专利名称：一种利用细菌发酵生产番茄红素的方法
技术领域：
本发明涉及番茄红素的工业发酵领域，具体地涉及一种利用龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus sub.rimosus)生产番茄红素的方法。
背景技术：
番茄红素在食品、医药和化妆品领域有着广泛的用途，它不仅可用作食用色素，而且在疾病预防、防癌抗癌、抗衰老等方面也有着很好的效果。因此，工业化大规模制备番茄红素的方法成为了研究热点。
目前，国内外生产番茄红素的方法主要有三种，即植物提取法、化学合成法和微生物发酵法，下面分别描述这三种方法的研究现状(1)植物提取法番茄红素主要存在于番茄、西瓜、葡萄、红色葡萄柚和芒果等水果中，研究较多的是从番茄中提取番茄红素的方法。国际专利(WO97/48287)描述了一种制备富含番茄红素的油树脂的方法；欧洲专利(EP608027)描述了通过分离番茄红素以结晶形式存在的番茄成色素细胞，来获得浓缩的番茄红素提取物。有关从植物中提取番茄红素的报道较多，但是由于植物中番茄红素的含量很低，使得该方法成本较高，不适于工业化规模生产。
(2)化学合成法采用化学合成法生产番茄红素主要是德国的罗氏公司和巴斯夫公司。1997年10月，罗氏公司完成了工艺开发并在欧洲提出专利申请。该工艺是由三苯基氯化磷和辛三烯二醛用甲醇在2-丙醇中进行烯化反应制得，番茄红素的收率达65％。化学合成法的产量和纯度都较植物提取法高，但它的主要缺陷在于其合成产物与天然产物并不完全相同[Meyer(2002)，Chemie in unserer Zeit36(3)178-192]。此外，化学合成法中使用了大量不稳定且有毒害的化学试剂，该方法在环保意识逐渐增强的当今社会被逐步淘汰。
(3)微生物发酵法研究较多的是真菌发酵法，番茄红素可以通过某些真菌，如须霉菌(Phycomyces)、布拉霉菌(Blaleslea)或瓜笄霉(Choanephora)等的发酵来生产，其中研究较多的是三孢布拉霉菌。自20世纪50年代后期，三孢布拉氏霉菌已被用于生产β-胡萝卜素。番茄红素是β-胡萝卜素合成途径中的一个中间产物，番茄红素由经番茄红素环化酶作用转化形成β-胡萝卜素。如果在发酵过程中添加合适的番茄红素环化酶阻断剂，使得环化酶失去活性，则可以积累大量的番茄红素。美国专利(US3097146)首次将三孢布拉霉菌用于发酵生产番茄红素，其中描述在特定有利发酵条件下，三孢布拉霉菌主要产生番茄红素，几乎无其它类胡萝卜素存在。随后的方法中使用了各种番茄红素环化酶抑制剂，如叔胺、氨甲基吡啶和烟草残渣、咪唑、吡啶、吗啉、喹啉等来阻断β-胡萝卜素的形成，从而促进番茄红素的积累(US3369974，JP48016189，JP48916190，JP 73016189，JP 73016190，RU2102416，US3369974)。但是，当β-胡萝卜素的合成被阻断时，包括番茄红素在内的类胡萝卜素的合成就会出现问题。β-胡萝卜素的合成作用受(+)和(-)菌株共培养时产生的性激素三孢酸的刺激。同时β-胡萝卜素又是三孢酸合成的前体，因此阻断β-胡萝卜素的产生将降低所有类胡萝卜素的产生。国际专利(WO00/77234)和中国专利(CN1353765A)描述了一种通过外源添加三孢酸来解决上述问题的方法。中国专利(CN1582328A)最近公开了通过菌株诱变得到的突变体菌株，可在无外源胡萝卜素合成抑制剂的条件下生产番茄红素的方法。
三孢布拉霉菌发酵法的主要缺点是(1)发酵周期较长；(2)发酵系统比较复杂①需不同接合型(+)和(-)菌株共培养；②需加入番茄红素环化酶阻断剂；③多需添加外源性激素三孢酸。
细菌发酵生产番茄红素方面的专利文献极少，只有一篇美国专利(US3467579)曾于1969年9月16日公开了一种细菌生产番茄红素的过程，其中主要描述了细菌菌株的形态特征、培养特征、生化特征及菌株的鉴定过程，并且公开了特定的发酵条件。该方法与三孢布拉霉菌发酵法相比较，其优点是发酵系统比较简单，但仍然存在发酵周期较长的缺点。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的是提供一种利用细菌发酵生产番茄红素的方法。
(二)技术方案本发明提供了一种利用细菌发酵生产番茄红素的方法，它包括如下步骤(1)菌种选择选用龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus