从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法

文档序号:593345阅读:328来源:国知局
专利名称:从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法
技术领域
本发明涉及一种从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法,属于医药保健、化 工领域。总体上涉及物质的提取、分离,更具体地讲,本发明涉及一种从蛹虫草中提取 精制虫草素和虫草多糖的方法。二背景技术
蛹虫草是一种名贵的中药材,性平味甘,具有滋肺补肾、止血化痰的功效。近年来 的研究结果表明,蛹虫草是冬虫夏草的重要人工替代品之一,其在降血脂,防治动脉硬 化,保护心、脑组织,镇静催眠,增强巨噬细胞活性,抗癌、抗炎、抗菌、抗缺氧等方 面具有良好功效。蛹虫草的功能性成分、药理药效作用与天然冬虫夏草基本一致,其子 实体富含虫草素和虫草多糖等重要的生理活性成分。据现代科学论证虫草素是一种具 有抗菌活性的核苷类物质,对多聚腺苷酸聚合酶有很强的抑制作用,能抑制癌细胞的生长,并有降血糖的作用;虫草多糖是一种高度分枝的半乳甘露聚糖,它能促进淋巴细胞转化,提高血清IgG的抗体含量和机体的免疫功能,增强机体自身抗癌抑癌的能力。目前,根据国内外公开专利报道,提取精制虫草素和虫草多糖的方法主要有水煮法、醇提法、超临界C02萃取法等。中国专利CN1339440报道了以食用真菌虫草或北虫草人工 培养后的发酵物为原料,采用超临界技术萃取有效成分,同时结合常规方法除去杂质、 浓縮、结晶获得虫草素。较之于传统的浸提法,超临界C02萃取克服了前者提取时间长、 温度高、系统开放的缺点,可萃取出较多的极性组分,可以更加真实、全面的反映药材 的化学组份,但由于超临界C02萃取技术用于虫草素提取阶段成本过高,难以进行大规模实践。中国专利CN1560085A公开了一种利用虫草人工培养中产生的培养基下脚料提取虫 草多糖的工艺,该法可变废为宝,减少资源的浪费,提高经济效益,但是在多糖制备过 程中使用了氯仿等有机溶剂,不利于食品安全。目前有关蛹虫草活性成分综合提取精制 方面的专利还未见报道,现有提取技术多是单一的或间歇的,往往通过一套系统单纯提 取虫草素或虫草多糖,这样非连续性的提取技术不便于工业化生产;另外,由于提取分 离步骤太多,使得现有技术提取的有效成分总含量不高,造成资源极大的浪费。三
发明内容
牛支术问题本发明主要克服现有技术的不足,提供一种低成本,并且对环境污染小 的虫草素和虫草多糖的精制方法,目的是使虫草素和虫草多糖能同时被提取、避免单一 提取给蛹虫草活性成分带来的损失,以提高蛹虫草综合利用度,降低投资和运行成本, 最大价值的发挥蛹虫草的综合经济效益。
技术方案一种从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法,包括如下步骤(1) 将蛹虫草子实体粉碎过40 60目筛;(2) 向粉碎的原料中加入95%乙醇或无水乙醇以冷渗法进行提取,蛹虫草粉和95%乙醇或 无水乙醇的混合比例按重量计为1:5-20,将醇溶性色素之类的杂质以滤液的形式初步分 离出来;(3) 弃滤液,将滤渣回收于55'C真空烘干;(4) 将烘干后的滤渣与乙醇混合,蛹虫草粉和10-30%乙醇的混合比例按重量计为1:15-40, 进行超声波辅助提取,超声波频率为20-40KHz,超声处理时间为30-90分钟,重复处理 1-3次,其中乙醇浓度为10-30%;提取结束后,过滤,合并多次滤液,在35-45°C, 300-700mmHg下减压浓縮,添加95%乙醇或无水乙醇,使溶液中乙醇重量含量为55-卯%, 静置8-24小时,使水溶性蛹虫草粗多糖析出;(5) 取醇析后的上清液,在35-45。