专利名称：一种麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法
技术领域：
本发明涉及一种植物种子蛋白质提取方法，更特别的涉及一种麻疯 树种子胚乳蛋白质提取方法。
二背景技术：
麻疯树(/a"o; / a cwrcas L.)是大戟科麻疯树属多年生落叶亚乔 木植物，生长快，当年可开花结果，种子含油高，还具有抗干旱、耐贫 瘠、抗逆性强。随着能源危机和环境污染问题的日益加剧，可再生能源 的开发利用迫在眉睫。正是麻疯树的这些优点使其成为生物质能研究中 一个被相当看好的树种。联合国已将麻疯树及其提取物用于贫穷的千热 河谷地区生态建设，并作为扶贫的重大项目加以扶持。在我国四川、云 南等省水土流失严重区域，麻疯树在保水固土，防沙化、增加有机土质、 建防护林等方面发挥了重要作用，并被国家列为发展再生能源生物柴油 的重要树种。麻疯树种子含有大量的油分，除主要做生物燃料外，还可 做肥皂、化妆品，同时含有多种活性成分可用于农药和医药领域。因此 广泛分布于热带亚热带地区的麻疯树是集环保、能源建设、生态建设、 医药产品、扶贫等为一体的多年生木本。
麻疯树种子含有很多有用蛋白质，对其研究较多的是一种麻疯树毒 蛋白质(Curcin),又称核糖体失活蛋白(RIPs)，它具有抑制真核细胞 无细胞系统蛋白质合成的作用，对肿瘤癌症、真菌病害有较强的抑制和 杀伤能力，在临床医学及农业应用上表现出诱人的前景。
麻疯树胚乳约占种子重量的55%以上，是储藏脂肪、蛋白等有效 成分的重要部位，其蛋白质含量约占种仁干重的25%以上。但对其蛋 白质组分和种类至今知之甚少，为了很好的研究、开发和利用麻疯树种 子生物学问题和经济价值，必须建立高效的种子胚乳蛋白质的提取方 法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种以麻疯树种子胚乳为原料，提取蛋白 质的方法。
本发明的目的之二是提供一种麻疯树种子胚乳蛋白质大量、快速和 高效的提取方法。
本发明的这些以及其他目的将通过下列详细描述和说明来进一步体 现和阐述。
本发明的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，是以麻疯树种子胚乳为 原料。
进一步的，本发明的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，包括如下步
骤
A、 取成熟风干麻疯树种子胚乳，用研钵研磨成精细的粉末，然后 加入预冷勻浆緩冲液，在水上研磨至匀浆；
B、 将匀浆转移到离心管中，4°(3下于10000 - 20000g离心10-20 分钟，弃沉淀，在上清液中加入10% (v/v)的三氯乙酸，然后在冰浴 中沉淀20 - 50分钟；
C、 与B步骤相同条件下再次离心后，去掉上清液，沉淀用丙酮清 洗后离心，再取沉淀；
D、重复用丙酮清洗2-3次，4℃下于10000 - 20000g离心10-20 分钟，去上清液，将沉淀真空干燥得到蛋白干粉。
可以逸择的是，本发明的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，包括如 下步骤
A、 取200毫克成熟风干麻疯树种子胚乳，用研钵研磨成精细的粉 末，然后加入2毫升预冷匀浆緩沖液，在水上研磨至匀浆；
B、 将匀浆转移到离心管中,4℃下于12000 - 18000g离心12-15 分钟，弃沉淀，在上清液中加入10% (v/v)的三氯乙酸，然后在水浴 中沉淀30 - 50分钟；
C、 与B步骤相同条件下再次离心后，去掉上清液，沉淀用丙酮清 洗后离心，再取沉淀；
D、 重复用丙酮清洗2-3次，4℃下于12000 - 18000g离心30-50 分钟，去上清液，将沉淀真空干燥得到蛋白干粉。
在本发明的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法中，所迷的预冷匀浆緩 沖液含有Tris-HCl、蔗糖、乙二胺四乙酸、二好u^又糖醇和1 %辛基苯氧 基聚乙氧乙醇X-100，余量是去离子水。较好的是所述的2毫升预冷 匀浆緩冲液含有15-25 mM Tris-HC1、 200 - 300mM蔗糖、5-13mM乙 二胺四乙酸、0.5-1.5 mM 二硫叔糖醇和1%辛基苯氧基聚乙氧乙醇X -100，余量是去离子水。所述的Tris-HCl的PH值为7-9,较好的是 7-8。 4分末的粒径为0. 01-0. lmm，研磨时间为3-10分钟，转速为120-200转/分钟。
本发明通过三氯乙酸/丙酮沉淀法解决了麻疯树种子胚乳因含油高 达60%而蛋白质提取难的问题，并且创建了麻疯树种子胚乳蛋白质大量、快速和高效的提取方法。
用本发明的方法提取的麻疯树种子胚乳蛋白质对胃癌细胞生长具有 强抑制作用，并且毒性低，麻疯树毒蛋白属I型核糖体失活蛋白，细胞毒性极低，对正常细胞的生长几乎没有影响；作用镨广，在一定的浓度 范围下，对多种主要农作物和森林树种的真菌病害的生长有抑制作用， 并且可与其它抗真菌病资源协同作用，提高作用强度和增加作用谱。
四
图l是麻疯树种子蛋白质双向电泳蛋白质组表达语。
图2是麻疯树种子蛋白质组表达i普图象数字分析结果。
五具体实施例方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但实施例仅用于说明， 并不能限制本发明范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、量均为以总重量为基础的重 量单位，所有的原料均可以从市场购得。
实施例1
按如下步骤进行提取