sub.rimosus)；(2)斜面培养将上述菌株接种于含有1.5～2.0％琼脂的YM固体斜面基本培养基上，25～30℃培养2-3天；(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50～150mL的液体发酵培养基中，25～30℃条件下，在摇床上振荡培养24-48小时，制得一级种子；(4)扩大培养以5％(体积比)接种量，接一级种子于300～1000mL的液体发酵培养基中，25～30℃条件下，在摇床上振荡培养24～48小时，制得二级种子；(5)发酵罐培养以8％(体积比)接种量，接二级种子于3-5L液体发酵培养基中，在25～30℃条件下，培养24～96小时，并进行分批补料，期间定时测定番茄红素含量，至单位体积番茄红素产量达到最高时，终止发酵培养；(6)收集菌体取步骤(5)的发酵液，在10,000转/分条件下离心15～20分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤2～3次，湿菌体在4℃储存，备用；(7)番茄红素的提取选用氯仿萃取法、丙酮浸提法及酸水解法中的任意一种方法进行菌体内番茄红素的提取；(8)样品检测采用分光光度计法或高效液相色谱(HPLC)法对步骤(7)中所得的样品进行番茄红素含量测定，计算出产量。
其中，步骤(2)中涉及的YM固体基本培养基配方如下(重量/体积)酵母粉3.0g/L，麦芽糖3.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，琼脂15g/L。调节pH 7.0，115℃条件下灭菌20分钟。
步骤(3)、(4)、(5)中涉及的发酵培养基可选自YM培养基、YM+金属离子培养基及淀粉培养基中的任一种。上述三种培养基的配方如下(重量/体积)
YM培养基酵母粉3.0g/L，麦芽糖3.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，调节pH 7.0，115℃条件下灭菌20分钟；YM+金属离子培养基酵母粉3.0g/L，麦芽糖3.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，1g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4.7H2O，0.1g/L CaCl2.2H2O，调节pH 7.0，115℃条件下灭菌20分钟；淀粉培养基玉米淀粉5.0g/L，黄豆饼粉50.0g/L，蛋白胨40.0g/L，硫酸铵3.0g/L，12.5g/L KH2PO4，1.0g/L MgSO4.7H2O，3.0g/L CaCO3.2H2O，2.5g/L NaCl，调节pH 7.0，121℃条件下灭菌20分钟。
优选地，步骤(1)中所述的菌种选用龟裂链霉菌(Streptomyces rimosussub.rimosus)ATCC 33024。
优选地，(5)中所述的培养温度是28℃，培养时间是72小时。
步骤(7)中所述的提取方法的具体步骤分别为氯仿萃取法将菌体用蒸馏水重悬，浓度达到50～200克湿细胞/升，超声波破碎后，离心得粗番茄红素溶液，之后按1∶1比例加入三氯甲烷，45℃振荡萃取4小时，静置分层，取下层即为番茄红素溶液。
丙酮浸提法可将菌体重悬于丙酮溶液中，超声波破碎，45℃振荡抽提3次，至菌体发白。离心取上清即为番茄红素粗提液。
酸水解法可将菌体水洗2次，按1g菌体加入5ml 4mol/L HCl处理，25℃振荡1小时，然后沸水煮4分钟，迅速放入冰浴冷却，离心，弃上清，水洗2次，按1g菌体加入1∶1的石油醚丙酮溶液10ml处理，35℃振荡抽提1小时，8,000rpm离心10分钟，上清液即为番茄红素粗提液。
优选地，在步骤(7)之后可进行番茄红素的精制，具体操作为将步骤(7)得到的番茄红素粗提液使用真空旋转蒸发仪进行浓缩结晶，真空蒸发条件是水浴温度35℃。所得的晶体用无水乙醇洗涤，真空干燥。
步骤(8)采用HPLC检测时，检测条件是采用Agilent 1100，反向C18柱(4.6×150mm)，甲醇∶二氯甲烷(75∶25)为流动相，流速为0.6ml/min，检测波长为472nm，检测样品用0.45μm的有机滤膜过滤，进样量20μl。
步骤(8)采用分光光度计法检测时，检测波长是472nm。
本发明是利用链霉菌生长过程中产生次级代谢产物来生产番茄红素，摇瓶培养时番茄红素产量为230mg/L，发酵罐培养时番茄红素产量可达500mg/L。
(三)有益效果与目前的常用方法相比，本发明所述的方法具有以下优点(1)发酵周期与真菌发酵相比大为缩短；(2)发酵系统简单，仅使用单一细菌菌株；(3)所使用培养基价格低，大幅降低了发酵成本；(4)得到的番茄红素样品较纯，液相没有检测到其它类胡萝卜素存在；(5)相比真菌发酵而言，生长过程中无须添加外源性激素三孢酸，简化工艺的同时降低了工业成本。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1YM培养基摇瓶发酵生产番茄红素(1)菌种选择选用龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus sub.rimosus)CICC 11004。
(2)斜面培养将上述菌株接种于含有1.5％琼脂的YM固体斜面基本培养基上，28℃培养3天。
(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL YM液体培养基中，28℃条件下，在摇床上振荡培养30小时，制得种子。
