专利名称：一种人胚胎生殖嵴干细胞的培养方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养方法，特别涉及到一种人胚胎生殖嵴干细胞的培养方法。
背景技术：
人胚胎生殖嵴干细胞(EG embryonic germ)是从胚胎原始生殖嵴分离出的原始生 殖细胞，是早期胚胎多能干细胞中的一种，是具有自我复制和具有多向分化潜能的 原始细胞。它具有稳定的二倍体核型，能以原始胚胎状态无限增殖，并可通过异体 移植或适宜的体外环境自然分化为三种胚胎生殖层。
作为一种胚胎源干细胞，人EG细胞的表面标志及多分化潜能都类似于人胚胎干 细胞(ES)，这意味着EG细胞也可以同ES细胞一样，人EG细胞和人ES细胞一样，都 是具有多分化潜能的胚胎源千细胞，在适当的条件下,可以定向诱导分化为各种组织 细胞,甚至形成复杂的组织和器官。正因为如此,它有望为人类许多难治性疾病提供无 限的细胞来源，用于细胞、组织和器官移植及基因治疗的载体,同时可以作为研究哺 乳动物发育生物学的模型和药物筛选模型。
1998年，人类ES细胞建系成功后不久，ShamblottMJ分离自胚胎生殖嵴或肠系 膜的人胚胎生殖嵴干细胞体外培养成功，以后又有三个研究组分别报道了这项工作。 但到目前为止关于人EG细胞体外培养的文章却很少。所有的报道都暴露出人EG细 胞体外增殖能力差且容易自发分化；是否可在体内形成畸胎瘤是检验细胞有无多潜 能性的标准实验，这个实验巳成功在人类ES细胞上得到验证，但到目前，未有报道 证明人类EG细胞可形成畸胎瘤，不能形成畸胎瘤也反映了人EG细胞增殖能力差。
与人ES细胞近几年快速的研究进展相比，人类EG细胞研究进展却比较缓慢， 其中一个重要的原因是没有很好的技术和培养系统来维持人EG细胞系的增殖和保 持未分化状态。人类ES细胞在体外能长时间培养并能传很高的代数而保持多潜能 性，而长时间体外培养人类EG细胞并维持其不分化状态是十分困难的，但是人类 EG细胞的体外培养是对人胚胎生殖嵴干细胞进行深入研究和应用的重要环节，因 此，建立良好的人EG细胞体外培养条件是一个紧迫的问题。
本发明克服了以往人胚胎生殖嵴干细胞体外培养的缺陷，能够长时间体外培养
人胚胎生殖嵴干细胞并维持其不分化状态，同时培养出的人胚胎生殖嵴干细胞在小 鼠体内可形成畸胎瘤，在世界上首次在体内证明人EG细胞的多潜能性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人胚胎生殖嵴干细胞培养液。 本发明的另一目的在于提供一种人胚胎生殖嵴干细胞的培养方法。 本发明的又一目的在于提供一种根据上述方法制备的人胚胎生殖嵴干细胞系。 本发明提供的一种人胚胎生殖嵴干细胞培养液，其特征在于，培养液中含有血
小板衍化生长因子PDGF。
其中，所述培养液包括Knockout DMEM80ml， Knockout serum replacement (血清替代物)20ml， bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)400ng， LIF(白血病抑制因 子)1000ng， L一谷胺酰胺2mM， Forskolin 10幽，非必需氨基酸0. 1 raM，丙酮酸 钠lmM， 巯基乙醇0. lmM， PDGF (血小板衍化生长因子)30 — 200ng/ml，优选 50ng/ml。
本发明提供的一种人胚胎生殖嵴干细胞的培养方法，包括，
a、 人胚胎生殖嵴干细胞的消化；
b、 将消化后的胚胎生殖嵴干细胞接种于含有上述培养液的培养皿中培养
c、 将接种后的胚胎生殖嵴干细胞培养传代。
其特征在于，所述培养液中添加有PDGF(血小板衍化生长因子)。
