一种与猪多趾相关的dna片段的制作方法

专利名称：一种与猪多趾相关的dna片段的制作方法
技术领域：
本发明涉及突变和遗传工程领域，具体涉及一种动物肢体异常发育相关基因。
技术背景多指(趾)是动物四肢形成过程中由于错误信号引发的一种肢体畸形，在人、鼠、鸡、 猪上时有发生，而且不同物种间表型相似。目前，在人、鼠、鸡的多指(趾)上开展了大量 的研究，并取得了一定的进展，主要表现为对多指(趾)的表现类型、遗传方式已经明确， 定位了多指(趾)基因的染色体区段(人7q36、 2q31和7pl3;鼠5号染色体上与人7q36 同源的区断；鸡2p45),克隆了诸如Shh (sonic hedgehog)、 Lrabrl (lamb region 1) /C7orf2 (chromosome 7 open reading frame 2)、 bnbr2、 Hox、 Gli、 EN2 (ENGRAILED2)、 FGF、 FgF 受体、RAR (retinoic acid receptors)、 WNT (wg and int)、 BMP (bone morphogenetic protein) 等大量候选基因，并发现基因的多种突变形式或剪接类型。在众多候选基因中，Lmbrl基因是肢体结构形成的必需基因。在人和鼠上，Lmbrl基因活 力的差异可引起相反的肢体异常表型Lmbrl功能获得性突变可引起附加肢结构的形成，产 生额外肢或额外趾；功能丢失型突变可引起远肢结构的丢失或趾数减少。鸡Lmbrl基因1244 位碱基C突变T还可引起鸡产生五趾(鸡通常为四趾)；而且，在屠体体重、半净膛重、全净 膛重、胸肉重、腿肉重、腹脂重等屠体性状中，CT型鸡明显大于CC型鸡。因此，在育种群 选择CT型个体，可提高生长速度，增加屠体产量；此外，鸡Lmbrl基因还可作为检测其发育 性状的标记，通过检测鸡Lmbrl基因1244位碱基是C还是T可检测出其基因型，可作为分子标记辅助选择，在鸡的育种中有巨大的应用前景。CN02153389.X在实际生产中，我们发现猪的多趾绝大多数为轴前多趾(PPD)，但控制猪多趾基因的研 究尚属空白。至今尚无较完整的猪Lmbrl基因序列，更没有发现正常猪与多趾猪在Lmbrl基 因序列上的差异，因此，不能进行突变位点的基因型与猪屠体性状间的相关性分析，进而探 讨Lmbrl基因作为猪屠体性状分子标记辅助选择的可行性。 发明内容本发明的目的在于提供一种与猪多趾相关的DNA片段。 本发明的另一目的在于提供该DNA片段在检测猪发育性状方法中的应用。 本发明实现上述目的的技术方案是一种与猪多趾相关的DNA片段，该.DNA片段是下列多核苷酸之一(1) 核苷酸序列为SEQNO.l和SEQNO.3的多核苷酸；(2) 编码氨基酸序列为SEQN0.2和SEQN0.4的多肽的多核苷酸。
本发明所述的DNA片段之一 (SEQ NO.l)分离于正常猪(CRP配套系B系猪)心脏 组织，序列全长1797bp，包括了猪多趾相关基因的部分编码区(1-1178 bp)和完整3端非 翻译区(1179-1797 bp)，编码氨基酸序列为SEQNO. 2的多肽，其编码区与人(NM-002458. 3)、 鼠(NM-020295. 3)、鸡(AY251537. 2)的Lmbrl相似性极高，核酸序列相似性分别为90%、 87%、 80%;所编码的多肽序列相似性分别为96%、 96%、 91%。本发明所述的DNA片段之二 (SEQN0.3)是从多趾猪(CRP配套系B系猪)心脏组织 中分离出来的，是猪多趾相关基因中的一个片段，与正常基因SEQNO.l相比，其突变区域 为755 768bp，在SEQNO.l的相应位置为922 934bp。在此区域，相对于正常猪，多趾猪 共有13处突变G755C、 A756T、 A757G、 T758C、 C759A、 A760G、 C761T 、 T762 G、 A763C、G764T、 A765G、 T767G、 T768A(突变前GAATCACTAGATTT，突变后CTGCAGTGCTGTGA，)。其中，前ll处突变为错义突变，后2处为无意突变；错义突变导致相应的蛋白质序列有四个氨基酸发生变化G突变为A、 I突变为A、 T突变为V、 R突变为L，无意突变导致阅读框提 前终止；相对于正常猪SEQNO.l，即缺失部分外显子16和完整的外显子17共计246个核苷 酸。本发明所述的DNA片段发生上述突变后的cDNA序列为SEQN0.3，全长为1069bp，包括 了部分编码区(卜768 bp)和完整3端非翻译区(769-1069 bp)，所编码的多肽序列为SEQ N0.4。本发明所述的DNA片段的大量制备可通过构建克隆载体，以及转化到原核或真核宿主 中进行大量复制，构建载体和转化的方法均为常用的方法，所用的载体和宿主细胞可以是常 用的载体和宿主细胞，本领域技术人员可根据需要选择，这里就不作详述。本发明所述的DNA片段与猪肢体发育密切相关，其DNA片段的外显子16前4个密码 子发生错义突变直接导致猪轴前多趾，本发明利用该DAN分子在正常猪和多趾猪之间的差异， 提供一种检测猪发育性状的方法，具体是(1) 提取代检测样本的总RNA，利用下述引物进行RT-PCR: GSP2: 5'-GAC TTG CCG CTC ATT GAC AAC GAC-3'NUP: 5'-MG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3';(2) 利用下述引物对步骤(1) RT-PCR产物进行PCR。 NGSP2: 5'-CGC CGT GGC TTG TAA CAT TCT CTG C-3' NUP: 5'-MG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3';
