专利名称：一种细胞悬浮培养罐的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞培养罐，它呈倒置的平锥体底或倒置的平截头体底，可以减少细胞接种体积，更好地混合以免产生机械剪切力，并具有较好的通气量。
背景技术：
动物细胞的高密度悬浮培养生产蛋白类药物或疫苗产品的必要方法。小体积的细胞培养罐用于实验室生产，大体积的细胞培养罐用于工业化生产。
目前的细胞培养罐和摇瓶的形状都是很典型的柱体形。这样的罐体或瓶工作体积的高∶径比大于1∶1。罐体中的培养基表面积小，不利于培养物对氧气的有效吸收。常用空气或氧气喷射来解决这一问题。然而，过量的空气喷射常产生泡沫和使气泡破裂，同样过量的氧气喷射也毒害细胞。因此，用较复杂的控制塔和相关的溶氧探头来监控空气或纯氧的喷射。但，优化控制塔或探头比较昂贵。因此，需要开发无控制塔和无相关溶氧探头的小体积培养罐，特别是一次性罐体，和“易于优化”的大体积培养罐。
本发明提供一种不使用复杂的控制塔和相关的探头的细胞培养罐，同时还提供一种一次性或可灭菌的小体积摇瓶型的悬浮培养系统。以及一种“易于优化”的搅拌器驱动的大体积工业化倒置的平锥底生物反应器系统。
发明内容
本发明发现，只要培养基表面积与培养基体积比高于0.14cm2/cm3，不利用复杂的控制塔和相关的溶氧和pH探头，即可使悬浮培养的动物细胞生长良好。
为此，本发明提供一种细胞培养罐，该细胞培养罐可描述为宽体平锥底罐。本发明的细胞培养罐其由三部分连接而成，上部有三个圆柱状出口，出口为圆柱状凸出于罐体并以左中右排列，中间出口大于两边出口；中部为圆柱状罐体和上下部相连；下部为平底圆锥状，圆锥底部为平面状，如图1所示。
本发明的细胞培养罐，其上，中，下部分连为一体，上部分的轴与下部分的轴是一致的。
本发明的细胞培养罐，呈倒置的平锥底，有助于培养基通过摇动或推动力混合时，不产生或产生极低的剪切力，产生极少的机械张力。
本发明的细胞培养罐，空气可以进入罐体。
本发明的细胞培养罐，其特征在于，倒置锥体的锥角在30-70度间。
本发明的细胞培养罐，是由玻璃，金属，塑料和一次性或可灭菌的材料组成。
本发明还提供一种培养细胞的系统，包括本发明所述的细胞培养罐，摇床平台或推动器。
本发明还提供一种培养活细胞的方法，包括如下步骤(a)提供如权利要求1所述的细胞反应罐。
(b)将液体培养基注入细胞反应器中。
(c)将含有细胞需要的种子细胞培养物接入罐中。
(d)在合适的条件下培养细胞。
氧气呼吸面积/培养基体积比率不小于0.14cm2/cm3.其中所述的方法，接种体积/液体培养基的工作体积不大于1/10。所述的方法，液体工作培养基含有无血清培养基，含有非CO2依赖的20mMHEPS或类似物以保持稳定的PH。
本发明还提供一种本发明的细胞培养罐的使用方法，即使用本发明的细胞培养罐培养动物细胞，所述细胞中可含有药物蛋白，如EPO，G-CSF，GM-CSF，TPO等，本发明通过上述细胞培养罐来制备所述蛋白药物。
本发明还提供制备药物的方法，即用本发明的细胞培养罐培养含有药物蛋白的动物细胞，培养过程中，通过底部的空气喷射或表面的纯氧供给，在37℃用带有20-25mM HEPS的无血清培养基进行培养。
本发明的细胞培养罐表明宽体罐与传统的柱体搅拌罐相比具有表面通气好的特点。
许多皮实的动物细胞株都被开发成了无血清培养和无动物来源组份的悬浮培养，包括CHOD(B11和DG44)，CHOK，and NS0(适应无血清培养的)细胞系。也开发了无动物组分来源的悬浮培养基(包括基础生长培养基和添加培养基).添加了非二氧化碳依赖的缓冲液如20mM HEPES缓冲体系，有些细胞培养过程中需要充足的表面气体，而对于本发明的宽体平锥底反应器而言，不需要复杂的控制塔和相关的溶氧和pH探头，这使我们可以实验并开发简化的易于优化的生物反应器用于动物细胞的无血清悬浮培养。
