等采用多聚环氧化合物做交联剂，在人工血管上形成明胶-肝素涂层抑制血小板的聚集、纤维素的形成，同时利于吻合口内膜的长入。Himyukinkito在血管假体内表面涂布硫酸软骨素(CS)及透明质酸(HA)。这些方法短期内尽管有一定抗凝效果，但不能有效诱导内皮化，从而达不到长期抗凝的目的。因而对人工血管移植后发生的内膜增生血管再狭窄闭塞尚没有好的办法解决。
在内皮种子细胞方面，创伤等损伤时血液中内皮生长因子浓度能显著提高，血液中的祖细胞浓度也相应提高。通过动员骨髓中内皮相细胞，可显著提高血液中内皮祖细胞含量。最近的研究表明血液中内皮祖细胞含量增高时能直接修复损伤的血管，其机制在于内皮祖细胞能直接种植于血管损防部位，分化成内皮细胞替代和修复血管损伤部位的内皮，避免血栓形成和血管内膜增生。基于这个原理在人上血管如能诱导体内内皮祖细胞种植则能达到类似的效果，可不必离体分离培养细胞，这样为生物人工血管的产业化提供了可能。但目前国内外未见任何捕获在体内皮祖细胞的生物人工血管的研究报道。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术中存在不足，提供一种具有良好力学性能、能在体捕获自体循环血中内皮祖细胞实现最终内皮化的生物人工血管，能有效抗血栓形成、血管再狭窄，用于临床上修复血管缺损或血管搭桥。
为实现本发明的上述目的而采用的技术方案是这样的，即一种能在体捕获自体循环血中内皮祖细胞实现最终内皮化的生物人工血管，其特征是采用如下的方法制备1、血管支架复合材料的获取由具有良好生物相容性及可降解特性的胶原为主体材料，由异种或同种组织提取的生物胶原去除抗原后获得，保留胶原的天然网状结构，a、用电纺丝纺织方法将获得的胶原和弹性材料复合，编织血管，或b、用电纺丝纺织方法将胶原、壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料复合，编织血管，所述弹性材料为弹性蛋白和丝素蛋白；或c、直接采用人工合成材料用电纺丝纺织方法编织血管；或2、采用去除抗原后的同种或异种血管；3、血管表面修饰将步骤1或2获得的血管，在血管腔表面修饰由能在体捕获自体内皮祖细胞的相关因子、趋化因子SDF-1、粘附短肽Gly-Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp、层粘连蛋白、生长因子蛋白，可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯组成的表面修饰混合物；其配比关系按重量百分比为能在体捕获自体内皮祖细胞的相关因子为0.001-0.003％，趋化因子蛋白SDF-1为0.001-0.005％，粘附短肽Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp为0.03-0.1％，层粘连蛋白为0.001-0.005％，，内皮生长因子蛋白为0.003-0.008％，可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯70-90％，，其余为去离子水，将它们充分混合成水溶液，灌注到步骤1或步骤2制备好的血管腔内，经紫外光反应将其交联在血管腔表面，真空干燥备用；其中在体捕获自体内皮祖细胞的相关因子为内皮生长因子II型受体KDR抗体或CD34抗体或CD34抗体、CD133抗体和KDR抗体三种抗体按重量百分比20～40％∶25～45％∶30～50％的复合，生长因子蛋白为内皮生长因子或内皮生长因子加少量的转化生长因子；4、获得的生物人工血管可作为组织工程血管支架，在此基础上再种植平滑肌细胞或/和内皮细胞。
本发明涉及的能在体捕获自体循环血内皮祖细胞的生物人工血管的制作可以不包括上述步骤4，即可以不在由步骤3获得的经修饰后的血管上再种植平滑肌细胞或/和内皮细胞。
