专利名称：茶尺蠖乙醛脱氢酶基因adh及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于昆虫生物技术领域。具体的说，本发明涉及一种乙醛脱氢酶基因克隆；还涉及利用该基因物进行茶尺蠖等昆虫抗逆能力评价和昆虫生长环境监测。
背景技术：
在研究昆虫生物学等特性的过程中，需要大量的昆虫材料。从自然界直 接捕捉，费时费力，工效较差。采用人工饲喂方法，可以使昆虫种群迅速扩 大，但是昆虫饲养过程中经常出现不明原因的死亡等情况，给昆虫词养带来 损失。醛类是生物体内过氧化反应产物的重要组分，如丙二醛、乙醛等，对生物体有较强的毒害作用。乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase, adh)是生物体内用于降解乙醛的重要酶类，它可将乙醛分解为二氧化碳和水，从而消 除醛类对生物细胞的毒害作用。对昆虫adh基因的克隆和表达研究，有助于 昆虫饲养过程中非正常死亡原因的探明，同时可利用该基因表达情况的分析 对词养环境进行评估，从而使昆虫的人工饲养技术研究更加成熟。 发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种茶尺蠖乙醛脱氢酶基因adh及其所 编码的蛋白质，该adh可用于评价昆虫的抗逆能力和监测昆虫的饲养环境。为了解决上述技术问题，本发明提供一种茶尺蠖乙醛脱氢酶基因adh，其 具有SEQIDNo: l所示的核苷酸序列。
本发明还提供了上述基因adh编码的蛋白质，其具有SEQIDNO: 2所示 的氨基酸序列，这是一种茶尺蠖adh核心区的蛋白质序列。本发明还提供了上述基因adh的用途，可用于评价昆虫的抗逆能力和监测 昆虫的饲养环境。作为本发明的基因adh的用途的改进昆虫为茶尺蠖。本发明主要是针对昆虫人工词养过程中出现的不明原因死亡问题，通过 cDNA-AFLP技术研究不同逆境条件下昆虫基因表达差异，从而获得与饲养昆 虫非正常死亡相关的重要基因，即获得了与茶尺蠖等昆虫逆境反应有关的基 因；并利用这些基因表达情况进行昆虫饲养环境的评价。实现本发明的具体技术步骤如下一、茶尺蠖adh基因分离和分析氨和酒精可在茶尺蠖等昆虫饲养过程中由粪便和残存食料等发酵形成， 是最常见的饲养环境胁迫因子，因此采用人工配制的氨和酒精混合液模拟环 境胁迫。取茶尺蠖幼虫若干，将它们分成4组，分别进行不同的氨和酒精混合 液熏蒸处理，包括不熏蒸对照、低剂量熏蒸、中剂量熏蒸和高剂量熏蒸4个处 理。取熏蒸处理0.5-12.0小时后的茶尺蠖若干头用于cDNA-AFLP分析。上述处 理幼虫分别置于不同研钵中液氮研磨，以TRIZOL (Invitrogen公司)试剂提取 总RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提纯化试剂盒(上海生工生物工程有限公 司)获得4种处理幼虫mRNA。分别取l-5iigmRNA进行cDNA合成，双链cDNA 合成采用TakaRa M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (宝生物工程(大连)有限公 司)进行。双链cDNA经异丙醇沉淀纯化后，以TakaRaBamHI/Hhal (宝生物工 程[大连]有限公司)组合酶切消化。消化后的片段与事先设计的2个接头SEQ ID No: 3和SEQIDNo: 4，以T4 DNA连接酶(上海生工生物工程有限公司)连
接。以连接完成的cDNA片段为模板，以预扩增引物组合SEQIDNo: 5和SEQ ID No: 6进行PCR预扩增，PCR程序见表1第1列，将预扩增产物适当稀释后， 以选择性扩增引物组合①SEQIDNo: 7和SEQIDNo: 8，以及组合②SEQID No: 9和SEQIDNo: 10，分别进行PCR选择性扩增，PCR程序见表1第2列。 扩增产物以6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，以核酸银染试剂盒(上海 生工生物工程有限公司)进行显带。1PCR预扩增PCR选择性扩增PCR常规扩增94。C变性30 秒；56。C退火 60秒;72° C延 伸60秒；共30 个循环。94。C变性30秒；65。C退火30秒；72° C延 伸60秒；l个循环。 94。c变性30秒；65。C退火30秒，并以每 循环下降0.7。C; 72。C延伸60秒;12个循环。 94。C变性30秒；56。C退火30秒；72° C延 伸60秒；23个循环。94。C变性4分钟； 一个循 环。 94。C变性30秒；55。C退火 30秒；72。C延伸60秒；35个 循环。 72°(:延伸5分钟。注本发明中未做特别说明的PCR或PCR扩增均指PCR常规扩增从凝胶上割取与胁迫规律相吻合的差异条带，以纯水浸提过夜后，取适 量浸提液作为模板，以选择性引物组合进行PCR，产物进行电泳。