专利名称：一株对多菌灵具有高抗活性的黑曲霉菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株对多种农药具有抗性的黑曲霉菌株，由于该菌株经诱变后，获得稳定遗传的、对多种常用农药具有抗性的特征，同时并未在杀线虫能力方面表现下降，可用于植物寄生线虫的生物防治，尤其与多种农药混配防治番茄根结线虫病。
具体实施例方式 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1黑曲霉ANUV90对多菌灵的敏感性及稳定性 将黑曲霉ANUV90接种于含50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml多菌灵有效成分的含药PDA培养基平板，一定时间后，测量菌落大小。将诱变后获得抗药性的突变体菌株接种到不含多菌灵的正常PSA培养基上培养，连续进行10代，测定诱变后黑曲霉抗药性的遗传稳定性。
抗药培养基的制作将50％多菌灵可湿性粉剂先溶于0.1mol/L稀盐酸中，配成含药有效成分3750μg/mL(0.375g药剂+100mL无菌水即得到3750μg/mL)母液，梯度稀释成浓度为0.375μg/mL，37.5μg/mL，375μg/mL，3750μg/mL，然后分别取1mL加入体积为75mLPSA培养基中灭菌，制成浓度分别为0、0.05μg/mL、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL含药培养基平板。到入直径为9cm的玻璃培养皿中，每皿15mL冷却后备用，以无药剂的PSA培养基为对照(CK)，每处理重复四次。
黑曲霉ANUV90在高达1000μg/mL多菌灵处理浓度(该浓度经换算远大于多菌灵田间使用浓度)下仍可正常生长，各多菌灵浓度处理与对照处理的正常黑曲霉菌落生长状况无显著差异，甚至某些浓度水平(如浓度为500μg/mL)表现出一定程度上促进ANUV90的生长，与原菌株AN相比，黑曲霉ANUV90对多菌灵极为不敏感，其抗药性提高了近1000多倍(表1，表2)。
表1黑曲霉AN在不同浓度多菌灵处理下菌落生长半径(mm)的比较
表中数据为AN生长2d后的测定值 表2ANUV90在不同浓度多菌灵处理下菌落生长半径(mm)的比较
表中数据为ANUV90培养2d后的测定值 黑曲霉ANUV90继代培养10代后对多菌灵不同浓度处理与对照AN菌落生长状况无显著差异，表明ANUV90对多菌灵的高度抗药性可以稳定遗传(表3)。
表3黑曲霉ANUV90继代培养10代后对不同浓度多菌灵处理下菌落生长半径(mm)的比较
表中数据为ANUV90在无药培养基上继代培养10代2d后的测定值 实施例2黑曲霉ANUV90菌体特征 通过显微镜40倍下观察诱变前后菌株菌丝形态，通过扫描电镜观察孢子形态，并拍照。
黑曲霉ANUV90在相同40倍光学显微镜下可看出抗药性突变株的菌丝要比原菌株要狭细一些，很可能是紫外辐射变异的结果，扫描电镜观察ANUV90孢子形态与文献资料中AN孢子形态无明显差别，仅稍显不规整(附
图1左图为AN的菌丝形态，中图为ANUV90的菌丝形态，右图为扫描电镜下ANUV90孢子头形态)。
实施例3黑曲霉抗药性突变菌株ANUV90与常用化学药剂的兼容性 常用杀菌剂(克露、百菌清、甲基托布津、代森锰锌、甲霜灵、霜溜溜、乙霉威)、杀虫剂(敌杀死)、除草剂(乙草胺、莠去津)、植物生长调节剂(赤霉素)制成含药有效成分浓度分别为0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL的PSA培养基，以不含药为对照。制好平板后，用直径为5mm的无菌的打孔器获得黑曲霉菌株及黑曲霉抗药性突变菌株的菌片将其接于含药PSA培养基上。在25℃下恒温培养，2天后记录菌落扩展情况，用十字交叉法测量菌落的直径。
PSA培养基马铃薯200g、蔗糖20g、琼胶20g、水1000mL。
除乙霉威以外，AN与ANUV90两菌株与多数杀菌剂、除草剂、其它供试药剂的兼容性并没有明显差异，而且基本都是在低浓度条件下对菌株影响微弱，极个别农药甚至对ANUV90有一定促进作用(说明这些微量农药可为ANUV90菌株生长提供营养物质)，但总体上随着药剂浓度的增大而两菌株菌落直径都逐渐变小；其中与杀菌剂代森锰锌、甲霜灵，除草剂莠去津，杀虫剂敌杀死和植物生长调节剂赤霉素有良好的兼容性，说明两菌株均可与这些化学药剂混合复配使用。