C, 300-700mmHg下减压浓縮至干,向其中加蒸馏水溶 解,调pH值至3.0-4.0,上离子交换柱用0.1-0.3mol/L氨水洗脱除掉杂质,收集洗脱液进 行再浓縮,冷藏析出晶体,用正丁醇重结晶,得到精制虫草素;(6) 收集第(4)步沉淀出的水溶性蛹虫草粗多糖,在50-6(TC下将之烘干;(7) 向烘干的蛹虫草粗多糖中加入20-25倍体积蒸馏水溶解,加入木瓜蛋白酶进行脱蛋白 处理,木瓜蛋白酶在提取溶液中重量含量为1.5-3.0%。,在50-60。C, pH5.5-6.5条件下水 解4-6小时,离心去除沉淀得二次上清液,将二次上清液浓縮,上大孔树脂柱床,用蒸 馏水洗脱至流出液呈无色透明,合并流出液,浓縮,加入95%乙醇或无水乙醇,使得溶 液中乙醇重量含量达到55-90%,沉淀出多糖,经冷冻干燥后得到精制蛹虫草多糖。上述从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法中,所述的冷渗法是在0-8'C环境 中,进行静态提取l-3次,每次2-4小时。离子交换树脂为732、 724型阳离子交换树脂 或D113型大孔阳离子交换树脂。大孔树脂为普通大孔树脂,其型号为AB-8型或D101 型。有益效果本发明克服了现有技术的不足,提供了一种低成本,并且对环境污染小的虫草素和 虫草多糖的精制方法,制备过程中只以水和乙醇为溶剂,减少污染,所用的树脂再生后 可数次重复使用,成本低,制得的虫草素纯度在90%以上,多糖纯度在85%以上。本发明方法以综合利用蛹虫草资源为前提,充分挖掘蛹虫草功能性成分,实现虫草素 和虫草多糖的共同提取,保证了虫草素和虫草多糖的生物活性。最大限度地增加了原料 的利用率,降低了生产成本。本发明方法适合大规模工业化生产。具体实施例方式下面的实施例是对本发明的进一步详细描述,但并不意味着对本发明的任何限制。
实施例l
将lkg蛹虫草子实体粉碎过60目筛,向粉碎的原料中加入5000毫升95 %乙醇以冷渗法 提取3次,每次3小时,将醇溶性色素之类的杂质以滤液的形式初步分离出来,弃滤液, 滤液可留作其他用途。将滤渣回收于55'C真空烘干,将烘干后的滤渣与20%的乙醇按重 量比1:10混合,进行超声波辅助提取3次,每次提取40分钟。提取结束后,过滤,合并多 次滤液,减压浓縮,添加95%乙醇,使溶液中乙醇含量为80°/。(重量),静置8小时。取上清液,减压浓縮至干,向其中加水溶解,调pH值至3.5,上732型阳离子交换 柱用0.15mol/L的氨水进行洗脱除掉杂质,收集洗脱液进行再浓縮,冷藏析出晶体,用8 毫升正丁醇重结晶,得到精制虫草素0.489g,含量为97.1%。
收集沉淀出的水溶性蛹虫草粗多糖,在55'C下将之烘干,收取蛹虫草粗多糖,向烘 干的蛹虫草粗多糖中加入15倍体积蒸馏水溶解,加入木瓜蛋白酶在55'C, pH6.0条件下 水解5小时,木瓜蛋白酶的加入量为加入木瓜蛋白酶后提取溶液重量的296。,离心去除沉 淀得二次上清液,将二次上清液浓縮,上D101型大孔树脂柱床,用蒸馏水洗脱至流出液 呈无色透明,合并流出液,浓缩,加入95%乙醇,使得溶液中乙醇含量达到80%(重量 比),沉淀出多糖,经冷冻干燥后得到精制蛹虫草多糖33.21g,含量为92.8%。