一个实例是，如图1a，b示，设计制作了3升和150ml工作体积的细胞培养罐，惊奇的是，它们工作的效果比传统的Applikon平底细胞培养罐好，在细胞密度、重组蛋白产量、细胞活力和细胞皮实性方面优势明显.显然结合了摇床、平锥底、宽体和pH稳定的培养基，工作起来对动物细胞培养和重组蛋白的产量具有优势。
因此该发明的重点是用小规模的150ml的本发明细胞培养罐来筛选较皮实的生产动物细胞株。
本发明的细胞反应罐罐体的设计体积为500ml，设计工作体积为150ml.在研究中利用表达重组蛋白VEGFR1-Fc-IL-1ra的CHO工程细胞，表1的流加培养结果表明150ml摇瓶对小规模悬浮培养效果很好，起始培养过程中的接种体积为7.5-15ml(是工作体积150ml的1/20-1/10)本发明的细胞培养罐，具有有效的锥体角度.用塑料的不同锥角的锥底离心管研究了锥角对固定转角摇动、培养基混合、接种体积的影响(表2)，本发明发现，如果锥角太小(比如小于30度，或者太宽，大于70度)，摇床不能使培养基很容易地波及管壁。
本发明的细胞培养罐，不用复杂的控制塔和相关的溶氧、pH探头，通气是通过位于锥底最低点的空气喷射来进行，可延长气泡的行程，或者在培养基表面通纯氧。
本发明发现，摇床可以使培养基很容易的波及培养罐壁，因而产生较小的机械张力，形成较宽的薄培养基层以扩大表面积，增大通气量和更好的混合。
本发明运用了3升细胞培养罐(图1a，b)没有应用控制塔和相关的溶氧探头，过滤空气(含21％的纯氧)通过位于锥底处的空气喷射泵入摇瓶中，对细胞没有明显的损伤，或者小流量的纯氧通过罐体上方的管道(类似气流计)供给，可以产生较大的气泡或直接的氧气覆盖.
应用细胞培养罐表达的TNFR1-Fc-IL-1ra，IL-18bp-Fc-IL-1ra，VEGFR1-Fc-IL-1ra，andTie2-Fc-IL-1ra的CHO细胞的培养，在Applikon 20升平底搅拌反应器(图1b示)和20升平底摇瓶中(表3，4，5)，其工作体积为3升，以这二种反应器作为对照，概括了宽体平锥底细胞反应器与二种对照反应器的研究结果。
令人吃惊的是，宽体平锥底反应器(表3)工作明显地好于平底的Applikon搅拌型反应器(表4)和平底的摇瓶(表5)，显然摇床摇动能够推动培养基波及罐体壁，且不产生剪切力和机械张力，形成较大范围的薄培养基层流，有利于扩大通气量.
本发明的最后一部分是设计、分析和研究工业化生产所用的搅拌器驱动宽体平锥底细胞反应器的样机。申请的这种宽体平锥底细胞反应器明显地有助于减少接种体积(图3)并能提高搅拌水平，可降低机械张力和剪切力。此外这种设计具有较大的表面积有助于改善通气量和更有效的二氧化碳的逸出(图4a，b)。我们的目标是产业化的细胞反应器更稳定、更易于优化放大，而且使用更少量的接种体积。图4a表明影响工艺放大和优化的问题和因素包括混合、剪切力、机械张力、通气量和二氧化碳的逸出。这些因素使得放大优化特别是大体积的工业化反应器的放大更为困难，经综合分析，我们认为至少在理论上，宽体平锥底细胞反应器不但可以改善放大的优化参数(如较好的混合，较低的机械张力，更小的剪切力)(图4b)，而且可降低搅拌器驱动型反应器的接种体积(图3)。在特定的转速下，宽体平锥底细胞反应器的尖底和增加的表面积可以改善放大优化过程。
图1a3升宽体平锥底反应器，工作体积＝3升；培养基表面积/培养基体积大于0.143
图1b3升宽体平锥底反应器和传统的平底Applikon生物反应器图2150ml宽体步锥底摇瓶，是一个150ml宽体锥底摇瓶的图片，工作体积等于150ml培养基，总的自由空气空间为500ml；最小接种体积为7.5ml，是工作体积的1/20.这种系统需要摇床平台，气流计，低位空气喷射装置和空气泵装置.这种系统设计主要用于筛选生产细胞株的耐性，表达量及种子链支持.