(3)然后在1%琼脂糖凝胶检测PCR产物。正常猪的产物为1197 bp，多趾猪的产物为 636bp。本发明获得了比较完整的猪Lmbrl基因cDNA的序列SEQ NO.l，并发现了该基因存在两 种剪接类型与正常剪接类型相比，多趾猪Lmbrl基因存在缺失外显子16和17共246个核 苷酸的突变剪接类型；同时，本发明还发现多趾猪的错义突变位点，并据此提供了一种快速、 准确检测猪发育性状的方法，为本发明所述的DNA片段作为猪屠体性状分子标记辅助选择的 可行性奠定了基础。
具体实施方式
例1本发明DNA片段的获得1样品的采集猪宰杀后，立即采集心、肝、脾、肺、肾、前肢肌肉等组织，切成小块装在冻存管中， 立即放于液氮中保存，回实验室后于-8(TC超低温冰箱中保存。2猪同源EST的寻找及引物设计以A/小鼠的多趾候选基因C7orf2/Lmbrl基因的编码序列作为搜索对象，在NCBI网站进 行BLAST,获得一段猪的同源EST(CV878120， 724bp)，该序列的6bp-636bp部分与人C7orf2 基因序列((登录号:NM—022458,共2781bp，其中155bp-1627bp部分为CDS))的497bp-1148bp 部分同源性为88%。以这段EST序列为基础，使用Primer5.0软件，设计RT-PCR和RACE 反应的引物。ESTF: 5'-GCC TTG CTC ATT CTC GGG AT-3';ESTR: 5'-TCC CTT TGG CAT CGC TGT T-3';GSP1: 5'-TAT MG CCG ACC GGG GTG CAC AAG A -3';NGSP1: 5'-CCC ACA CCA TCC CGA GAA TGA GCA A-3';GSP2: 5'-GAC TTG CCG CTC ATT GAC MC GAC-3';NGSP2: 5'-CGC CGT GGC TTG TAA CAT TCT CTG C-3';NUP: 5'-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3';3总RNA提取及检测 . 3.1 RNA提取前的准备工作(1)将研钵、玻璃瓶等洗净，置于37-C烘干后再用高温烘箱18(TC烘8h(2) RNase-free水的制备使用RNase-free的玻璃瓶，向超纯水中加入DEPC至终浓度0.1% (v/v)放置过夜后，高温高压灭菌；(3) 将枪头、离心管、PCR管等放在0.1M的DEPC水中浸泡过夜，高温高压灭菌；(4) 75%乙醇用DEPC处理水配制。3.2 RNA提取步骤(1) 组织研磨将超低温保存的样品取出称量50-100mg心脏组织，迅速转移至用液氮预冷的 研钵中，用研杵研磨，期间不断加入液氮，直至研磨至粉末状；(2) 把研磨好的组织用小勺转移至预先加有lml RNAiso Reagent的1.5ml离心管中，用力振 荡混匀，静置5mim(3) 12000g4。C离心5min;(4) 小心吸取上清液，转移至新的离心管中；(5) 向其中加入1/5体积量RNAiso Reagent的氯仿，用力振荡，室温静置5min;(6) 12000g4。C离心10min;(7) 吸取上清液转移至一新的离心管中，向其中加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，15-30°C 静置10min;(8) 12000g4。C离心10min;(9) 小心弃去上清，加入lml75。/。的乙醇，轻轻上下颠倒洗涤，12000g4°C离心5min;(10) 小心弃去乙醇，室温干燥沉淀2-5min，加入40ul RNase-free水溶解沉淀；3.3 RNA质量检测(1) 电泳检测取5ul RNA+lul 6xLoading Buffer, 150v电泳15min，观测条带情况，拍照保 存；(2) OD值测定打开紫外分光光度计电源和程序，预热30min，用DEPC处理水把微量比色 皿洗净，调零，取出外面的比色皿，把待测样品稀释50倍放于比色皿中(2ulRNA+98ulDEPC 处理水)，测定00260、 OD280、 D260/OD280，记录分析结果。4反转录在PCR管中加入以下试剂For preparation of 5，-RACE-Ready cDNA: RNA样品3ul、 5，-CDS primerlul、 BD SMART II A oligolul; For preparation of 3'陽RACE-Ready cDNA: RNA样品 3ul、 3，陽CDS primerlul、 ddH20 lul |混合并短暂离心