A、 取200毫克成熟风干麻疯树种子胚乳，用研钵研磨成精细的粉 末(粒径约为0. Olmm)，然后加入2毫升预冷匀浆緩冲液，该緩冲液含 有20 mM Tris-HC1、 230mM蔗糖、8mM乙二胺四乙酸、0.8 mM 二硫duF唐 醇和1%辛基苯氧基聚乙氧乙醇X-100,余量为去离子水。在冰上研磨 至匀浆(研磨时间为3分钟，转速为200转/分钟左右)；
B、 将匀浆转移到离心管中，4℃下于13000g离心15分钟，弃沉淀， 在上清液中加入10% (v/v)的三氯乙酸，然后在冰浴中沉淀50分钟；
C、 与B步骤相同条件下再次离心后，去掉上清液，沉淀用丙酮清 洗后离心，再取沉淀；
D、 重复用丙酮清洗2-3次，4。C下于14000g离心50分钟，去上 清液，将沉淀真空干燥得到蛋白干#%
实施例2
按如下步骤进行提取
A、 取200毫克成熟风干麻疯树种子胚乳，用研钵研磨成精细的粉 末(粒径为0. lmm左右)，然后加入2毫升预冷匀浆緩沖液，该緩沖液 含有20 mM Tris-HC1、 250mM蔗糖、10mM乙二胺四乙酸、1. 0 mM 二硫 叔糖醇和1%辛基苯氧基聚乙氧乙醇X-IOO、余量为去离子水。在冰上 研磨至匀浆(研磨时间为IO分钟，转速为120转/分钟左右)；
B、 将匀浆转移到离心管中，4。C下于15000g离心15分钟，弃沉淀， 在上清液中加入10% ( v/v )的三氯乙酸，然后在水浴中沉淀40分钟；
C、 与B步骤相同条件下再次离心后，去掉上清液，沉淀用丙酮清 洗后离心，再取沉淀；
D、 重复用丙酮清洗2-3次，4。C下于15000g离心40分钟，去上 清液，将沉淀真空干燥得到蛋白干粉。
权利要求
1、一种麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，其特征在于是以麻疯树种子胚乳为原料。
2、 根据权利要求1所述的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，其特征在 于包括如下步骤A、 取成熟风干麻疯树种子胚乳，用研钵研磨成精细的粉末，然后加 入预冷匀浆緩冲液，在水上研磨至匀浆；B、 将匀浆转移到离心管中，4。C下于10000 - 20000 g离心10-20 分钟，弃沉淀，在上清液中加入10% (v/v)的三氯乙酸，然后 在水浴中沉淀20 - 50分钟；C、 与B步骤相同条件下再次离心后，去掉上清液，沉淀用丙酮清洗 后离心，再取沉淀；D、 重复用丙酮清洗2-3次，4。C下于10000 - 20000g离心10-20 分钟，去上清液，将沉淀真空千燥得到蛋白干粉。
3、 根据权利要求1所述的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，其特征在 于包括如下步骤A、 取200毫克成熟风干麻疯树种子胚乳，用研钵研磨成精细的粉 末，然后加入2毫升预冷匀浆緩冲液，在水上研磨至匀浆；B、 将匀浆转移到离心管中，4"C下于12000 - 18000g离心12 - " 分钟，弃沉淀，在上清液中加入10% (v/v)的三氯乙酸，然 后在水浴中沉淀30 - 50分钟；C、 与B步骤相同条件下再次离心后，去掉上清液，沉淀用丙酮清洗后离心，再取沉淀； D、重复用丙酮清洗2-3次，4。C下于12000 - 18000g离心30-50 分钟，去上清液，将沉淀真空干燥得到蛋白干粉。
4、 根据权利要求2或3所述的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，其特 征在于所述的预冷匀浆緩沖液含有Tris-HC1、蔗糖、乙二胺四乙酸、 二疏叔糖醇和1 %辛基苯氧基聚乙氧乙醇X - 100。
5、 根据权利要求4所述的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，其特征在 于所述的2毫升预冷匀浆緩冲液含有15 - 25 mM Tris-HC1、 200 - 300rnM 蔗糖、5 - 13mM乙二胺四乙酸、0. 5 - 1. 5 mM 二硫叔糖醇和1 %辛基苯 氧基聚乙氧乙醇X-IOO。
6、 根据权利要求4或5所述的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，其特 征在于所述的Tris-HCl的PH值为7-9。
7、 根据权利要求2或3所述的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，其特 征在于所述粉末的粒径为0. 01-0. lmm。
8、 根据权利要求2或3所述的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，其特 征在于所述研磨时间为3-10分钟，转速为120-200转/分钟。
全文摘要
本发明公开了一种麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，包括取成熟风干麻疯树种子胚乳，用研钵研磨成精细的粉末，然后加入预冷匀浆缓冲液，在冰上研磨至匀浆后转移到离心管中，4℃下于10000-20000g离心10-20分钟，弃沉淀，在上清液中加入10％(v/v)的三氯乙酸，然后在冰浴中沉淀20-50分钟；再次离心后，去掉上清液，沉淀用丙酮清洗后离心，再取沉淀；重复用丙酮清洗2-3次，4℃下于10000-20000g离心10-20分钟，去上清液，将沉淀真空干燥得到蛋白干粉。本发明解决了麻疯树种子胚乳因含油高达60％而蛋白质提取难的问题，创建了麻疯树种子胚乳蛋白质大量、快速和高效的提取方法。
文档编号A23J1/00GK101171952SQ200710087030
公开日2008年5月7日 申请日期2007年3月15日 优先权日2007年3月15日
发明者刘玉君, 沈世华, 平 苟 申请人:云南神宇新能源有限公司