电泳结束后 割取目标条带，以UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限 公司)进行片段回收，并插入pUCm-T载体(上海生工生物工程有限公司)， 阳性克隆委托Invitrogen公司进行序列分析。经与美国生物信息数据库 htt。:〃www.ncbi.nlm.nih.gov比对，确定了其中一个524bp的显著差异序列是茶 尺蠖adh基因。获得的adh基因序列，见SEQIDNo: 1。经Editseq软件(DNAStar 公司)推演，获得了该基因序列编码174个氨基酸，见SEQIDNo: 2。序列比 对显示茶尺蠖adh核苷酸序列与家蚕、海葵等生物具有72%以上的相似性，而 氨基酸序列与家蚕和伊蚊等具有79%-92%的同源性。二、逆境对茶尺蠖内源adh基因表达影响
将茶尺蠖幼虫分成两组， 一组在正常湿度条件下饲喂，另一组在高湿度条件下词喂。处理6-96小时后，在正常湿度和高湿度词喂组中分别选取幼虫若 干头。以TRIZOL (Invitrogen公司)提取总RNA,以MMLV第一链cDNA合成 试剂盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA。采用引物组合SEQIDNo: ll和SEQIDNo: 12进行PCR。结果显示，高湿度环境生长的茶尺蠖幼虫死亡 率高于正常湿度处理30-60%，同时高湿环境中的茶尺蠖在胁迫初期，幼虫adh 基因表达显著高于正常湿度处理，但胁迫处理后期adh表达下降。说明在胁迫 早期昆虫为了抵御外界不良环境而提高体内某些抗逆相关基因的表达，以减 少胁迫引起的毒害因子在体内的积累；但是当环境胁迫持续较长时间时，昆 虫由于积累毒害因子过多而使抗逆能力下降，抗逆基因表达也下降。可见adh 基因表达是一种衡量茶尺蠖等饲养环境好坏的重要指标，通过对该指标的检 测有助于提高实验昆虫饲养成活率。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。 图1是实施例1中的扩增产物进行电泳分析后，以核酸银染试剂盒进行 显带所得的图；注M为DNA分子量标记，1为正常对照，2为低剂量熏蒸处理，3中 剂量熏蒸处理，4为高剂量熏蒸处理。实体黑箭头所指为分子量标记，白色箭 头所指为随胁迫程度表现出先升后降规律的目标条带。图2是实施例2中的基因表达图；注M为DNA分子量标记，1为正常湿度饲喂12小时后茶尺蠖幼虫，2 为高湿度胁迫12小时后的茶尺蠖幼虫，3为正常湿度72小时，4为高湿度胁 迫处理72小时。
具体实施方式
实施例l将氨水、工业酒精和水按不同比例勾兌成三种环境胁迫熏蒸液低剂量熏蒸液为包含体积浓度为0.01-0.5%氨水和0.1-0.5%酒精的水溶液，中等剂量熏 蒸液为包含0.6-1.5%氨水和0.5-1%酒精的水溶液，高剂量熏蒸液为包含1.5-6% 氨水和1.1-5%酒精的水溶液。在4个直径为21cm的培养皿中央分别用胶带固定 一团脱脂棉球，棉花用量以可以把熏蒸液完全吸持为准，在棉球上分别滴上 三种不同剂量的熏蒸剂，每种用量2-10ml，以滴加相同体积的纯水作为对照。 将饲养的40头3龄茶尺蠖幼虫平均分成4组，分别置于4个培养皿中，加上适量 茶鲜叶食料后，盖上培养皿盖。熏蒸处理6小时后的茶尺蠖用于cDNA-AFLP 分析。每个处理取2-3幼虫分别置于不同研钵中液氮研磨，以TRIZOL(Invitrogen公司)试剂提取总RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提纯化试剂 盒(上海生工生物工程有限公司)获得4种不同处理mRNA。分别取lpgmRNA 进行cDNA合成，双链cDNA合成采用TakaRa M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit(宝生物工程(大连)有限公司)进行。双链cDNA经异丙醇沉淀纯化后，以 TakaRa BamHI/Hhal (宝生物工程[大连]有限公司)组合酶切消化，具体参照 BamHI和HhaI内切酶使用说明。酶切完成后于70。C条件下灭酶，并经异丙醇 沉淀获得消化产物。以T4DNA连接酶(上海生工生物工程有限公司)连接消 化产物与事先设计的2个接头序列SEQIDNo: 3和SEQIDNo: 4。以连接完成 的cDNA片段为模板，以预扩增引物SEQIDNo: 5和SEQIDNo: 6进行PCR 预扩增，将预扩增产物稀释20倍后，以选择性扩增引物组合SEQIDNo: 7和 SEQIDNo: 8进行PCR选择性扩增。