(4)摇瓶发酵培养按5％(体积比)接种量，接种子于150mL YM+金属离子液体培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养56小时，停止发酵。
(5)收集菌体取步骤(4)的发酵液，在10,000转/分条件下离心20分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤2次，湿菌体在4℃储存，备用。
(6)番茄红素的提取采用酸水解法进行菌体内番茄红素的提取。将菌体水洗2次，按1g菌体加入5ml 4mol/L HCl处理，25℃振荡1小时，然后沸水煮4分钟，迅速放入冰浴冷却，离心，弃上清，水洗2次，按1g菌体加入1∶1的石油醚丙酮溶液10ml处理，35℃振荡抽提1小时，8,000rpm离心10分钟，上清液即为番茄红素粗提液。
(7)样品检测使用高效液相色谱(HPLC)法进行番茄红素含量测定。HPLC条件是采用Agilent 1100，反向C18柱(4.6×150mm)，甲醇∶二氯甲烷(75∶25)为流动相，流速为0.6ml/min，检测波长为472nm，检测样品用0.45μm的有机滤膜过滤，进样量20μl。计算出番茄红素产量为23.14mg/L。
实施例2淀粉培养基摇瓶发酵生产番茄红素(1)菌种选择选用龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus sub.rimosus)CICC 11005。
(2)斜面培养将上述菌株接种于含有2％琼脂的YM固体斜面基本培养基上，28℃培养3天。
(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接2环于50mL的淀粉液体培养基中，28℃条件下，在摇床上振荡培养24小时，制得种子。
(4)摇瓶发酵培养以5％(体积比)接种量，接种子于100mL淀粉液体培养基中，28℃条件下，在摇床上振荡培养96小时，停止发酵。
(5)收集菌体取步骤(4)的发酵液10,000转/分条件下离心20分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤2次，湿菌体在4℃储存，备用。
(6)番茄红素的提取采用酸水解法进行菌体内番茄红素的提取。将菌体水洗2次，按1g菌体加入5ml 4mol/L HCl处理，25℃振荡1小时，然后沸水煮4分钟，迅速放入冰浴冷却，离心，弃上清，水洗2次，按1g菌体加入1∶1的石油醚丙酮溶液10ml处理，35℃振荡抽提1小时，8,000rpm离心10分钟，上清液即为番茄红素粗提液。
(7)样品检测使用高效液相色谱(HPLC)法进行番茄红素含量测定。HPLC条件是采用Agilent 1100，反向C18柱(4.6×150mm)，甲醇∶二氯甲烷(75∶25)为流动相，流速为0.6ml/min，检测波长为472nm，检测样品用0.45μm的有机滤膜过滤，进样量20μl。计算出番茄红素产量为230mg/L。
实施例3YM培养基7升发酵罐中番茄红素的生产(1)菌种选择选用龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus sub.rimosus)ATCC 33024。
(2)斜面培养将上述菌株接种于含有1.8％琼脂的YM固体斜面基本培养基上，28℃培养2天。
(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1环于100mL的YM液体培养基中，28℃条件下，在摇床上振荡培养36小时，制得一级种子。
(4)扩大培养以5％(体积比)接种量，接一级种子于300mL的YM液体中，28℃条件下，在摇床上振荡培养48小时，制得二级种子。
(5)发酵罐培养以8％(体积比)接种量，接二级种子于4L YM液体培养基中，28℃条件下，培养36小时，并进行分批补料，期间定时测定菌浊度和番茄红素含量，至单位体积番茄红素产量达到最高时，终止发酵培养。
(6)收集菌体取步骤(5)的发酵液10,000转/分条件下离心15分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤2次，湿菌体在4℃储存，备用。
(7)番茄红素的提取使用氯仿萃取法进行菌体内番茄红素的提取。将菌体用蒸馏水重悬，浓度达到50克湿细胞/升，用超声波破碎上述制得的菌体细胞，功率600瓦，作用4秒，停4秒，共破碎10分钟，离心得粗番茄红素溶液，之后按1∶1比例加入三氯甲烷，45℃振荡萃取4小时，静置分层，取下层即为番茄红素溶液。
(8)样品检测使用分光光度计法在472nm进行检测，计算出产量为58mg/L。
实施例4YM+金属离子培养基7升发酵罐中番茄红素的生产(1)菌种选择选用龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus sub.rimosus)CICC 11005。