在上述步骤1中，采用已知的方法编织血管即将胶原和弹性材料按重量百分比60～80％∶20～40％用电纺丝纺织方法编织成不低于1mm口径的血管支架，所述弹性材料为弹性蛋白和丝素蛋白，按重量百分比为25～40％∶60～75％。
或将胶原、壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料按重量百分比50～70％∶12～18％∶1～5％∶15～35％用电纺丝纺织方法编织成不低于1mm口径的血管支架，所述弹性材料为弹性蛋白或/和丝素蛋白按重量百分比为25～40％∶60～75％；在上述制备方法中，步骤1中所述的人工合成材料采用不可降解材料或可降解材料，其中不可降解材料选自聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯和膨体聚四氟乙烯，可降解材料选自聚乳酸、聚乙醇酸、聚丙醇酸或它们的共聚物。
本发明由于成功的解决了人工血管的顺应性不匹配以及形成血栓、内膜增生的难题，与现有技术相比具有如下优点1.人工血管移植后一直作为异物存在体内，不具有可塑性，不利于细胞的附着、分裂、增殖，不利于内皮化，直径不能小于6mm，否则易导致血栓形成，本发明获得的生物人工血管具有优良的力学性能及抗凝血性能，可构建任意口径血管，在体内可重塑，能体内诱导循环血内皮祖细胞种植。
2.在血管内皮化方面，本发明通过抗原抗体结合的方法在血管腔表面修饰趋化因子SDF-1，动员和吸引血液中的内皮祖细胞在此区域富集，再通过能捕获自体内皮祖细胞体内种植的因子如内皮生长因子II型受体KDR抗体或CD34抗体或CD34抗体、CD133抗体加内皮生长因子II型受体KDR抗体，捕获血液中的内皮祖细胞，并进而粘附分化成内皮细胞。则既能对抗血管内血栓形成，同时能有效抑制平滑肌细胞的病理性增殖导致的血管狭窄、闭塞。
3.本发明获取的人源性生物胶原已去除抗原性，可控降解，可原位成型。具有良好生物相容性，必要的力学性能。胶原是血管细胞外基质主要成分，并可在生理条件下自组装形成凝胶，以及可以与壳聚糖形成水凝胶。同时胶原的三维空间结构具有一定的强度，是组成血管的重要成分。用于构建生物人工血管的胶原，在保持三螺旋结构的同时去除其抗原点-尾肽。这种材料为天然生物材料，来源广泛，无毒性，降解产物可被机体吸收，不对机体产生危害，制作简便，易于塑形，并在功能适应性、组织相容性、理化性能、生物降解性、造价等方面优于人工合成材料。
4.生物血管支架本身具有良好的细胞诱导性，进一步复合表面修饰物质后，为种子细胞粘附、增殖及发挥抗凝血功能提供好的微环境。本发明中表面修饰有以下优点，能捕获自体内皮祖细胞体内种植的因子内皮生长因子II型受体KDR抗体或CD34抗体或CD34抗体、CD133抗体加内皮生长因子II型受体KDR抗体可以捕获循环血液中的内皮祖细胞在血管壁种植，交联的趋化因子SDF-1，可动员和吸引血液中的内皮祖细胞在此血管区域富集，粘附短肽、层粘连蛋白可促进离体和在体的内皮祖细胞粘附，内皮生长因子蛋白可诱导内皮相细胞生长及分化，抗凝血高分子材料N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯一方面可控制生长因子的释放，另一方面交联在血管表面在内皮种子细胞不足或细胞脱落时不会引起血栓形成。这种方法在体诱导血液中的内皮祖细胞粘附分化生长成内皮细胞，而不必离体分离培养，这样可大大提高人工血管内皮化效率。尚未有这些设想或实验结果的报道。
5.利用上述的良好生物人工血管支架材料，也可用来作为组织工程血管支架，种植平滑肌细胞，再离体种植内皮种子细胞，成为有生命的组织工程血管，可广泛用于临床上修复血管损伤。此外，上述诱导内皮祖细胞种植的表面修饰方法也可作为血管内支架的修饰方法。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的内容作进一步说明。