扩增产物以6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行 电泳分析，以核酸银染试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行显带，见图l。目标条带的选择标准为随胁迫强度增加而出现先升后降规律的条带， 因为具有上述规律的条带是与生物逆境反应相符合。从凝胶上割取的目标条带用纯水浸提过夜后，取2-4)iL浸提液作为模板，以引物组合SEQIDNo: 7、 SEQIDNo: 8进行PCR，产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳。电泳结束后割 取目标条带，以UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公 司)进行片段回收，并插入pUCm-T载体(上海生工生物工程有限公司)，阳 性克隆委托Invitrogen公司进行序列分析。经与美国生物信息数据库 http:〃www.ncbi.nlm. nih.gov比对，由选择性扩增引物SEQ ID No: 7和SEQID No: 8所扩增获得的一个524bp的产物与家蚕、海葵等生物的adh基因具有72G/0 以上的同源性。经Editseq软件(DNAStar公司)推演，获得了该基因序列编 码174个氨基酸，序列比对显示推演获得的本发明氨基酸序列与家蚕和伊蚊等 具有79%-92%的同源性。根据对获得基因的核苷酸序列和推演得到的氨基酸 序列，本发明将获得的与环境胁迫相关的基因片段定名为茶尺蠖adh基因，其 具体核苷酸序列见SEQIDNo: 1，氨基酸序列见SEQIDNo: 2。 实施例2在4个直径为21cm的培养皿中央分别用胶带固定一团脱脂棉球，在棉球上 分别滴上2m域20ml的水模拟湿度胁迫，其中2ml处理为正常湿度组，20ml为 高湿度胁迫组。将200头2龄茶尺蠖幼虫分成两组， 一组在正常湿度条件下饲 喂，另一组在高湿度条件下饲喂。每组各2皿， 一皿用于死亡率观察，另一皿 用于基因表达研究。培养12和72小时后，在正常湿度和高湿度饲喂组中分别 选取存活的幼虫2-4头。以TRIZOL(Invitrogen公司)法提取总RNA，以MMLV 第一链cDNA合成试剂盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA。采用引 物组合SEQIDNo: ll和SEQIDNo: 12进行PCR和电泳。结果显示，高湿度 环境生长的茶尺蠖幼虫死亡率比正常湿度处理高60%，同时茶尺蠖幼虫在高湿 胁迫初期adh基因表达比正常湿度处理高2倍以上，但胁迫时间延长至72小时， 高湿胁迫组adh基因表达仅为正常湿度的30-40%;而正常湿度组在处理过程中 始终处于中等水平，见图2。说明adh基因表达是一种衡量茶尺蠖等昆虫饲养 环境好坏的重要指标，通过对该指标的检测有助于提高实验昆虫饲养成活率。因此，我们可以得出如下结论在环境胁迫初期，茶尺蠖的adh基因表达 显著增强，用以形成相应的蛋白，并消除环境的不利因素，但是当环境胁迫 持续延长时，茶尺蠖adh表达量下降，合成的相应蛋白和消除环境不利因素的 能力下降，并最终导致相应抵御胁迫能力丧失，导致个体死亡。可见，不利 环境引起adh波动，而正常环境adh表达平稳。可以从adh表达的波动情况推测 昆虫培养环境是否合适；同时可通过胁迫后期adh表达来推测昆虫的抗逆性， 即在胁迫后期仍能保持adh高表达，则为抗逆强的个体，反之也然。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。 显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人 员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明 的保护范围。 SEQIDNo: 1ggatccacag aggtgggtcg catcatcatggttactcttg agctcggtgg caagagccctaaagctgctc tcatcgctca tagagctgctggtaccagga ccttcgtgca atctggcattatcgcccaaa agagatccgt aggcaaccctgacaaagaga tgtttgacaa agtcatggga郷tgcsttg ctggcgg郷tcgtc卿gcttcgcagatg tca已ggatg已catgaaaataagtattctaa agttcgagac cttcgaagag序列表agtgctgcctctgccgtgaacttg犯gaga 60cttgtcatcttcaacgacgccgatgtcgaa120ttcgctaacgccggccaatgctgtgtggct180tcgtagcaaaatctgccgaa240tacgaagatgttgaacsagga^cctcagatc300ttcatcgatgctggaaaascgcaaggagct360aatgttggatttttcgtccagcccaccgta 