实施例2将0.5kg蛹虫草子实体粉碎过40目筛,向粉碎的原料中加入3000毫升无水乙醇以冷渗 法提取2次,每次4小时,将醇溶性色素之类的杂质以滤液的形式初步分离出来,弃滤液, 滤液可留作其他用途。将滤渣回收于55"C真空烘干,将烘干后的滤渣与30%的乙醇按重 量比1:20混合,进行超声波辅助提取2次,每次提取60分钟。提取结束后,进行过滤,合 并多次滤液,减压浓縮,添加无水乙醇,使溶液中乙醇含量为80%(重量),静置12小时。
取上清液,减压浓縮至干,向其中加水溶解,调pH值至3.0,上724型阳离子交换 柱用0.211101凡氨水进行洗脱除掉杂质,收集洗脱液进行再浓縮,冷藏析出晶体,用4毫 升正丁醇重结晶,得到精制虫草素0.185g,含量为94.8%。收集沉淀出的水溶性蛹虫草粗多糖,在55"C下将之烘干,收取蛹虫草粗多糖,向烘 干的蛹虫草粗多糖中加入20倍体积蒸熘水溶解,加入木瓜蛋白酶在55'C, pH6.0条件下 水解4小时,木瓜蛋白酶的加入量为加入木瓜蛋白酶后提取溶液重量的1.5%。,离心去除 沉淀得二次上清液,将二次上清液浓縮,上DIOI型大孔树脂柱床,用蒸馏水洗脱至流出 液呈无色透明,合并流出液,浓缩,加入无水乙醇,使得溶液中乙醇含量达到80%(重量), 沉淀出多糖,经冷冻干燥后得到精制蛹虫草多糖15.52g,含量为93.1%。
实施例3将0.8kg蛹虫草子实体粉碎过40目筛,向粉碎的原料中加入4500毫升无水乙醇以冷渗 法提取2次,每次5小时,将醇溶性色素之类的杂质以滤液的形式初步分离出来,弃滤液, 滤液可留作其他用途。将滤渣回收于55t:真空烘干,将烘干后的滤渣与20%的乙醇按重 量比1:25混合,进行超声波 并多次滤液,减压浓縮,添加无水乙醇,使溶液中乙醇含量为70%(重量),静置16小时。 取上清液,减压浓縮至干,向其中加水溶解,调pH值至3.0,上D113型大孔阳离 子交换柱用0.15mol/L氨水:乙醇(80:20,体积比)的碱性洗脱液除掉杂质,收集洗脱液 进行再浓缩,冷藏析出晶体,用7毫升正丁醇重结晶,得到精制虫草素0.336g,含量为 94.8%。收集沉淀出的水溶性蛹虫草粗多糖,在55'C下将之烘干,向烘干的蛹虫草粗多糖中 加入20倍体积蒸馏水溶解,加入木瓜蛋白酶在55'C, pH6.5条件下水解6小时,木瓜蛋 白酶的加入量为加入木瓜蛋白酶后提取溶液重量的2%。,离心去除沉淀得二次上清液,将 二次上清液浓縮,上AB-8型大孔树脂柱床,用蒸馏水洗脱至流出液呈无色透明,合并流 出液,浓縮,加入无水乙醇,使得溶液中乙醇含量达到70%(重量),沉淀出多糖,经冷 冻干燥后得到精制蛹虫草多糖26.63g,含量为90.8%。实施例4将0.75kg蛹虫草子实体粉碎过60目筛,向粉碎的原料中加入4800毫升95%乙醇以冷渗 法提取3次,每次4小时,将醇溶性色素之类的杂质以滤液的形式初步分离出来,弃滤液, 滤液可留作其他用途。将滤渣回收于55t:真空烘干,将烘干后的滤渣与10%的乙醇按重 量比1:25混合,进行超声波辅助提取2次,每次60分钟。提取结束后,过滤,合并多次滤 液,减压浓縮,添加无水乙醇,使溶液中乙醇含量为90%(重量比),静置24小时。取上清液,减压浓縮至干,向其中加水溶解,调pH值至3.0,上732型阳离子交换 柱用0.2mol/L氨水进行洗脱除掉杂质,收集洗脱液进行再浓縮,冷藏析出晶体,用6毫 升正丁醇重结晶,得到精制虫草素0.321g,含量为96.8%。