一种复合微生物的发酵料及制作方法

文档序号:594203阅读:301来源:国知局

专利名称::一种复合微生物的发酵料及制作方法
技术领域
:本发明涉及一种复合微生物的发酵料及制作方法,采用益生菌共生配伍设计和多级复合发酵技术,每级发酵均有各自不同的目标产物,使产品中富含大量有益活菌、多糖、多肽、活性酶、有机酸、植物甾醇、三帖皂甙等活性代谢产物,更易被畜禽采食、消化、吸收,属于农业生物制品
技术领域

背景技术
:全价饲料也称全日粮配合词料。它是指含有动物一定时期生长所需的蛋白质、能量、微量元素、矿物质等成分,能全面满足饲喂对象的营养需要。这些饲料原料主要由植物原料和动物油脂组成,含有多种抗营养因子和大分子物质,不易被动物肠道黏膜及消化系统直接吸收。所以,如何充分吸收和利用全价饲料中各种主要的营养成分成为养殖业中首要解决的一个难题,关于这方面的研究起步很早,除开发新的饲料资源外,提高现有饲料资源的利用率也是解决问题最有效途径之一。目前消除抗营养因子和分解大分子营养物质的方法主要有以下几种1、物理法,如加热法、膨化法、机械加工法;2、化学法;3、生物技术法如酶制剂法、育种法、控制用量法,除酶制剂法外,其余方法的效果并不明显且某种程度上限制了饲料营养作用对饲养动物的生长,而由于酶制剂是专一性很强的催化剂,所以对原料众多的抗营养因子难以以某几种酶制剂添加来消除其作用,同时酶制剂作用需要严格的温度、ph等催化条件。通过在中国知识产权局专利检索网站查询,类似的公告的一项专利申请,申请号为03101357.0,题为"高效生物饲料",其主要内容为提供一高效的生物鸡词料,该词料中添加有微生物发酵词料、不饱和脂肪酸,以及人体必备金属离子的氨基酸螯合物。蛋鸡食用该词料后,对饲料中营养成分吸收更快,所产的鸡蛋较普通鸡蛋的营养成分含量有较大的提高。该技术中菌种没有经过任何选育与诱导,产酶效果和活菌总数很低,同时添加简单的氨基酸配方,没有任何化学或生物反应过程发生,其工艺过程简单,无法保证其"提高采食量和采食速度,大幅提升消化道内源酶的总活性,减少应激性腹泻"的使用效果。
发明内容本发明的目的是提供一种提高养殖动物采食量和伺料利用率,同时提高养殖动物免疫力的复合微生物的发酵料及制作方法。为实现以上目的,本发明的技术方案是提供一种复合微生物的发酵料,其特征在于,由以下重量百分比原料组成枯草芽孢杆菌20%_24%、干酪乳杆菌22%—27%、啤酒酵母菌30%—35%、沼泽红假单胞菌14%—28%。一种复合微生物发酵料的制备方法,其特征在于,生产菌种通过射线诱导和生产性能试验相结合,筛选产量高、产酶量大的生产菌种,生产工艺采用益生菌共生配伍设计和多级复合发酵技术,培养基中添加产酶诱导剂,在包装上采用单项生物透气阀,其制作程序和生产工艺为第一步发酵菌株选育a.传代培养采用农业部菌种保存中心提供的枯草芽孢杆菌菌株、干酪乳杆菌、啤酒酵母菌通过营养琼脂培养基传代培养,沼泽红假单胞菌(光合细菌)通过马铃薯培养基PDA培养基在18。C一22"光照条件下培养,选育生长速度快、菌落特征明显的菌种,在(TC一4t:温度下保存菌种;b.诱导选育将枯草芽孢杆菌菌株、干酪乳杆菌和啤酒酵母菌分别在紫外线的照射下进行诱导,将保存的菌种制作菌悬液,稀释至10—7,在30cm处用功率为15W的紫外灯,波长为250nm,处理18—20s,处理后的菌悬液在营养琼脂平板中温度为3(TC—34'C,倒置培养45小时一50小时,选出生长速度快的菌落进行摇瓶实验,观察菌种生长速度快,特征明显即活菌总数大于50亿/ml,干酪乳杆菌菌落直径大于3ml,啤酒酵母菌大于7ml,枯草芽孢杆菌大于5ml的菌株在(TC一4'C温度加以保存;c.性能试验将步骤b中三种菌种分别接种在液体营养琼脂培养基中培养,培养温度为3(TC—34。C,在转速为220转/分一250转/分的恒温摇床中进行恒温培养,24小时一28小时后取样,利用平板计数法进行菌落总数测定,菌落总数大于40亿/ml的菌种可用于生产制种;d.