(2)斜面培养将上述菌株接种于含有1.5％琼脂的YM固体斜面基本培养基上，28℃培养3天。
(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接2环于150mL的YM液体培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养48小时，制得一级种子。
(4)扩大培养以5％(体积比)接种量，接一级种子于500mL的YM+金属离子液体中，30℃条件下，在摇床上振荡培养48小时，制得二级种子。
(5)发酵罐培养以8％(体积比)接种量，接二级种子于5L YM+金属离子液体培养基中，28℃条件下，培养40小时，并进行分批补料，期间定时测定菌浊度和番茄红素含量，至单位体积番茄红素产量达到最高时，终止发酵培养。
(6)收集菌体取步骤(5)的发酵液在10,000转/分条件下离心20分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤3次，湿菌体在4℃储存，备用。
(7)番茄红素的提取使用氯仿萃取法进行菌体内番茄红素的提取。将菌体用蒸馏水重悬，浓度达到50克湿细胞/升，超声波破碎后，离心得粗番茄红素溶液，之后按1∶1比例加入三氯甲烷，45℃振荡萃取4小时，静置分层，取下层即为番茄红素溶液。
(8)样品检测使用高效液相色谱(HPLC)法进行番茄红素含量测定。HPLC条件是采用Agilent 1100，反向C18柱(4.6×150mm)，甲醇∶二氯甲烷(75∶25)为流动相，流速为0.6ml/min，检测波长为472nm，检测样品用0.45μm的有机滤膜过滤，进样量20μl。计算出番茄红素产量为62mg/L。
实施例5淀粉培养基7升发酵罐中番茄红素的生产(1)菌种选择选用龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus sub.rimosus)ATCC 33024。
(2)斜面培养将上述菌株接种于含有1.5％琼脂的YM固体斜面基本培养基上，30℃培养3天。
(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接2环于150mL的YM+金属离子液体培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养48小时，制得一级种子。
(4)扩大培养以5％(体积比)接种量，接一级种子于500mL的YM+金属离子液体中，30℃条件下，在摇床上振荡培养48小时，制得二级种子。
(5)发酵罐培养以8％(体积比)接种量，接二级种子于5L淀粉液体培养基中，28℃条件下，培养72小时，并进行分批补料，期间定时测定番茄红素含量，至单位体积番茄红素产量达到最高时，终止发酵培养。
(6)收集菌体取步骤(5)的发酵液10,000转/分条件下离心20分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤3次，湿菌体在4℃储存，备用。
(7)番茄红素的提取使用丙酮浸提法进行菌体内番茄红素的提取。将菌体重悬于丙酮溶液中，浓度达到50克湿细胞/升，用超声波破碎上述制得的菌体细胞，功率600瓦，作用4秒，停4秒，共破碎10分钟，45℃振荡抽提3次，至菌体无红色。离心取上清即为番茄红素粗提液。
(8)将步骤(7)的番茄红素粗提液使用真空旋转蒸发仪进行浓缩结晶，真空蒸发条件是水浴温度35℃。所得的晶体用无水乙醇洗涤，真空干燥；(9)样品检测使用高效液相色谱(HPLC)法进行番茄红素含量测定。HPLC条件是采用Agilent 1100，反向C18柱(4.6×150mm)，甲醇∶二氯甲烷(75∶25)为流动相，流速为0.6ml/min，检测波长为472nm，检测样品用0.45μm的有机滤膜过滤，进样量20μl。计算出番茄红素产量为500mg/L。
权利要求
1.一种利用细菌发酵生产番茄红素的方法，它包括如下步骤(1)菌种选择选用龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus sub.rimosus)；(2)斜面培养将上述菌株接种于含有1.5～2.0％琼脂的YM固体斜面基本培养基上，25～30℃培养2-3天；(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50～150mL的液体发酵培养基中，25～30℃条件下，在摇床上振荡培养24-48小时，制得一级种子；(4)扩大培养按体积比5％的接种量，接一级种子于300～1000mL的液体发酵培养基中，25～30℃条件下，在摇床上振荡培养24～48小时，制得二级种子；(5)发酵罐培养按体积比8％的接种量，接二级种子于3-5L液体发酵培养基中，在25～30℃条件下，培养24～96小时，并进行分批补料，期间定时测定番茄红素含量，至单位体积番茄红素产量达到最高时，终止发酵培养；(6)收集菌体取步骤(5)的发酵液，在10,000转/分条件下离心15～20分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤2～3次，湿菌体在4℃储存，备用；(7)番茄红素的提取选用氯仿萃取法、丙酮浸提法及酸水解法中的任意一种方法进行菌体内番茄红素的提取；(8)样品检测采用分光光度计法或高效液相色谱(HPLC)法对步骤(7)中所得的样品进行番茄红素含量测定，计算出产量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中涉及的YM固体基本培养基配方是酵母粉3.0g/L，麦芽糖3.