1.血管支架材料获取1.1无菌条件下取新鲜异种或同种血管或皮肤组织，去除其上所附软组织，无菌PBS冲洗，去除血栓凝块，无菌包装放入-80℃保存。复温于37℃用0.1mol/L PMSF溶液处理1-3小时，抗生素低渗及高渗缓冲液分别处理3-5小时，每1小时换液一次；组织以其质量4倍体积的2-6％醋酸溶液于33℃-37℃浸泡1-3h，漂洗后加入0.01-0.07％(w/w)脂肪酶于起始pH8.5、37℃-40℃下水解1-5h，无菌蒸馏水浸洗干净，在保持37℃、5％CO2用0.03％-0.2％(w/w)已活化的弹性蛋白酶处理6-24小时，每8小时换液一次，无菌抗生素蒸馏水浸洗干净。得到血管胶原纤维。加入按重量百分比0.05％-0.3％胃蛋白酶于起始pH8.0、25℃-40℃下水解16-24小时，加入0.08％-0.18％胰蛋白酶，保温33-37℃ 2-6小时，降温至4℃，加0.01-0.8％双氧水使酶失活。透析纯化，得到生物相容性良好的胶原，4℃冷藏保存，备用。
1.2编织血管1)将胶原和弹性材料按重量百分比70％∶30％用电纺丝纺织方法编织成不低于1mm口径的、能达到不同力学特性的血管支架，所述弹性材料为弹性蛋白和丝素蛋白按重量百分比为35％∶65％；或2)、将胶原、壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料按重量百分比55％∶15％∶5％∶25％编织成不低于1mm口径的、达到不同力学特性的血管支架，所述弹性材料为弹性蛋白和丝素蛋白按重量百分比为25％∶75％；将上述方法获得的血管支架运用形态学方法检测可见血管基质纤维分布完整，弹力纤维及胶原纤维分布均匀。压力容积实验对其顺应性进行检测，血管的压力容积曲线与抛物线的上升支非常接近，动脉P-V数据用二次抛物线关系式V＝aP2+bP+c进行拟合，其相关系数大于0.95，说明拟合效果良好，所对应动脉顺应性的计算方法C＝dv/dp＝2ap+b。其中在压力为100mmHg时，顺应性为5.60±0.45(×10-4ml/mmHg)。
或3)采用人工合成材料编织，人工合成材料采用不可降解材料或降解材料，其中不可降解材料选自膨体聚四氟乙烯，降解材料选自聚乳酸、聚乙醇酸、聚丙醇酸或它们的共聚物。
或2、采用去除抗原后的同种或异种血管基质材料。
3.血管表面修饰在血管腔表面修饰由能在体捕获自体内皮祖细胞的相关因子、趋化因子SDF-1、粘附短肽Gly-Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp、层粘连蛋白、生长因子蛋白，可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯组成的表面修饰混合物；其配比关系按重量百分比为能在体捕获自体内皮祖细胞的相关因子为0.001-0.003％，趋化因子蛋白SDF-1为0.001-0.005％，粘附短肽Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp为0.03-0.1％，层粘连蛋白为0.001-0.005％，，内皮生长因子蛋白为0.003-0.008％，可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料N-磺酸-光交联-壳聚糖硫酸酯70-90％，其余为去离子水，将它们充分混合成水溶液，灌注到步骤1)或步骤2)制备好的血管腔内，经紫外光反应将其交联在血管腔表面，真空干燥备用；其中在体捕获自体内皮祖细胞的相关因子为内皮生长因子II型受体KDR抗体或CD34抗体或CD34抗体、CD133抗体和KDR抗体三种抗体按重量百分比20～40％∶25～45％∶30～50％的复合，生长因子蛋白为内皮生长因子或内皮生长因子加少量的转化生长因子。