制作生产用菌种将筛选出的枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、啤酒酵母菌、分别转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中在35t:—4(rc温度下培养45小时一50小时,沼泽红假单胞菌接入装有马铃薯培养基PDA培养基的茄子瓶中,2(TC温度下培养5—9天,待茄子瓶表面菌苔布满,并白中带黄时即可取出,然后放入2—6'C的冰箱中保存;第二步复合菌种的液体高速培养a.按以下比例称取各菌种枯草芽孢杆菌20%—24%、干酪乳杆菌22%—27%、啤酒酵母菌30%—35%、沼泽红假单胞菌(光合细菌)14%—28%;b.干酪乳杆菌和啤酒酵母菌的液体培养将按步骤a的比例称取的干酪乳杆菌和啤酒酵母菌,用无菌生理盐水冲洗,制成复合菌种液,混合后在一起进行复合培养将混合菌苔按l:20的比例接种于12(TC—128'C、30—45min高温灭菌的液体培养基中,在发酵罐中搅拌25min—35min,其转速为200—220r/min,搅拌均匀后放入消毒后的塑料桶中静置5—7天,静置过程中每天测定Ph值并释,放产出的气体;发酵过程中抽样3次,显微镜下检测菌体生长情况和测定Ph值,当活菌总数达到40亿/ml浓度和Ph值达到3.0-4.5时停止发酵;c.枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌的液体培养将枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌菌苔用无菌生理盐水冲洗,制成复合菌种液,按l:20—25的比例接种于120。C一128。C、30min—45min高温灭菌的液体培养基中,发酵时通气量维持在l:1.0-1.2,发酵时间24—35小时;第三步菌种的固体复合发酵a.将步骤2复合培养的菌液混合后按1:20的比例接入12(TC—128。C、30min—45min高温灭菌的固体扩大培养基中,在培养基中添加O.08%—0.1%的二乙胺四乙酸作产酶诱导剂,搅拌30—45min至均匀,倒入消毒密封罐中密封发酵,温度32—35'C,时间8—10天;b、发酵过程中取样三次,测定水分和Ph值,发酵结束后取样,测定水分为35%-40%、Ph值为4.5—5.5;第四步添加氨基酸锌和铁a.根据发酵料的用途不同进行添加如果用于豆粕、玉米的发酵则添加氨基酸铁和氨基酸锌,具体做法是市场购买利用蛋白生物合成技术生产的氨基酸铁和氨基酸锌制品按l:l混合;b.将混合后的氨基酸锌和铁按2—3:100的比例添加到第三歩的发酵产品中,混合均匀;c.如果用于全价饲料则不添加;第五歩粉碎与包装将歩骤3发酵完全的产品混合均匀,装入带有单项透气阀的包装袋中,扎紧袋口,系好标识牌,转入成品库有序堆放;取样检测,主要参数水份35%—40%、活菌数S50亿/g、总蛋白量》19%,赖氨酸》1.2%;物理性状深黄色粉末状固体。所述的步骤2中乳酸菌和啤酒酵母菌的液体培养基组成及重量百分比为玉米衆3%—5%、糖蜜12%—15%、酵母膏O.2%-0.4%、硫酸镁O.2%—0.5%、硫酸铵0.5%-0.7%、磷酸氢二钠O.2%-0.5%、无菌水77.8。/。-83.9%。所述的歩骤2中枯草芽孢杆菌及沼泽红假单胞菌培养基组成及重量百分比可溶性淀粉2°/。一5%、豆粕粉O.6%—1.2%、玉米浆1%-6%、磷酸二氢钾O.2%-0.6%、草酸1.4%-1.8%、硫酸镁O.4%-1%、消泡剂O.5%-1%、.无菌水86%-93%。所述的步骤3中固体扩大培养基为无菌水再加清糠、豆粕粉、糖蜜、玉米粉、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、尿素、二乙胺四乙酸中的至少四种混合物组成,其重量百分配比为清糠12%—14%、麸皮30%—33%、大豆粉8%—11%、糖蜜8%一10%、玉米粉8%—10%、磷酸二氢钾O.5%—1%、氯化钾1%—1.5%、硫酸镁O.4%一0,7%、0.08%—0.1%的二乙胺四乙酸、无菌水18.7%—32.02%。本发明利用生物工程技术进行筛选优化多个菌种,在全价饲料中或饲料原料中添加,能将营养物质分解或转化为更易吸收的小分子物质,并消除普通全价饲料或饲料原料中的抗营养因子,使饲料营养养分更高,更易被畜禽采食、消化、吸收,采用创新的益生菌共生配伍设计和多级复合发酵技术,每级发酵均有各自不同的目标产物,使产品中富含大量有益活菌、多糖、多肽、活性酶、有机酸、植物甾醇、三帖皂甙等活性代谢产物。