70'C孵育2min 冰Jh放置2min 短暂离心使试剂到管底在每个管中加入5xFirst-Strand Buffer 2ul、 DTT (20mM) lul、 dNTPMix (10mM) lul、 BD PowerScript Reverse Transcriptase lul用枪头轻轻吹打混合，短暂离心42。C孵育90lnin (PCR仪中进行) 加入100ul Tricie-EDTA Buffer稀释产物2'C水浴7min -2^°(:保存备用3'、-RACE扩增反应体系在一灭菌的PCR管中加入以下试剂，最先加入PCR-Grade Water,最后加入 50xBD Advantage 2 Polymerase Mix。PCR-Grade Water 34.5ul1 OxBD Advantage 2 PCR Buffer 5 .OuldNTPMix (lOmM) l.Oul50xBD Advantage 2 Polymerase Mix 1 .Oul3， (5，) -RACE Ready cDNA 2.5ulUPM (10x) 5.0ulGSP l.OulTotal50.0ul反应条件94 。C30sec1 5cycles72°C3min」94 。C30sec70。C30sec卜5cycles72 °C3min一94 。C30sec68 。C30sec—25cycles72 。C3min一取5ulPCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，若没有条带将剩下的PCR产物放回PCR仪中，按照如下条件进行反应94°C 30sec ，68。C 30sec ^ 5cycles72 。C 3min -电泳检测(条件同前)，若仍无目的条带，则进行巢式PCR。将第一轮PCR产物取5ul，用245ul Tricine-EDTA Buffer稀释作为巢式PCR的模板。 体系如下PCR-Grade Water 36ul10xBD Advantage 2 PCR Buffer 5.0uldNTPMix(10mM) l.Oul5 0 x BD Advantage 2 Polymerase Mix 1. Oul模板 5.OulNUP l.OulNGSP l.OulTotal50.0ul条件:94°C 30sec 68 °C 30sec 72 。C 3min20cycles取5ul电泳检测。6中间EST部分PCR扩增PCR体系10xBuffer 2.5ul， dNTP 2.0ul， Mg2+2.0ul， ESTF、 ESTR各0.5ul， Taq酶0.125ul， cDNA2.0ul，加灭菌三蒸水至25ul。 PCR条件95。C预变性5min, 35个循环(94。C变性30sec， 55。C退火40sec， 72。C延伸lmin)， 72。C延伸10min。平行做两个管，分别用734号和741号 猪的cDNA作为模版扩增，其它条件相同。取5ulPCR产物用1.5%的琼脂糖电泳检测。7胶回收纯化(1) 电泳用大孔梳子做胶。EB染色，lOxLoading Buffer+PCR产物，尽可能点满孔；100V 电压电泳30min;(2) 切胶紫外灯下割下含DNA的琼脂糖块，使其尽可能小，且动作要迅速，放入事先称重 的L5ml离心管中，称重，计算出琼脂糖的重量；(3) 溶解按照每100g琼脂糖加入300uiSl液的比例加入S1液，置5(TC水浴锅中10min，每 2分钟颠倒混匀一次，使琼脂糖块完全溶化；(4) 目的片断〈500bp时；加入1/3S1液体积的异丙醇，混匀，5(TC温浴lmiri后，混匀；目的 片断〉500bp时，可省略此步；
(5) 将溶化后的Agarose液移入吸附柱，离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同 一个收集管中；(6) 在吸附柱中加入500ulWl液，离心15sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收 集管中；(7) 在吸附柱中加入500ulWl液，静置lmin，离心15sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放 入同一个收集管中；(8) 离心lmin;(9) 将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，静置lmin后， 离心lmin，将回收产物贮存于-2(TC。8感受态细胞的制备(1) 从-8(TC取出一管DH5a大肠杆菌原种，冰上溶解后，在LB琼脂板上划线，37""C恒温培养 箱中过夜培养(12-16h);(2) 挑取单菌落，接种到100mlLB液体培养基中，37。C摇菌12h左右，至006()()达到0.4-0.5;(3) 将菌液转移至两个预冷的50ml离心管中，冰浴10-15min， 4000rpm 4'C离心10min，回收 细菌沉淀；(4) 每管加10ml预冷的0.1M的CaCl2，重悬细菌沉淀；冰浴10-15mim(5) 4°C 4000rpm离心10min，回收细菌沉淀；(6) 重复(4)、 (5)步；(7) 每管加2mlCaCl2重悬细菌沉淀，这时的细胞可直接用于转化实验。加入甘油至浓度20%, 分装成200ul/份，-80"保存。