图3系列宽体平锥底悬浮培养罐，提供了一种简化的种子链过程图4a图解用以展示工业化高柱体搅拌型生物反应器的放大问题，影响放大的负面因素，混合，剪切力，机械张力，通气和二氧化碳的优化.
·搅拌充分的混合，避免细胞剪切损伤·通气提供氧气，排放CO2图4b图解用于展示宽体平锥底细胞反应器在大规模工业化培养中的优势·较大的表面积可增加溶氧，驱除CO2·气泡突释对细胸的损伤更小，低泡，高CO2逸出·易于放大，操作可靠具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1150ml宽体平锥底细胞反应器的研究用小型的摇瓶流加培养CHO生产细胞株对筛选皮实和高产量的生产细胞株是一种重要的途径。本研究中，应用150ml宽体平锥底细胞反应器(图2)和宽体的锥底摇瓶(Corning公司产品号#431123)流加的结果(表1)表明150ml摇瓶适合于小规模的流加研究，接种体积小(只是工作体积的1/20)。表达滴度可与2L的反应器比拟。倒置平锥体型的摇瓶明显地有细胞沉降特别是那些细胞团更易沉降，主要是因为尖底部的混合不好，正因为此原因，我们放弃了使用倒置型的尖底锥形底，采用了倒置的平锥底。
表1培养罐放置在摇床平台上，转速为100rpm.批培养体积达到90ml二天后，在第七天流加4.5ml
实施例2不同锥角的锥底罐的研究用了不同锥角的塑料离心管在摇床上研究锥角对摇动，培养基混合和接种体积的影响(表2)。如果锥角不是太宽或太窄，摇动不能使培养体积波及罐壁形成较宽的薄层以扩大培养基表面种。例如，如果锥角太宽，比如大于70度时，它与平底罐就没有明显的差别.如果锥角太小，比如小于30度时，它与平底罐也没有明显的差别.表3的结果表明锥角为30度是有效摇动和混合的最小角度，根据计算大于70度的锥角的罐体与常规圆底罐头体相比没有明显地减少接种体积，这样就被放弃了.
表2不同锥角罐体对有效摇动、混合和接种体积的不同效果研究.
注此实验中应用CHO细胞表达的TNFR2-Fc-IL-1ra
实施例33升宽体平锥底摇瓶的研究3升宽体平锥底细胞反应器配置氧气管装置或空气喷射(图1a，b)，在工作体积的培养基具有较大的表面积，有利于培养基对氧气的吸收(每立方厘米培养基的表面积大于0.143cm2)，宽体平锥底细胞反应器在底部安置空气喷射装置，延长空气(含有21％的氧气)的逸出行程(图a，b)。底部的氧气管装置作为低流量计用于控制低流速的纯氧，摇床能使培养体积波及罐壁，易于形成薄的培养层，以延长培养表面积和改善通气。
用CHO细胞株表达TNFR1-Fc-IL-1ra，IL-18bp-Fc-IL-1ra，VEGFR1-Fc-IL-1ra，andTie2-Fc-IL-1ra重组蛋白，用于做动物实验研究.运用了上面提及的3升宽体平锥底细胞反应器，、Applikon公司的2升搅拌型平底反应器和20升摇瓶型的培养瓶来表达重组蛋白，表3，4，5概括了这三组不同反应器的实验结果。
让人吃惊的是，宽体平锥底细胞反应器(表3)明显地好于Applikon公司的2升搅拌型平底反应器(表4)和20升摇瓶型的培养瓶(表5)。显然摇床可以推动培养基波入罐壁，并不形成剪切力，不产生机械张力，形成一个较薄的培养基层有利于增大通气。
宽体平锥底细胞反应器的设计好于目前开发的波浪式袋状反应器。我们的分析表明，它具有较大表面积用于氧气的吸收和二氧化碳的逸出，这点与波浪式袋状反应器相似。但是，摇床与宽体平锥底细胞反应器的一起应用使得培养基能波及罐体壁，形成较薄的培养基层流以扩大培养基表面的通气量，与波浪型反应器一样，它也是一次性使用的塑料罐。但它优于波浪型细胞反应器，因为它能明显地减少种子细胞的接种体积，它还有一个明显优于波浪型细胞反应器的特点就是在宽体平锥底细胞反应器的底部配置了一个空气喷射装置，它能明显地延长气泡行程时间。尽管没有直接与波浪型细胞反应器进行细胞密度、费用消耗和应用友好度等方面的对比，但所有的简接数据都说明宽体平锥底细胞反应器在诸多方面都明显地优于波浪型细胞反应器。
表3表达TNFR1-Fc-IL-1ra、IL-18bp-Fc-IL-1ra、VEGFR1-Fc-IL-1ra和Tie2-Fc-IL-1ra的CHO细胞株在配置氧气管设置或空气喷射装置的3升宽体平锥底细胞反应器中的批式培养
表4表达TNFR1-Fc-IL-1ra、IL-18bp-Fc-IL-1ra、VEGFR1-Fc-IL-1ra和Tie2-Fc-IL-1ra的CHO细胞株在Applikon 2升平底搅拌型细胞反应器中的批式培养，概括的一些结果列在这里用以对照.