其中，所述培养液包括Knockout DMEM80ml， Knockout serum replacement 20ml(血清替代物)，bFGF (碱性成纤维细胞生长因子)400ng， LIF (白血病抑 制因子)1000ng， L—谷胺酰胺2mM， Forskolin 10pM，非必需氨基酸0.1 mM，丙 酮酸钠lmM， P-巯基乙醇O.lmM， PDGF(血小板衍化生长因子)浓度为30 — 200ng/ml，优选50ng/ml。
所述人胚胎生殖嵴干细胞的消化是用0. 25%胰蛋白酶消化15min。
具体的说，本发明是这样实现的
本发明提供的一种人胚胎生殖嵴干细胞的培养方法，包括以下步骤-
a、 人胚胎生殖嵴干细胞的消化
用0. 25%胰蛋白酶消化15min，终止消化；
b、 将消化后的胚胎生殖嵴干细胞接种于含有上述培养液的培养皿中培养 将消化后的胚胎生殖嵴干细胞用吸管移入到铺有丝裂霉素处理过的培养皿内，
向培养皿内滴加培养液，置于37'C、 5y。C02条件下培养，以后每1 2天更换培养液, 每日于倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。
其中所述培养液包括Knockout DMEM80ml， Knockout serum replacement (血清替代物)20ml，子bFGF (碱性成纤维细胞生长因)400ng， LIF(白血病抑 制因子)1000ng， L一谷胺酰胺2mM， Forskolin 10幽，非必需氨基酸0.1 mM，丙酮 酸钠lmM, e-巯基乙醇O. lraM，血小板衍化生长因子PDGF，为了确定PDGF的最佳 含量，申请人做了大量实验，结果具体见图1，从图中可见PDGF的含量优选30 — 200ng/ml，最优选50ng/ml。
c、将接种后的胚胎生殖嵴干细胞培养传代 每15天用机械法将克隆分为若干块，接种新的培养皿上进行传代培养。 同时，本发明还提供了了一种根据上述方法制备的人胚胎生殖嵴干细胞系。 本申请人通过基因芯片的方法，对人胚胎生殖嵴干细胞EG细胞基因表达谱进行 研究，发现血小板衍化生长因子PDGF受体在EG细胞中的表达水平非常很高，因 此通过在培养基中添加外源血小板衍化生长因子PDGF，克服了以往人胚胎生殖嵴干 细胞体外培养的缺陷，使得人胚胎生殖嵴干细胞能够长时间体外培养并维持其不分 化状态，同时培养出的人胚胎生殖嵴干细胞在小鼠体内可形成畸胎瘤，在世界上首 次在体内证明人EG细胞的多潜能性。
因此，我们的研究可能将极大的推进人们对人EG细胞认识，为将来的临床细胞 治疗提供来源充足的多潜能细胞。
图1 PDGF含量对人EG细胞增殖的影响。 图2人EG细胞在小鼠体内形成的畸胎瘤。 图3鉴定畸胎瘤的HE组织形态学检测具体实施方式
实施例1
1、培养液的配制
按照以下配方配制培养液Knockout DMEM 80 ml，血清替代物Knockout
serum replacement 20ml，碱性成纤维细胞生长因子bFGF 400ng，白血病抑制因子LIF
1000ng， L —谷胺酰胺2mM， Forskolin 10pM，非必需氨基酸0.1 mM，丙酮酸钠
lmM， 0 -巯基乙醇O.lmM， PDGF40 ng/ml。其中，Knock out DMEM ， knock out serumreplacement ，白血病抑制因子LIF购于Gibco公司，L一谷胺酰胺，非必须氨基酸， Forskolin购于Hyclone公司，bFGF购于P印rotech公司。
2、人胚胎生殖嵴干细胞的培养
用0.25M胰蛋白酶消化人胚胎生殖嵴干细胞(来源于北医三院赠送)15min，终止 消化；将消化后的胚胎生殖嵴干细胞用吸管移入到铺有丝裂霉素处理过的培养皿内， 向培养皿内滴加培养液，置于37"、 5MC02条件下培养，以后每1 2天更换培养 液,每日于倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。 3、将接种后的胚胎生殖嵴干细胞培养传代 每15天用机械法将克隆分为若干块，接种新的培养皿上进行传代培养。 实施例2