9连接反应计算外源片断与载体的摩尔比(一般插入片断摩尔数载体分子摩尔数=3~8: 1)。连接 反应体系(10ui): PMD18-T Vector 0.5ul， Solution I 5.0ul，外源DNA适量，加灭菌水至 10ul。反应条件16。C温育12h， PCR仪中进行。取5ul连接液转化，其余2(TC保存。10转化(1) 取一支感受态细胞，冰上溶解，加入5ul连接产物，冰浴30min;(2) 40 'C热激90sec ，立即冰浴2min;(3) 加入500ulLB液体培养基，—37'C复活50min，铺制X-Gal、 Amp、 IPTG平板； (4) 37。C恒温培养箱培养12-19h;(5) 将平板置于4'C放置数小时，使蓝斑更明显；(6) 挑取白斑，接种于装有3mlLB液体培养基的试管中，37'C摇菌12h。11阳性克隆的鉴定及测序挑取白色菌落在装有3mlLB液体培养基中培养12h挑取少量菌液，涂于含有一定体积灭菌水的离心管中按照PCR体系加入其它成分PCR后电泳检测阳性克隆测序例2猪发育性状的分子检测(1) 猪血液总RNA的提取；采集待检测猪个体的颈静脉血5毫升，肝素抗凝。分离白细胞后，利用大连宝生物工 程有限公司的总RNA提取试剂(D312),依照说明总RNA。(2) RT-PCR扩增；用SMARTTM RACE cDNAAmplification试剂盒，反转录反应总RNA l-3ul、3， -CDS primer 1 ul、加去离子水至5 ul， 70°C2 min，置冰上2 min，加入5 X First-Strand Buffer 2ul、 DTT (20mM) 1 ul、 dNTP (10 mM)l ul、 BD PowerScript Reverse Transcriptase 1 ul ， 42 °C 卯min，加入lOOul Tricine-EDTA Buffer稀释，72。C水浴7min，得到3 ， -RACE-Ready cDNA。 利用UPM (试剂盒提供)和GSP2 (5' -GAC TTG CCG CTC ATT GAC AAC GAC-3') 进行第一轮PCR。 PCR体系和反应条件见试剂盒说明书。将第一轮PCR产物取5ul，用 245ul Tricine-EDTA Buffer稀释，利用NGSP2 (5' -CGC CGT GGC TTG TAA CAT TCT CTG C-3')和NUP (5' -AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT陽3')进行第二轮PCR。 PCR 体系和反应条件见例l。(3) 电泳检测判定片段大小和猪生长发育类型的确定将PCR产物在1%琼脂糖凝胶进行电泳。根据检测PCR产物的大小来判定猪生长发 育的类型。正常猪的产物为1197bp，多趾猪的产物为636bp。SEQUENCE LISTING<110>重庆市畜牧科学院<120> —种与猪多趾相关的DNA片段<160> 4<170> Patentln version 3.3<210> 1 <211> 1797 <212>腿<213> CRP配套系B系猪 <400> 1acgcggggat ccatggtttg tggaaccttg cctctctctt ttccaatctt tgtttatttg 60 tattgatgcc ctttgccttt ttctttctgg aatcagaagg UUgccggc ctgaaaaagg 120 gaatccgagc ccgaatttta gaaaccctgg tcatgcttgt tctcctggcc ttgctcattc 180 tcgggatggt gtgggtggcc tcggcgctca ttgacaacga cgcggcgagc atggaatctc 240 tatatgatct ctgggaattc tacctaccgt atttatactc ctgtatatca ttgatgggat 300gtttgttact tctcttgtgc accccggtcg gcctctcccg catgtttacg gtcatggggc 360agctgttggt gaagccagcg atcctggaag acctggatga acagatttac attatcaccc 420tagaggaaga agctctccag agacgactaa atggactgtc ttcatcagtg gaatccaatg 480taatggagtt ggaaca柳a cttgaaaatg taaagactct ta柳caaaa Uagagaggc 540gcaaaaaggc ttcagcatgg gaaagaaatt tggtgtatcc tgctgttatg gttctccttc 600ttattgaaac atccatUcc gtcctcttgg tggcUgtaa cattctctgc ctgttggtgg 660atgaaacagc gatgccaaag ggaacaaggg gacctggaat aggaagtgct tctctUctg 720ctUtggttt tgtgggagct gcacUgaaa tcattttgat