全价词料中各种营养成分齐全,但是主要营养成分为大分子物质,难以直接被动物消化道吸收利用。其中蛋白质原料中用量最大,功能最重要的豆类及其饼粕、高粱和某些块根块茎类中就存在蛋白酶抑制因子,可导致饲料中蛋白质的消化率下降,因其能和胰蛋白酶、胃蛋白酶和糜蛋白酶结合而生成无活性的复合物,降低这些酶的活性;可引起养殖动物体内蛋白质内源性消耗,抗营养因子不但影响了饲料的营养价值和适口性,能量饲料中纤维素含量占15%,其中纤维素、半纤维素和果腔质被木质素胶合在一起,木质素和硅酸盐组成细胞壁外壳,坚硬光滑。由于纤维素材料中的木质素和结晶性,使牲畜消化道内的细菌和酶不能分解和利用,另外,动物性油脂可提供脂肪来源,但是其分子结构复杂,养殖动物分解吸收困难,利用微生物发酵料在秸秆饲料中应用较广,主要是分解利用秸秆中的纤维素,降低养殖成本,但实际上饲料原料中营养成分最大和最重要的是蛋白质和动物性油脂,如何分解和利用这两种物质是一大难题,而本发明中的菌种即是针对这三种难分解的营养成分选取。本发明的技术路线是采用农业部658公告中允许添加的有益菌种,利用射线诱导技术筛选及改良菌种,使其产酶量和反应速度最大,同时多个菌种密切配合,协同作用,采用液体高速培养和固体扩大培养技术,发酵过程中产生并积累大量营养富的菌体,即乳酸杆菌、芽孢杆菌、酵母和有用的代谢产物,如抗生素、维生素、有机酸、激素及赖氨酸等,本发明技术兼有酶制剂法和发酵法的优点,能显著消除饲料原料中的抗营养因子作用,提高养殖动物采食量和饲料利用率,同时提高养殖动物的免疫力。本发明中的各个菌种在饲养原料分解及发酵中各自发挥独立的作用,同时相互配合,其中芽孢杆菌是一类耐高温、高压及低pH值的有益微生物,用作饲料添加剂不论是在颗粒还是在液体饲料中都较稳定。芽孢杆菌以孢子状态进入畜禽肠道生长繁殖,消耗肠内氧气,造成厌氧环境,使乳酸菌、双歧杆菌增加,大肠杆菌减少,本发明中采用的枯草芽孢杆菌还能在发酵过程中产生安全的内源性免疫物质——杆菌肽,杆菌肽是由地衣型芽孢杆菌产生的多肽类抗生素,对革蓝氏阳性菌有很强的抑制作用。杆菌肽锌饲料添加剂适用于各种畜禽,如牛、羊、猪、鸡、鸭等。具有明显的促进生长效果,提高饲料转化率及防治猪、鸡细菌性腹泻和慢性呼吸道疾病的功效。增加畜禽抗病能力,提高健康水平,促进生长,增加微量元素,提高饲料利用率。Kacmmerer等用的小公鸡做小规模热应激试验,认为在词料中添加颗粒包膜型杆菌肽锌,可消除持续高温应激因素所产生的负作用。Bronsch(1984)指出,杆菌肽锌可能是将能量用于增重、产蛋而使体内热的产生减少。Manner等(1989)在34'C高温条件下,在词料中添加100mg/kg颗粒包膜型杆菌肽锌,33周试验表明,试验组生产性能大大高于对照组,蛋鸡增重、日采食量、总蛋数和总蛋重分别提高66.2%、9.9%、15.3%和17%,明显地提高蛋壳强度。本发明中杆菌肽的产生是内源性产生,不同于外援性添加,具有成本低、活性高、无药物残留等优点。酵母菌是单细胞真核生物,具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点,被认为是表达外源蛋白的合适宿主,本复合菌种中采用的啤酒酵母具有生长速度快,产量高的特点,其中本身的蛋白含量达50%以上,在酵母菌的代谢产物中,含有激素、维生素、核酸等具有促进作物生长发育功能的生理活性物质。乳酸菌对人和动物都有保健和治疗功效,这一点,国内外均有大量饲养和临床试验证明。Baird(1977)用乳杆菌饲喂断奶仔猪和生长育肥猪,试验证明均能增加日增重和提高饲料转化率;Lidbeck等(1992)证实乳酸杆菌能预防放疗引起的腹泻。蔡辉益等(1993)对益生素使用效果进行统计,其中乳酸菌类益生素饲喂猪的报道,7例证明能提高日增重,平均提高7.67%,6例证明提高饲料转化率,平均提高5.4%,乳酸菌则以光合细菌产生的糖类为基质,分泌出乳酸,乳酸具有极强的杀菌力,并具有抑制有害微生物的活动和有机物急速腐败分解的功能。此外,乳酸菌还可以将木质素、纤维素等动物难于消化利用的有机物分解成小分子的动物易于吸收、利用的营养物质,提高了词料利用率。