收集沉淀出的水溶性蛹虫草粗多糖,在55'C下将之烘干,收取蛹虫草粗多糖,向烘 干的蛹虫草粗多糖中加入25倍体积蒸馏水溶解,加入木瓜蛋白酶在5(TC, pH5.5条件下 水解6小时,木瓜蛋白酶的加入量为加入木瓜蛋白酶后提取溶液重量的3.0%。,离心去除 沉淀得二次上清液,将二次上清液浓縮,上AB-8型大孔树脂柱床,用蒸馏水洗脱至流出 液呈无色透明,合并流出液,浓縮,加入无水乙醇,使得溶液中乙醇含量达到90%(重量), 沉淀出多糖,经冷冻干燥后得到精制蛹虫草多糖22.17g,含量为89.7%。实施例5(一)虫草素含量测定(高效液相色谱法)标准曲线的绘制 分别准确称取虫草素标准品(购于Sigma公司,纯度>98%) 10.0 mg,用甲醇定容至50ml,摇匀。分别准确吸取标准品母液lml、 2ml、 4ml、 8ml和 10ml,用甲醇稀释至10ml,摇匀,得系列标准溶液。色谱条件色谱柱为Eclipse XDB C18 色谱柱(150mmx4.6mmi.d., 5pm);流动相为水:甲醇:甲酸二95:4:l(v/v/v);流速0.8ml/min; 柱温25'C;检测波长260nm。分别取上述制备的系列标准溶液2(Hil,按色谱条件分别 进样,测定峰面积,以峰面积Y为横坐标,对照品浓度X为纵坐标,绘制标准曲线。
样品含量测定取精制的虫草素0.0050g,加入甲醇稀释至lOOml,过0.22pm微孔 滤膜,20pl进样,通过标准回归方程计算虫草素含量。(二)虫草多糖含量的测定(蒽酮-硫酸法)葡萄糖标准曲线的绘制精密称取105'C下干燥至恒重的无水葡萄糖约10.0mg,置 100ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,配得葡萄糖标准溶液。准确称取0.2g蒽 酮和lg硫脲置于烧杯中,缓慢加入100ml浓硫酸,边加边搅拌,直至溶解后呈黄色透明 溶液,将其置于棕色瓶中于冷暗处保存。从葡萄糖对照品溶液中分别精密吸取0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2ml,置于25ml干燥洁净的具塞试管中,补水至2.0ml,混匀。在冰浴 中沿管壁缓慢加入蒽酮试剂4.0ml,混匀,将反应液一并在沸水浴中加热8min,取出在 流水中冷却至室温,同时以2.0ml蒸馏水加蒽酮试剂4.0ml作空白,在624nm波长处测 定吸光值。以吸光值A为纵坐标,以标准品浓度C为横坐标绘制标准曲线。样品含量测定准确称取O.OOlOg待测样品,加蒸馏水溶解稀释至10ng/ml,取0.5ml 置于25ml干燥洁净的具塞试管中,补水至2.0ml,混匀。在冰浴中沿管壁缓慢加入蒽酮 试剂4.0ml,混匀,将反应液一并在沸水浴中加热8min,取出在流水中冷却至室温,同 时以2.0ml蒸馏水加蒽酮试剂4.0ml作空白,在624nm波长处测定吸光值。根据标准回 归方程计算蛹虫草多糖含量。
权利要求