表4 AN与ANUV90在不同药剂不同浓度处理下的菌落直径
实施例4 ANUV90发酵液杀线虫活性 将ANUV90的菌丝体接种到试管琼脂培养基上，培养基配方为PDA培养基，即马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂17g；水1000mL。25℃培养10d，获得试管种。
再将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装50mL)液体培养基中，培养基配方为(重量百分比)蔗糖(2.83％)、硫酸铵(1.367％)、K2HPO4(0.064％)、MgSO4·7H2O(0.182％)、KCl(0.996％)、FeSO4(0.02％)，余下为水，pH6.5。25℃～28℃下，摇床转速以150r·min-1～200r·min-1、发酵240h。将发酵液配成不同的倍数进行杀线虫药效试验。
在特制凹面小皿中放入100μL不同浓度灭菌滤液，后放入50条左右北方根结线虫J2，以无菌水为对照，三次重复，分别在12h、24h、48h计算J2的相对死亡率。(公式如下)
在12h、24h、48h这三个时间，测定相同浓度的诱变前后菌株发酵滤液对线虫的致死率无明显差异(附图2黑曲霉AN与ANUV900原液12、24、48小时对根结线虫致死率动态比较)。
实施例5 ANUV90抗药性的分子机制 供试菌株黑曲霉(AN)，黑曲霉抗药性菌株(ANUV90) 1.样品制备 用灭菌打孔器在PSA平板上打出供试菌株的菌饼，然后用镊子夹取菌饼放入PS(马铃薯汁与蔗糖)培养液中，于180r/min振荡25℃恒温培养箱中进行培养，一周后取出，用双层纱布过滤菌丝，无菌蒸馏水反复冲洗3次后，用滤纸将菌丝表面水分充分吸干，放入50℃-55℃烘箱中烘干至适宜的状态，4℃冰箱保存备用。
2.基因组DNA的提取 本项试验采用尿素提取法(刘少华等，2005)将0.5g研磨好的ANUV90烘干菌丝加入10mL尿素提取液(7mol/L Urea、50mmol/L Tris-HCl pH8.0、62.5mmol/L Nacl、1％SDS)，摇匀，转入离心管中，以转速12000r/min，高速冷冻离心5min，取上层清液，重复一次。
将上清夜转移入另一新管中，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比＝25∶24∶1)溶液，用力振荡数次摇匀，再放入冷冻离心机，以转速12000r/min，离心5min，取上清液到一新管中加入等体积的异丙醇和1/10体积3mol/L的NaAc(pH＝5.2)，-20℃静置30min，以12000r/min再离心5min，弃上清液，倒置使管壁液体流尽，用70％乙醇、无水乙醇洗涤沉淀，室温放置干燥5-10min，溶于200μL双蒸水中，加入RNaseA(10μg/μL)2μL，37℃水浴30min，-20℃保存备用。
3.聚合酶链式反应(PCR) 引物用B1和B3由上海生工(Sangon)合成，序列分别为 B1 5’A (AG) AT (CT) ACCCA (CT) TC (CT) CT (CT) GGTGGTGG 3’ B3 5’CTCCAT (CT) TC (AG) TCCAT (ACT) CC (CT) TC (AG) CC 3’ 接以供试菌株基因组DNA为模板扩增β-微管蛋白基因。
50μL反应体系中含100ng基因组DNA模板，5L 10×bufer(10mmoL/L Tris-HCl，50mmoL/L KCl)，MgCl2 2mmol/L，Taq DNA聚合酶1U(上海Promga)，dNTP 0.2mmol/L，引物各0.5μmol/L。
反应条件为94℃ 5min，1个循环；94℃ 1min，65℃ 2min，72℃ 2min，30个循环；最后72℃延伸5min结束。
PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳检测，溴化乙锭(EB)染色30min，置凝胶于ImageMaster紫外成像系统上观察并拍照(附图3 AN与ANUV总DNA和β-微管蛋白基因扩增片断电泳图谱)。
4.序列同源性分析与突变位点的比较 用引物B1、B3对扩增产出直接进行测序，采用VectorNTI Suit9对AN与ANUV90碱基和氨基酸序列比较分析。