经上述步骤进行表面修饰后的血管，经扫描电镜检测可见血管内腔全部由表面修饰物覆盖，并附着均匀。
对上述步骤获得的血管进行周向张力检测，实验中对构建好的生物人工血管逐步增加力刺激，当静水压达到2000mmHg时仍未见血管破裂，说明构建的血管抗胀裂强度/静水压大于2000mmHg。
4.体内诱导循环血中内皮祖细胞种植将构建的生物人工血管移植到动物体内，将动物原有的血管去除一段，将人工血管吻合到相应部位。
对上述步骤移植的生物人工血管7天后进行激光共聚焦检测，可见血管腔密布血管内皮祖细胞，30天后经光镜及电镜检测，可见血管腔内皮祖细胞形态正常，密集排列，沿血管长轴分布，说明在上述条件下，血管成功进行了内皮祖细胞种植，银染也表明内皮祖细胞成功种植在血管基质上。荧光显微镜显示种植在血管基质材料上的内皮祖细胞能分泌细胞外基质。表明内皮祖细胞可在血管基质上正常生长。HE染色可见中膜有大量的平滑肌细胞顺血管长轴分布。
备择方案，在体外构建组织工程血管时，可按前述方法制备血管支架并表面修饰后，按下述步骤5，6体外种植平滑肌细胞，血管内腔种植内皮细胞。
5.平滑肌细胞种植，在自行构建血管培养系统中，原代培养的平滑肌细胞扩增传代后取3-6代，加转化生长因子，以浓度3×106cell/ml注射到血管腔，保持管腔内一直有一定压力进行培养。或者平滑肌细胞种植方法是用同样数量细胞采用间隔相同的点微注射到血管中膜，在血管细胞化生物反应器中进行培养。
上述步骤种植的平滑肌细胞形态学检测可见血管腔平滑肌细胞形态正常，密集排列，沿血管长轴分布，说明在上述条件下，血管成功进行了平滑肌细胞化。
6.体外内皮祖细胞分化的种植，内皮祖细胞扩增传代后取3-6代，以浓度3×106cell/ml注射到血管腔，粘附90-120min后，在2-4天的内皮祖细胞种植培养过程中，腔内流速逐渐增高从0.033到0.1ml/s，在血管壁相应的剪切应力约为1×10-2N/m2到4×10-2N/m2之间，构建组织工程血管。
下面举例进行说明，但本发明的应用不仅在于此。
实施例1.一种能在体捕获内皮祖细胞的生物人工血管制备，按上述步骤1方法制备血管基质材料，按步骤3进行表面修饰后，按步骤4进行动物实验。
获得的生物人工血管移植到小型猪髂内动脉，7天后进行内皮祖细胞荧光标记激光共聚焦检测，可见血管腔密布血管内皮祖细胞，30天后经光镜及电镜检测，可见血管腔内皮祖细胞形态正常，密集排列，沿血管长轴分布，说明在上述条件下，血管成功进行了内皮相细胞种植，银染也表明内皮祖细胞成功种植在血管基质上。荧光显微镜显示种植在血管基质材料上的内皮祖细胞能分泌细胞外基质。表明内皮祖细胞可在血管基质上正常生长。
与按上述步骤1方法制备生物人工血管，将步骤3中能在体捕获自体内皮祖细胞的相关因子、趋化因子SDF-1去除后其他因素不变表面修饰后进行比较，7天后进行内皮祖细胞荧光标记激光共聚焦检测，可见血管腔只有零星的血管内皮祖细胞分布，30天后经光镜及电镜检测，仅见少量的血管腔内皮祖细胞分布，说明在上述条件下，血管未能成功进行内皮祖细胞种植。
以上结果说明本发明通过在血管表面修饰可捕获内皮祖细胞的因子、趋化因子SDF-1，可有效诱导生物人工血管内皮化，从而有效抑制血管内血栓形成和内膜增生，达到长期抗凝的目的。
实施例2.一种能在体捕获内皮祖细胞的生物人工血管制备，按上述步骤1方法制备血管基质材料，按步骤3进行表面修饰后，按步骤4进行动物实验。
获得的小直径生物人工血管移植到犬颈总动脉，6个月后进行检测。见血管内皮细胞分布完好，形态正常，中膜有大量的平滑肌细胞顺血管长轴分布，血管保持通畅，没有血管内膜增生及血栓形成。