tttctatcU atggtgtcct 780ctgttgtcgg tUctatagc ctccgatttt ttggagactt tattcccaag aaggatgaca 840caactatgac aaagatcatt ggcaactgtg tatcgatctt ggtcctgagc tctgcgctgc 900 ctgtgatgtc aagaacactg ggaatcacta gatttgatct acttggagac tttggaaggt 960Uaattggct gggaaatttc tatattgtgt tgtcctacaa Utgcttttt gctgttgtga 1020caaccttgtg tctggtcaga aaattcacct ctgcagtgcg agaagaactt ttcaaggccc 1080tagggcttca taaactccac Uatcaaata cttcgaggga ctc柳aaca gcaaagcctt 1140cggccaacgg gcatcagaaa gcactgactt ggagctgaaa tggttgcagc tgtatttttt 1200cacctcctta aagaggcgaa gggcaccgtt gtgatctgtg ttacaggaag agactgccta 1260gactttgagt ccaggggcgg gtagagaatt ctcctgggcc ccgagccttg gtcacacatg 1320ccccgggaat accgtctgct gcccagtggc gtaagctatg gtgggaagga ctgtgtactc 1380atagUcgct gagagttgct gtgtatctga ttcactgtta cctctcatgg catagttgcc 1440agtgctgaag acacttgtaa cttagattU gccttatagg ctgtatgtac cctcagtttt 1500tttaaacaat ttttttgttt gtttccaaaa atcccttaat acccctgcgc tcctgcgtcc 1560attatggagc tataaatgct ccggtaggga ctccttttgt caccaccctc ttcaggcttc 1620
ggtcacttct gtacatgcca atcgaaaacc tcagacttcg gaaaagtacc atgcagcacc 1680 c柳cccaca gcagcagcat tcatgatgta ggaaccggtc tgcagtgtat catgatctga 1740 cgggcgttca gttattaaat tgtaaataat tcttgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1797<210> 2 <211> 391 <212> PRT<213> CRP配套系B系猪 <400> 2Ala Gly lie His Gly Leu Trp Asn Leu Ala Ser Leu Phe Ser Asn Leu 15 10 15Cys Leu Phe Val Leu Met Pro Phe Ala Phe Phe Phe Leu Glu Ser Glu 20 25 30Gly Phe Ala Gly Leu Lys Lys Gly lie Arg Ala Arg lie Leu Glu Thr 35 40 45Leu Val Met Leu Val Leu Leu Ala Leu Leu lie Leu Gly Met Val Trp 50 55 60Val Ala Ser Ala Leu lie Asp Asn Asp Ala Ala Ser Met Glu Ser Leu 65 70 75 80Tyr Asp Leu Trp Glu Phe Tyr Leu Pro Tyr Leu Tyr Ser Cys lie Ser 85 90 95Leu Met Gly Cys Leu Leu Leu Leu Leu Cys Thr Pro Val Gly Leu Ser 100 105 110Arg Met Phe Thr Val Met Gly Gin Leu Leu Val Lys Pro Ala lie Leu 115 120 125Glu Asp Leu Asp Glu Gin lie Tyr lie lie Thr Leu Glu Glu Glu Ala 130 135 140Leu Gin Arg Arg Leu Asn Gly Leu Ser Ser Ser Val Glu Ser Asn Val 145 150 155 160Met Glu Leu Glu Gin Glu Leu Glu Asn Val Lys Thr Leu Lys Thr Lys 165 170 175Leu Glu Arg Arg Lys Lys Ala Ser Ala Trp Glu Arg Asn Leu Val Tyr 180 185 190Pro Ala Val Met Val Leu Leu Leu lie Glu Thr Ser lie Ser Val Leu 