PDGF含量为30 ng/ml，其余同实施例1 。 实施例3
PDGF含量为200 ng/ml，其余同实施例1 。 实施例4
PDGF含量为80 ng/ml，其余同实施例1 。 实施例5
PDGF含量为150 ng/ml，其余同实施例1 。 实验例1
将实施例1所制得的人胚胎生殖嵴干细细胞用0.25%胰蛋白酶消化，离心，沉 淀用PBS重悬，制备细胞密度为107ml的细胞悬液，用lml注射器将细胞悬液注入 到SCID小鼠后腿肌肉内，注入量为200叱，连续观察12周，检测肿瘤是否形成，检 测结果见图3，发现最终形成了畸胎瘤，所形成的畸胎瘤见图2。
可见，本发明申请培养出的人胚胎生殖嵴干细胞最终在小鼠体内可形成畸胎瘤，
权利要求
1、一种人胚胎生殖嵴干细胞培养液，其特征在于，培养液中含有血小板衍化生长因子。
2、 根据权利要求1所述的人胚胎生殖嵴干细胞培养液，其特征在于，所述培养液包 括Knockout DMEM 80 ml，血清替代物20ml，碱性成纤维细胞生长因子400ng， 白血病抑制因子1000ng， L一谷胺酰胺2mM， Forskolin IOMM，非必需氨基酸0. 1 mM， 丙酮酸钠lmM， 0-巯基乙醇0. lmM，血小板衍化生长因子30—200ng/ml。
3、 根据权利要求1或2所述的人胚胎生殖嵴干细胞培养液，其特征在于，所述培养 液中血小板衍化生长因子的含量为50ng/ml。
4、 一种人胚胎生殖嵴干细胞的培养方法，包括，a) 人胚胎生殖嵴干细胞的消化；b) 将消化后的胚胎生殖嵴干细胞接种于含有权利要求1或2所述培养液的培养皿 中培养；c) 将接种后的胚胎生殖嵴干细胞培养传代； 其特征在于，在所述培养液中含有血小板衍化生长因子。
5、 根据权利要求4所述的人胚胎生殖嵴干细胞的培养方法，其特征在于，所述培养 液包括Knockout DMEM 80 ml,血清替代物20ml，碱性成纤维细胞生长因子400ng， 白血病抑制因子1000ng， L一谷胺酰胺2mM， Forskolin 10)41，非必需氨基酸0. 1 mM， 丙酮酸钠lmM， e-巯基乙醇0. lmM，血小板衍化生长因子浓度为30—200ng/ml。
6、 根据权利要求4或5所述的人胚胎生殖嵴干细胞的培养方法，其特征在于，所述 血小板衍化生长因子浓度为50ng/ml。
7、 根据权利要求4所述的人胚胎生殖嵴干细胞的培养方法，其特征在于，所述人胚 胎生殖嵴干细胞的消化是用0. 25。/。胰蛋白酶消化15min。
8、 根据权利要求4所述的人胚胎生殖嵴干细胞的培养方法，其特征在于，所述将消 化后的胚胎生殖嵴干细胞接种于含有权利要求1或2所述培养液的培养皿中培养的 过程为将消化后的胚胎生殖嵴干细胞用吸管移入到铺有丝裂霉素处理过的培养皿 内，向培养皿内滴加培养液，置于37'C、 5。/。C02条件下培养，以后每1 2天更换培 养液,每日于倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。
9、 根据权利要求4所述的人胚胎生殖嵴干细胞的培养方法，其特征在于，所述将接 种后的胚胎生殖嵴干细胞培养传代的过程为每15天用机械法将克隆分为若干块， 接种新的培养皿上进行传代培养。
10、 一种根据权利要求4一10任何一项方法制备的人胚胎生殖嵴干细胞系。
全文摘要
本发明公开了一种人胚胎生殖嵴干细胞的培养方法和由该方法制备的细胞系，本方法是通过在培养液中添加血小板衍化生长因子PDGF实现的，克服了以往人胚胎生殖嵴干细胞体外培养的缺陷，使得人胚胎生殖嵴干细胞能够长时间体外培养并维持其不分化状态，同时培养出的人胚胎生殖嵴干细胞在小鼠体内可形成畸胎瘤，在世界上首次在体内证明人EG细胞的多潜能性。
文档编号C12N5/08GK101338300SQ200710122999
公开日2009年1月7日 申请日期2007年7月6日 优先权日2007年7月6日
发明者李凌松 申请人:李凌松