与小直径膨体聚四氟乙烯人工血管移植进行比较。可见部分膨体聚四氟乙烯人工血管管腔全部闭塞，血管内有血栓形成，未见增生，血管壁有大量的炎性细胞浸润，说明直接导致血栓形成。一部分移植膨体聚四氟乙烯人工血管6个月后血管闭塞，血管内膜呈典型移植物动脉粥样硬化病理改变，可见均匀弥漫性内膜增厚，病灶规则，呈向心性轮环状，病灶内富含泡沫细胞，炎症反应十分明显，纤维形成不充分，钙化不明显，在增厚的内膜中间有一小的圆形空隙，内被血栓充填，说明在血管狭窄到一定程度后，导致血栓形成，血管闭塞。
而本方法构建的能在体捕获内皮祖细胞的生物人工血管移植6个月后经光镜及电镜检测，可见血管腔内皮细胞形态正常，密集排列，沿血管长轴分布，银染也表明内皮细胞成功种植在血管基质上。荧光显微镜显示种植在血管基质材料上的内皮细胞能分泌细胞外基质。表明内皮细胞可在血管基质上正常生长。HE染色基本未见血管内膜层增厚及明显的平滑肌细胞增生，血管形态正常，各层结构完整，排列整齐，未见钙化区及炎性细胞浸润，免疫组化检测未见血管有CD4表达。血管基本未见凋亡细胞。免疫荧光用Brdu、α-actin为单抗检测内膜层未见红色荧光。说明内膜层未见增殖的平滑肌细胞，与HE染色结果相吻合。以上结果说明本发明通过在血管表面修饰可捕获内皮祖细胞的因子和抗凝、具有控释功能的材料相结合，则既能有效诱导生物人工血管内皮化，从而有效抑制血管内血栓形成和内膜增生，达到长期抗凝的目的。
实施例3.一种能在体捕获内皮祖细胞的生物人工血管制备，按上述步骤2方法制备血管基质材料，按步骤3进行表面修饰后，按步骤4进行动物实验。
获得的脱细胞生物人工血管经表面修饰后移植到犬髂外动脉，7天后进行内皮祖细胞荧光标记激光共聚焦检测，可见血管腔密布血管内皮祖细胞，30天后光镜及电镜检测，可见血管腔内皮祖细胞形态正常，密集排列，沿血管长轴分布，说明在上述条件下，血管成功进行了内皮祖细胞种植，荧光显微镜显示种植在血管基质材料上的内皮祖细胞能分泌细胞外基质。表明内皮祖细胞可在去抗原的血管基质上正常生长。
以上结果说明本发明通过在去抗原的血管基质上表面修饰可有效诱导生物人工血管内皮化，从而有效抑制血管内血栓形成和内膜增生，达到长期抗凝的目的。
实施例4.一种能在体捕获内皮祖细胞的人工血管制备，按上述步骤1的[1.2中(或3)]方法制备人工血管基质材料，按步骤3进行表面修饰后，按步骤4进行动物实验。
获得的人工材料编织的人工血管经表面修饰后移植到犬髂内动脉，14天后进行内皮祖细胞荧光标记激光共聚焦检测，可见血管腔有血管内皮祖细胞分布，30天后光镜及电镜检测，可见血管腔内皮祖细胞形态正常，密集排列，沿血管长轴分布，说明在上述条件下，人工血管也能成功进行内皮祖细胞种植。
以上结果说明本发明通过在人工材料编织的人工血管表面修饰也可有效诱导人工血管内皮祖细胞种植。
实施例5.能离体诱导细胞化的生物组织工程血管制备，按上述步骤1方法制备相应管径的血管基质材料，按步骤3进行表面修饰后，按步骤4种植人平滑肌细胞，按步骤5种植人内皮祖细胞。扫描电镜检测，血管已完全内皮化，平滑肌细胞形态学检测可见血管腔平滑肌细胞形态正常，密集排列，沿血管长轴分布。显微外科移植到裸鼠6个月后血流多谱勒检测表明血管保持通畅，HE染色未见血管腔狭窄，血管内膜增生，而对照组未经表面修饰的血管内皮层形成不完整，移植后血管腔狭窄，血管内膜增生，一部分血管全部闭塞。
实施例6.一种能在体捕获内皮祖细胞的生物人工血管制备，按步骤1方法制备血管基质材料，按步骤3进行表面修饰后，用于透析病人未见血栓形成，而对照组血栓形成。
权利要求