195 200 205Leu Val Ala Cys Asn lie Leu Cys Leu Leu Val Asp Glu Thr Ala Met 210 215 220Pro Lys Gly Thr Arg Gly Pro Gly lie Gly Ser Ala Ser Leu Ser Ala 225 230 235 240Phe Gly Phe Val Gly Ala Ala Leu Glu lie lie Leu lie Phe Tyr Leu 245 250 255Met Val Ser Ser Val Val Gly Phe Tyr Ser Leu Arg Phe Phe Gly Asp 260 265 270Phe lie Pro Lys Lys Asp Asp Thr Thr Met Thr Lys lie lie Gly Asn 275 280 285Cys Val Ser lie Leu Val Leu Ser Ser Ala Leu Pro Val Met Ser Arg 290 295 300Thr Leu Gly lie Thr Arg Phe Asp Leu Leu Gly Asp Phe Gly Arg Phe305 310 315 320Asn Trp Leu Gly Asn Phe Tyr lie Val Leu Ser Tyr Asn Leu Leu Phe 325 330 335Ala Val Val Thr Thr Leu Cys Leu Val Arg Lys Phe Thr Ser Ala Val 340 345 350Arg Glu Glu Leu Phe Lys Ala Leu Gly Leu His Lys Leu His Leu Ser 355 360 365Asn Thr Ser Arg Asp Ser Glu Thr Ala Lys Pro Ser Ala Asn Gly His 370 375 380Gin Lys Ala Leu Thr Trp Ser 385 390<210> 3 <211> 細 <212>腿<213> CRP配套系B系猪多趾突变株 <400> 3gccttgctca ttctcgggat ggtgtgggtg gcctcggcgc tcattgacaa cgacgcggcg 60 agcatggaat ctctatatga tctctgggaa ttctacctac cgtatttata ctcctgtata 120 tcattgatgg gatgtttgtt acttctcUg tgcaccccgg tcggcctctc ccgcatgttt 180 acggtcatgg ggcagctgtt ggtgaagcca gcgatcctgg aagacctgga tgaacagatt 240 tacattatca ccctagagga agaagctctc cagagacgac taaatggact gtcttcatca 300 gtggaatcca atgtaatgga gttggaacaa gaacttgaaa atgtaa柳c tctta柳ca 360 aaattagaga ggcgcaaaaa ggcttcagca tgggaaagaa aUtggtgta tcctgctgtt 420 atggttctcc Ucttattga aacatccatt tccgtcctct tggtggcttg taacattctc 480 tgcctgttgg tggatgaaac agcgatgcca aagggaacaa ggggacctgg aataggaagt 540gcttctcttt ctgcttttgg ttttgtggga gctgcacUg aaatcatttt gattttctat 600cttatggtgt cctctgttgt cggtttctat agcctccgat UtUggaga ctttattccc 660aagaaggatg acacaactat gacaaagatc attggcaact gtgtatcgat cttggtcctg 720agctctgcgc tgcctgtgat gtcaagaaca ctggctgcag tgctgtgaga ctagaaacta 780cgatttaaaa aaaccctcaa aataccaatg tggacggcag ctaaacaata cgttgctaaa 840caaccagtgg gtctctttga agaaatgaag aaatcaaaga agaaatttta aaatactcta 900gacaaatgaa aatgaaaata cagtgatcca aaatatatgg gattcagcaa aagcaagtat 960aagagggaca tttatagtaa tataagccta tctcaggaaa ca柳aaaat ctcaaatcaa 1020gaatcttacc atatacccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1069<210> 4 <211> 255 <212> PRT<213> 1 GCCTTGCTCA TTCTCGGGAT