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，琼脂15g/L。调节pH7.0，115℃条件下灭菌20分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)、(4)、(5)中涉及的发酵培养基可选自YM培养基、YM+金属离子培养基及淀粉培养基中的任一种，所述三种培养基的配方是YM培养基酵母粉3.0g/L，麦芽糖3.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，调节pH7.0，115℃条件下灭菌20分钟；YM+金属离子培养基酵母粉3.0g/L，麦芽糖3.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，1g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4.7H2O，0.1g/L CaCl2.2H2O，调节pH7.0，115℃条件下灭菌20分钟；淀粉培养基玉米淀粉5.0g/L，黄豆饼粉50.0g/L，蛋白胨40.0g/L，硫酸铵3.0g/L，12.5g/L KH2PO4，1.0g/L MgSO4.7H2O，3.0g/L CaCO3.2H2O，2.5g/L NaCl，调节pH7.0，121℃条件下灭菌20分钟。
4.根据权利要求1-3之任一项权利要求所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的菌种选用龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus sub.rimosus)ATCC33024。
5.根据权利要求1-3之任一项权利要求所述的方法，其特征在于步骤(5)中所述的培养温度是28℃，培养时间是72小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(7)中所述的提取方法的具体步骤分别为氯仿萃取法将菌体用蒸馏水重悬，浓度达到50～200克湿细胞/升，超声波破碎后，离心得粗番茄红素溶液，之后按1∶1比例加入三氯甲烷，45℃振荡萃取4小时，静置分层，取下层即为番茄红素溶液。丙酮浸提法可将菌体重悬于丙酮溶液中，超声波破碎，45℃振荡抽提3次，至菌体发白。离心取上清即为番茄红素粗提液。酸水解法可将菌体水洗2次，按1g菌体加入5ml 4mol/L HCl处理，25℃振荡1小时，然后沸水煮4分钟，迅速放入冰浴冷却，离心，弃上清，水洗2次，按1g菌体加入1∶1的石油醚∶丙酮溶液10ml处理，35℃振荡抽提1小时，8,000rpm离心10分钟，上清液即为番茄红素粗提液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤(7)之后可进行番茄红素的精制，具体操作为将步骤(7)得到的番茄红素粗提液使用真空旋转蒸发仪进行浓缩结晶，真空蒸发条件是水浴温度35℃，所得的晶体用无水乙醇洗涤，真空干燥。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(8)采用HPLC检测时，检测条件是采用Agilent 1100，反向C18柱(4.6×150mm)，甲醇∶二氯甲烷(75∶25)为流动相，流速为0.6ml/min，检测波长为472nm，检测样品用0.45μm的有机滤膜过滤，进样量20μl。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(8)采用分光光度计法检测时，检测波长是472nm。
全文摘要
本发明提供了一种利用细菌发酵生产番茄红素的方法，所用菌种为龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus sub.rimosus)。与目前的常用方法相比，本发明所述的方法具有发酵周期短、系统简单、成本低、产品纯度高、工艺简便等优点，适应工业化大规模生产的需要。
文档编号C12R1/59GK101085989SQ20071012289
公开日2007年12月12日 申请日期2007年7月10日 优先权日2007年7月10日
发明者马荣才, 高俊莲, 王敏, 杨慧, 韩梅琳, 孙晓红 申请人:北京市农林科学院 被以下专利引用 (1),