1.一种能在体捕获内皮祖细胞的生物人工血管制备，其特征是采用如下的方法制备(1)、血管支架复合材料的获取由具有良好生物相容性及可降解特性的胶原为主体材料，由异种或同种组织提取的生物胶原去除抗原后获得，保留胶原的天然网状结构，a、用电纺丝纺织方法将获得的胶原和弹性材料复合，编织血管，或b、用电纺丝纺织方法将胶原、壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料复合，编织血管，所述弹性材料为弹性蛋白和丝素蛋白；或c、直接采用人工合成材料用电纺丝纺织方法编织血管；或(2)、采用去除抗原后的同种或异种血管；(3)、血管表面修饰将步骤(1)或(2)获得的血管，在血管腔表面修饰由能在体捕获自体内皮祖细胞的相关因子、趋化因子SDF-1、粘附短肽Gly-Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp、层粘连蛋白、生长因子蛋白，可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料N—磺酸—光交联—壳聚糖硫酸酯组成的表面修饰混合物；其配比关系按重量百分比为能在体捕获自体内皮祖细胞的相关因子为0.001-0.003％，趋化因子蛋白SDF-1为0.001-0.005％，粘附短肽Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp为0.03-0.1％，层粘连蛋白为0.001-0.005％，，内皮生长因子蛋白为0.003-0.008％，可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料N—磺酸—光交联—壳聚糖硫酸酯70-90％，，其余为去离子水，将它们充分混合成水溶液，灌注到步骤(1)或步骤(2)制备好的血管腔内，经紫外光反应将其交联在血管腔表面，真空干燥备用；其中在体捕获自体内皮祖细胞的相关因子为内皮生长因子II型受体KDR抗体或CD34抗体或CD34抗体、CD133抗体和KDR抗体三种抗体按重量百分比20～40％∶25～45％∶30～50％的复合，生长因子蛋白为内皮生长因子或内皮生长因子加少量的转化生长因子；(4)、获得的生物人工血管可作为组织工程血管支架，在此基础上再种植平滑肌细胞或和内皮细胞。
2.一种在体捕获内皮祖细胞的生物人工血管，其特征是采用如下的方法制备(1)、血管支架复合材料获取由具有良好生物相容性及可降解特性的胶原为主体材料，由异种或同种组织提取的生物胶原去除抗原后获得，保留胶原的天然网状结构，将获得的胶原和弹性材料复合，用电纺丝纺织方法编织血管，所述弹性材料为弹性蛋白或/和丝素蛋白；或直接采用人工合成材料用电纺丝纺织方法编织血管；或(2)、采用去除抗原后的同种或异种血管；(3)、血管表面修饰将步骤(1)、(2)获得的血管，在血管腔表面修饰由能在体捕获自体内皮祖细胞的相关因子、趋化因子SDF-1、粘附短肽Gly-Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp、层粘连蛋白、生长因子蛋白，可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料N—磺酸—光交联—壳聚糖硫酸酯组成的表面修饰混合物；其配比关系按重量百分比为能在体捕获自体内皮祖细胞的相关因子为0.001-0.003％，趋化因子蛋白SDF-1为0.001-0.005％，粘附短肽Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp为0.03-0.1％，层粘连蛋白为0.001-0.005％，，内皮生长因子蛋白为0.003-0.008％，可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料N—磺酸—光交联—壳聚糖硫酸酯70-90％，，其余为去离子水，将它们充分混合成水溶液，灌注到步骤(1)或步骤(2)制备好的血管腔内，经紫外光反应将其交联在血管腔表面，真空干燥备用；其中在体捕获自体内皮祖细胞的相关因子为内皮生长因子II型受体KDR抗体或CD34抗体或CD34抗体、CD133抗体和KDR抗体三种抗体按重量百分比20～40％∶25～45％∶30～50％的复合，生长因子蛋白为内皮生长因子或内皮生长因子加少量的转化生长因子。