表5.20升摇瓶培养配置氧气管泡装置或空气喷射装置常用来批流加式培养制备由CHO细胞表达的TNFR1-Fc-IL-1ra、IL-18bp-Fc-IL-1ra、VEGFR1-Fc-IL-1ra and Tie2-Fc-IL-1ra的动物实验用蛋白产品，结果如下表，可以作为对照。
实施例4二个具体的例子，用3L宽体锥底细胞反应器和2L Applikon平底生物反应器流加批培养生产TNFR1-Fc-IL-1ra。
用3L宽体平锥底细胞反应器配置了氧气管泡装置和2L的Applikon平底反应器用无血清培养生产TNFR1-Fc-IL-1ra，运用流加批式培养，结果见表6。注2％pcv(细胞体积压积)＝9.6×106 cells/ml。3升宽体锥底细胞反应器明显地好于Applikon的平底生物反应器。表6.结果。注2％pcv(细胞体积压积)＝9.6×10-6 cells/ml。3升宽体锥底细胞反应器明显地好于Applikon的平底生物反应器。
权利要求
1.一种细胞培养罐，其特征在于，其由三部分连接而成，上部有三个圆柱状出口，出口为圆柱状凸出于罐体并以左中右排列，中间出口大于两边出口；中部为圆柱状罐体和上下部相连；下部为平底圆锥状，圆锥底部为平面状，其形状和构成如图1所示。
2.权利要求1所陈述的细胞培养罐，其特征在于，上，中，下部分连为一体，上部分的轴与下部分的轴是一致的。
3.权利1所述的细胞培养罐，其特征在于，呈倒置的平锥底，有助于培养基通过摇动或推动力混合时，不产生或产生极低的剪切力，产生极少的机械张力。
4.权利1所述的细胞培养罐，其特征在于，空气可以进入罐体。
5.权利1所述的细胞培养罐，其特征在于，倒置锥体的锥角在30-70度间。
6.权利1所述的细胞培养罐，其特征在于，是由金属，塑料和一次性或可灭菌的材料组成。
7.培养细胞的系统，包括权利要求1中所述的细胞反应罐，摇床平台或推动器。
8.培养活细胞的方法，包括如下步骤(a)提供如权利要求1所述的细胞反应罐；(b)将液体培养基注入细胞反应器中；(c)将含有细胞需要的种子细胞培养物接入罐中；(d)在合适的条件下培养细胞；所述条件为氧气呼吸面积/培养基体积比率不小于0.14cm2/cm3。
9.权利要求8中所述的方法，其中所述条件为接种体积/液体培养基的工作体积不大于1/10。
10.权利要求8所述的方法，液体工作培养基含有无血清培养基，含有非CO2依赖的20mMHEPS或类似物以保持稳定的PH。
全文摘要
本发明揭示了一种细胞悬浮培养罐及其用途，与传统平底生物罐相比，本发明的特征是宽体培养罐，呈倒置的平锥形底，此设计具有明显较大的培养基表面积，有利于氧气的吸收和二氧化碳的逸出，倒置的平锥底罐在种子细胞培养过程中可明显减少细胞接种体积，这种倒置的平锥底使空气喷射更低位，可以延长空气泡的行程，同时固定的摇动可以使培养基波及罐壁，产生很小的剪切力和机械张力，形成了一个大范围的薄培养基层，有利于扩大表面积，增大通气量和改善混合。利用这种设计，开发了不用复杂控制塔和相关探头的一次性应用的塑料或玻璃可灭菌的小体积摇瓶式悬浮培养系统，此外，还研究了易于优化的搅拌桨驱动的大体积的工业化生物反应器的样机。
文档编号C12M3/02GK101085980SQ20071013013
公开日2007年12月12日 申请日期2007年7月23日 优先权日2007年7月23日
发明者惠觅宙, 李会成, 冷国庆 申请人:哈尔滨安普科技发展有限公司