GGTGTGGGTG GCCTCGGCGC TCATTGACM CGACGCGGCG<400> 4Ala Leu Leu lie Leu Gly Met Val Trp Val Ala Ser Ala Leu lie Asp 15 10 15Asn Asp Ala Ala Ser Met Glu Ser Leu Tyr Asp Leu Trp Glu Phe Tyr 20 25 30Leu Pro Tyr Leu Tyr Ser Cys lie Ser Leu Met Gly Cys Leu Leu Leu 35 40 45Leu Leu Cys Thr Pro Val Gly Leu Ser Arg Met Phe Thr Val Met Gly 50 55 60Gin Leu Leu Val Lys Pro Ala lie Leu Glu Asp Leu Asp Glu Gin lie 65 70 75 80 Tyr lie lie Thr Leu Glu Glu Glu Ala Leu Gin Arg Arg Leu Asn Gly 85 90 95Leu Ser Ser Ser Val Glu Ser Asn Val Met Glu Leu Glu Gin Glu Leu 100 105 110Glu Asn Val Lys Thr Leu Lys Thr Lys Leu Glu Arg Arg Lys Lys Ala 115 120 125Ser Ala Trp Glu Arg Asn Leu Val Tyr Pro Ala Val Met Val Uu Leu 130 135 140Leu lie Glu Thr Ser lie Ser Val Leu Leu Val Ala Cys Asn lie Leu 145 150 155 160Cys Leu Leu Val Asp.Glu Thr Ala Met Pro Lys Gly Thr Arg Gly Pro 165 170 175
Gly lie Gly Ser Ala Ser Leu Ser Ala Phe Gly Phe Val Gly Ala Ala 180 185 190Leu Glu lie lie Leu lie Phe Tyr Leu Met Val Ser Ser Val Val Gly 195 200 205Phe Tyr Ser Leu Arg Phe Phe Gly Asp Phe lie Pro Lys Lys Asp Asp 210 215 220Thr Thr Met Thr Lys lie lie Gly Asn Cys Val Ser lie Leu Val Leu 225 230 235 240Ser Ser Ala Leu Pro Val Met Ser Arg Thr Leu Ala Ala Val Leu 245 250 25权利要求
1、一种与猪多趾相关的DNA片段，该DNA片段是下列多核苷酸之一(1)核苷酸序列为SEQ NO.1和SEQ NO.3的多核苷酸；(2)编码氨基酸序列为SEQ NO.2和SEQ NO.4的多肽的多核苷酸。
2、 权利要求1所述的猪多趾相关的DNA片段，其编码的多肽的氨基酸序列为SEQNO.2 或SEQN0.4。
3、 含有权利要求1所述的DNA片段的表达载体。
4、 含有权利要求3所述的表达载体的细胞系。
5、 一种检测猪发育性状的方法，该方法是(1) 提取代检测样本的总RNA，利用下述引物进行RT-PCR: GSP2: 5'-GAC TTG CCG CTC ATT GAC AAC GAC-3'，NUP: 5'-AAG CAG TGG TAT CM CGC AGA GT-3';(2) 利用下述引物对步骤(1) RT-PCR产物进行PCR。 NGSP2: 5'-CGC CGT GGC TTG TM CAT TCT CTG C-3'，NUP: 5'-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3';(3) 然后在P/。琼脂糖凝胶检测PCR产物。正常猪的产物为1197 bp，多趾猪的产物为 636bp。
全文摘要
本发明提供了一种与猪多趾相关的DNA片段，该DNA片段是下列多核苷酸之一(1)核苷酸序列为SEQ NO.1和SEQ NO.3的多核苷酸；(2)编码氨基酸序列为SEQ NO.2和SEQNO.4的多肽的多核苷酸。本发明所述的DNA片段与猪肢体发育密切相关，其DNA片段的外显子16前4个密码子发生错义突变直接导致猪轴前多趾，因此，本发明还提供了一种检测猪发育性状的方法，该方法是利用下述引物扩增猪总RNA的反转录产物5′-CGC CGT GGC TTGTAA CAT TCT CTG C-3′，5′-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3′，正常猪的产物为1197bp，多趾猪的产物为636bp。
文档编号C12N15/12GK101157923SQ200710121818
公开日2008年4月9日 申请日期2007年9月14日 优先权日2007年9月14日
发明者王金勇, 白小青, 赵献之 申请人:重庆市畜牧科学院