5.PCR扩增产物序列测定及AN与ANUV90菌株β-微管蛋白基因片段比对分析将PCR扩增片断直接交上海Sangon公司测序，通过B1和B3引物对黑曲霉AN与ANUV90菌株的β-微管蛋白基因进行PCR扩增，均获得相同长度的DNA片段(附图3)，双向测序后经拼接，确定上述菌菌株的β-微管蛋白基因片段长度为854bp，通过Blast与黑曲霉同属的典型模式菌株Aspergillus nidulans(benA)的β-微管蛋基因序列比对核苷酸同源性为92.3％。因此进一步证实，这两个片段可分别明确为黑曲霉AN与ANUV90编码β-微管蛋白基因。测序片段结果表明，AN与ANUV90两菌株核苷酸序列个别位点不同，在81位A突变成C，而导致氨基酸发生了变化，AN的26位谷氨酸(Glu)替换成天冬氨酸(Asp)(E→D)，该位点可能是突变位点中的一个，从而导致了ANUV90在生物学特性上抗药性的产生(附图4黑曲霉ANUV90的β-微管蛋白DNA序列与原始AN菌株比较差异及推断的氨基酸变化，1 AN总DNA；2 ANUV90总DNA；3 AN的β-微管蛋白基因；4 ANUV90的β-微管蛋白基因；5 ANUV90的β-微管蛋白基因；M DNAMaker)。
该菌株ANUV90的分类命名为黑曲霉Aspergillus niger，已于2007年10月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2234。
通过筛选获得对多菌灵具有较高稳定抗性的黑曲霉菌株ANUV90，该菌株同时对番茄根结线虫有一定的生物活性，对多种化学药剂具有稳定抗性；经序列测定、比对表明，基因序列中编码β-微管蛋白基因发生定位点突变，从而导致了ANUV90在生物学特性上抗药性的产生。该菌株这一特点使得其可与多数常用农药可协同混配使用防治多种有害生物，为解决生防菌株田间防效不稳定问题提供一条途径，具有良好的开发应用前景。
权利要求
1.本发明为一株对多菌灵具有抗药性的真菌菌株，该菌株ANUV90为黑曲霉Aspergillusniger，已于2007年10月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.2234。
2.根据权利要求1所述的黑曲霉，其特征为该菌的发酵液对多菌灵具有稳定抗性，对番茄根结线虫(Meloidogyne spp.)具有一定的毒杀活性。
3.本发明涉及的黑曲霉ANUV90菌株所具有的抗药性为经紫外诱变后发生编码β-微管蛋白基因在81位由A突变成C，而导致变化产生对多菌灵的高抗活性。
4.根据权利要求1及权利要求2所述的黑曲霉ANUV90菌株在农业生产中生物防治中的应用。
5.根据权利要求1及权利要求2所述的黑曲霉在植物寄生线虫尤其是番茄根结线虫(Meloidogyne spp.)防治方面的应用。
6.一种杀线虫制剂，其特征在于，包含权利要求3所述的真菌本身或其代谢物作为活性成分。
7.按照权利要求5所述的方法形成的产品可以是水剂、粉剂或胶悬剂，施用方法可以采用拌种、种子包衣、灌根和土壤处理等各种方法。
全文摘要
本发明中涉及的是一株诱变获得的对多菌灵具有高度稳定抗性的黑曲霉菌株ANUV90，该菌株比原始出发菌株AN对多菌灵的抗性提高1000倍。黑曲霉ANUV90在高达1000μg/mL有效成分多菌灵处理浓度下仍可正常生长，该菌株的发酵液同时具有杀线虫活性。经检测，诱变前后的菌株在菌落形态等特征无明显差异，同时对番茄根结线虫具有一定的生物活性，分析突变菌株抗药性分子机制初步研究结果表明编码β-微管蛋白基因发生定点突变，导致了ANUV90在生物学特性上抗药性的产生。本发明中具体涉及的细菌菌株已于2007年10月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2234，分类命名Aspergillus niger。该菌株这一特点使得其可与多数常用农药可协同混配使用防治多种有害生物，为解决生防菌株田间防效不稳定问题提供一条途径，具有良好的开发应用前景。
文档编号C12N1/14GK101182469SQ20071015802
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月8日 优先权日2007年11月8日
发明者段玉玺, 陈立杰, 王媛媛, 宁 杨, 朱晓峰 申请人:沈阳农业大学