1.一种从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法,包括如下步骤(1)将蛹虫草子实体粉碎过40~60目筛;(2)向粉碎的原料中加入95%乙醇或无水乙醇以冷渗法进行提取,蛹虫草粉和95%乙醇或无水乙醇的混合比例按重量计为1∶5-20,将醇溶性色素之类的杂质以滤液的形式初步分离出来;(3)弃滤液,将滤渣回收于55℃真空烘干;(4)将烘干后的滤渣与乙醇混合,蛹虫草粉和10-30%乙醇的混合比例按重量计为1∶15-40,进行超声波辅助提取,超声波频率为20-40KHz,超声处理时间为30-90分钟,重复处理1-3次,其中乙醇浓度为10-30%;提取结束后,过滤,合并多次滤液,在35-45℃,300-700mmHg下减压浓缩,添加95%乙醇或无水乙醇,使溶液中乙醇重量含量为55-90%,静置8-24小时,使水溶性蛹虫草粗多糖析出;(5)取醇析后的上清液,在35-45℃,300-700mmHg下减压浓缩至干,向其中加蒸馏水溶解,调pH值至3.0-4.0,上离子交换柱用0.1-0.3mol/L氨水洗脱除掉杂质,收集洗脱液进行再浓缩,冷藏析出晶体,用正丁醇重结晶,得到精制虫草素;(6)收集第(4)步沉淀出的水溶性蛹虫草粗多糖,在50-60℃下将之烘干;(7)向烘干的蛹虫草粗多糖中加入20-25倍体积蒸馏水溶解,加入木瓜蛋白酶进行脱蛋白处理,木瓜蛋白酶在提取溶液中重量含量为1.5-3.0‰,在50-60℃,pH5.5-6.5条件下水解4-6小时,离心去除沉淀得二次上清液,将二次上清液浓缩,上大孔树脂柱床,用蒸馏水洗脱至流出液呈无色透明,合并流出液,浓缩,加入95%乙醇或无水乙醇,使得溶液中乙醇重量含量达到55-90%,沉淀出多糖,经冷冻干燥后得到精制蛹虫草多糖。
2. 根据权利要求1所述从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法,其特征在于, 所述的冷渗法是在0-8"C环境中,进行静态提取l-3次,每次2-4小时。
3. 根据权利要求1或2所述从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法,其特征 在于,所述的离子交换树脂为732、 724型阳离子交换树脂或D113型大孔阳离子交换树 脂。
4. 根据权利要求1或2所述从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法,其特征 在于,所述大孔树脂为普通大孔树脂,其型号为AB-8型或D101型。
5. 根据权利要求3所述从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法,其特征在于, 所述大孔树脂为普通大孔树脂,其型号为AB-8型或D101型。
全文摘要
本发明涉及一种从蛹虫草中提取精制虫草素和虫草多糖的方法,属于医药保健、化工领域。将蛹虫草粉末以冷渗法提取过滤,滤渣与乙醇混合,超声波辅助提取、离心,上清液浓缩、醇析。醇析上清液减压浓缩、洗脱,洗脱液浓缩结晶,用正丁醇重结晶,得到精制虫草素;醇析沉淀进行酶解脱蛋白处理、离心,上清液浓缩、洗脱,流出液浓缩、醇析,冷冻干燥后得到精制多糖。本发明的制备过程中只以水和乙醇为溶剂,减少污染,所用树脂可数次重复使用,成本低。本发明方法充分开发利用蛹虫草生物活性成分,实现虫草素和虫草多糖的共同提取,保证了虫草素和虫草多糖的生物活性。最大限度地增加了原料的利用率,降低了生产成本,适合大规模工业化生产。
文档编号A23L1/09GK101124988SQ200710122409
公开日2008年2月20日 申请日期2007年9月25日 优先权日2007年9月25日
发明者刘春泉, 宋江峰, 李大婧 申请人:江苏瑞迪生科技有限公司 被以下专利引用 (4),
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