3.根据权利要求1或2所述的能在体捕获内皮祖细胞的生物人工血管，其特征是在其制备方法的步骤(1)中所述的人工合成材料采用不可降解材料或可降解材料，其中不可降解材料选自聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯和膨体聚四氟乙烯，可降解材料选自聚乳酸、聚乙醇酸、聚丙醇酸或它们的共聚物。
4.根据权利要求1或2所述的能在体捕获内皮祖细胞的生物人工血管，其特征是其制备方法步骤(1)中血管支架材料的获取采用以下方式无菌条件下取新鲜异种或同种血管或皮肤组织，去除其上所附软组织，无菌PBS冲洗，去除血栓凝块，无菌包装放入-80℃保存；复温于37℃用0.1mol/L PMSF溶液处理1-3小时，抗生素低渗及高渗缓冲液分别处理3-5小时，每1小时换液一次；组织以其质量4倍体积的2-6％醋酸溶液于33℃-37℃浸泡1-3h，漂洗后加入0.01-0.07％(w/w)脂肪酶于起始pH8.5、37℃-40℃下水解1-5h，无菌蒸馏水浸洗干净，在保持37℃、5％CO2用0.03％-0.2％(w/w)已活化的弹性蛋白酶处理6-24小时，每8小时换液一次，无菌抗生素蒸馏水浸洗干净，得到血管胶原纤维；加入按重量百分比0.05％-0.3％胃蛋白酶于起始pH8.0、25℃-40℃下水解16-24小时，加入0.08％-0.18％胰蛋白酶，保温33-37℃2-6小时，降温至4℃，加0.01-0.8％双氧水使酶失活；透析纯化，得到生物相容性良好的胶原，4℃冷藏保存，备用；编织血管将胶原和弹性材料按重量百分比60～80％∶20～40％用电纺丝纺织方法编织成不低于1mm口径的血管支架，所述弹性材料为弹性蛋白和丝素蛋白按重量百分比为25～40％∶60～75％；或将胶原、壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料按重量百分比50～70％∶12～18％∶1～5％∶15～35％编织成不低于1mm口径的、达到不同力学特性的血管支架，所述弹性材料为弹性蛋白或/和丝素蛋白按重量百分比为25～40％∶60～75％；或采用人工合成材料编织。
5.根据权利要求1所述的能在体捕获内皮祖细胞的生物人工血管，其特征是其制备方法步骤(4)中平滑肌细胞种植方式如下在自行构建血管培养系统中，原代培养的平滑肌细胞扩增传代后取3-6代，加转化生长因子，以浓度3×106cell/ml注射到血管腔，保持管腔内一直有一定压力进行培养；或者平滑肌细胞种植方法是用同样数量细胞采用间隔相同的点微注射到血管中膜，在血管细胞化生物反应器中进行培养；内皮祖细胞分化的内皮细胞种植方法如下内皮祖细胞扩增传代后取3-6代，以浓度3×106cell/ml注射到血管腔，粘附90-120min后，在2-4天的内皮祖细胞种植培养过程中，腔内流速逐渐增高从0.033到0.1ml/s，在血管壁相应的剪切应力为1×10-2N/m2到4×10-2N/m2之间，构建组织工程血管。
全文摘要
本发明涉及一种能在体捕获内皮祖细胞的生物人工血管制备，其特征是采用如下的方法制备1.血管支架复合材料的获取；或2.采用去除抗原后的同种或异种血管；3.血管表面修饰；还可以4.获得的生物人工血管可作为组织工程血管支架，在此基础上再种植平滑肌细胞或/和内皮细胞。本发明获得的生物人工血管具有优良的力学性能及抗凝血性能，可构建任意口径血管，在体内可重塑，能体内诱导循环血内皮祖细胞种植。能对抗血管内血栓形成，同时能有效抑制平滑肌细胞的病理性增殖导致的血管狭窄、闭塞。
文档编号C12N5/071GK101066477SQ20071007848
公开日2007年11月7日 申请日期2007年5月17日 优先权日2007年5月17日
发明者朱楚洪, 应大君, 糜建红, 李立, 侯春丽 申请人:中国人民解放军第三军医大学