420gcc卿gaagagatcttcgggccagttcag480gtggt卿ccgcgc524SEQ ID No: 2Gly Ser Thr Glu Val Gly Arg lie lie Met Ser Ala Ala Ser Ala 1 5 10 15Val Asn Leu Lys Arg Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro 20 25 30Leu Val lie Phe Asn Asp Ala Asp Val Glu Lys Ala Ala Leu lie 35 40 45Ala His Arg Ala Ala Phe Ala Asn Ala Gly Gin Cys Cys Val Ala 50 55 60Gly Thr Arg Thr Phe Val Gin Ser Gly lie Tyr Asp Lys Phe Val 65 70 75Ala Lys Ser Ala Glu lie Ala Gin Lys Arg Ser Val Gly Asn Pro 80 85 90Tyr Glu Asp Val Glu Gin Gly Pro Gin lie Asp Lys Glu Met Phe 95 100 105Asp Lys Val Met Gly Phe lie Asp Ala Gly Lys Thr Gin Gly Ala 110 115 120Arg Cys lie Ala Gly Gly Gly Arg Gin Gly Asn Val Gly Phe Phe 125 130 135Val Gin Pro Thr Val Phe Ala Asp Val Lys Asp Asp Met Lys lie 140 145 150Ala Arg Glu Glu lie Phe Gly Pro Val Gin Ser lie Leu Lys Phe 155 160 165Glu Thr Phe Glu Glu Val Val Asp Arg 1705'-CTCGTAGACTGCGTACC -3' SEQ ID No: 3 (BamHI接头)3!- CATCTGACGCATGGCATG-5' SEQ ID No: SEQ ID No:SEQ ID No:5'- CGATGAGTCCTGAGCG -3' 4 (Hhal接头)3-TACGCTACTCAGGACTC -5'5 (预扩增上游引物)5，-GTAGACTGCGTACCGATCC-26 (预扩增下游引物)5，-GATGAGTCCTGAGCGC-3，SEQ ID No: 7 (选择性扩增上游引物)SEQ IDNo: 8 (选择性扩增下游引物)SEQ IDNo: 9 (选择性扩增上游引物)SEQ IDNo: 10 (选择性扩增下游引物)，-GACTGCGTACCGATCC AC-3'，-GATGAGTCCTGACGCGCGG-3 ，，-GACTGCGTACCGATCC AT -3'，-GATGAGTCCTGACGCGCGT -3，SEQ IDNo: SEQ IDNo:11 (基因特异性上游引物)5，-GGATCCACAGAGGTGGGTCG-3，12 (基因特异性下游引物)5，-GCGCGGTCTACCACCTCTTCG-3'
权利要求
1、一种茶尺蠖乙醛脱氢酶基因adh，其特征是具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
2、 如权利要求l所述的基因adh编码的蛋白质，其特征是具有SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列。
3、 如权利要求l所述的基因adh的用途，其特征是用于评价昆虫的抗逆能 力和监测昆虫的饲养环境。
4、 如权利要求2所述的基因adh的用途，其特征是所述昆虫为茶尺蠖。
全文摘要
本发明公开了一种茶尺蠖乙醛脱氢酶基因adh，其具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本发明还公开了上述基因adh编码的蛋白质，其具有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列。本发明还公开了上述基因adh的用途用于评价昆虫的抗逆能力和监测昆虫的饲养环境。
文档编号C12N15/53GK101210250SQ20071016481
公开日2008年7月2日 申请日期2007年12月24日 优先权日2007年12月24日
发明者晨 林, 梁月荣, 董俊杰, 郑新强, 陆建良 申请人:浙江大学