光合细菌是以光和热为能源,以乳酸等为基质,在厌氧条件下能进行光合作用的细菌总称。它具有促进糖类、氨基酸类、维生素以及生理活性物质生物合成的功能。并能分解空气中的有害气体,对污水有很强的净化能力。它和固氮菌、放线菌、乳酸菌等有益微生物之间有协同作用。另外,光合细菌本身的蛋白质含量高达60%以上。本发明的复合菌种在营养丰富的全价饲料发酵过程中还能产生大量的消化酶和活性代谢产物,如如植酸酶、淀粉酶、蛋白酶、、纤维素酶、脂肪酶等;这些酶可有效分解饲料原料中难以分解和被动物吸收的蛋白质、纤维素、动物性油脂。同时产生动物机体必需的营养成分,如赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、维生素等;这些物质在使用本发明产品后不再需要添加,大大降低了饲料及养殖成本。由于枯草杆菌是产芽孢菌,后期发酵液体呈碱性,而两种乳酸菌是典型的酸性培养细菌,直接复合培养有很大的难度,所以本发明产品采用了液体单独培养,再进行固体驯化复合培养的办法,既保证了菌种活菌数量,又将代谢产物的保留最大化,保证了产品的应用效果。同时在最终产品中添加载体,保证了菌种在运输和保存过程中的存活时间。本发明在酶制剂发酵过程中,加入某些诱导物、表面活性剂及其他一些产酶促进剂,可以大大增加菌体的产酶量。本发明通过试验,选用了一种表面活性剂二乙胺四乙酸,作为酶制剂的诱导剂,通过试验对比,可提供酶产量2—5%,促进剂能促进产量增加的原因主要是改进了细胞的渗透性,增强了氧的传递速度,改善了菌体对氧的有效利用。'产品发酵完成后,由于大量的有益活菌存在和活性代谢物质存在,所以不能采用常规的真空干燥包装,本产品采用了一种新型的单项生物透气阀,包装发酵产品的气体可以及时排出包装外,而外界含有杂菌的空间不能进入,这就保证产品处于最佳活性状态,在保质期内能发挥最大的功效。和现阶段的其他消除抗营养因子的方法相比,本发明的优点为1.菌种选育过程中采用诱导技术改良菌种,同时结合菌种生产性能测定,保证了各个菌种在培养基中高效的产酶量和生长速度;2.采用益生菌共生配伍设计和多级复合发酵技术,每级发酵均有各自不同的目标产物,同时在发酵过程中添加特殊的产物诱导剂,使产品中富含大量有益活菌和酶、肽、多糖及氨基酸等活性代谢产物;3.通过产生大量内源性活性酶、抗氧化剂和抗生素,改善饲料适口性,提高采食量,增强养殖动物的抗应激及免疫力,提高群体整齐度,并改善生长速度和词料利用率,降低养殖成本;4.包装采用独有的生物单项透气阀,保障产品内活菌和代谢产物保证产品处于最佳活性状态,在保质期内能发挥最大的功效;5.本发明产品既可添加在全价饲料中,又可发酵原料,发酵后可溶性蛋白含量提高12%以上,中性洗涤纤维下降15%以上,有益活菌总数大于50亿/ml;6.本发明的产品采用农业部658公告允许添加的微生物菌种,在养殖动物体内无有害残留,同时减少了抗生素在养殖中的使用量,是一种安全、绿色的微生物7te口/口口o具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步说明。实施例l一种复合微生物发酵料的制备方法为本发明采用菌种及编号为丄a"oZ)"c/〃^ca"/「ACCC10640)干酪乳杆菌、5^cc/wra附戸scereWw'ae(IFO0203)啤酒酵母菌、5scj77wsJ7c/e/7i/ior肌's(ACCC10619)枯草芽孢杆菌,/^0^^wz/^wo"^/7a/w^^(ACCC10649)沼泽红假单胞菌,所有菌种由农业部菌种保存中心提供。第一步发酵菌株选育a.传代培养采用农业部菌种保存中心提供的枯草芽孢杆菌菌株、干酪乳杆菌、啤酒酵母菌、沼泽红假单胞菌(光合细菌),通过营养琼脂培养基传代培养,沼泽红假单胞菌(光合细菌)通过PDA培养基在20'C光照条件下培养,选育生长速度快、菌落特征明显的菌种,在4'C温度下保存菌种;b.诱导选育将枯草芽孢杆菌菌株、干酪乳杆菌和啤酒酵母菌分别在紫外线的照射下进行诱导,将保存的菌种制作菌悬液,稀释至10—7,在30cm处用功率为15W的紫外灯,波长为250nm,处理18s,处理后的菌悬液在营养琼脂平板中温度为34i:,倒置培养45小时,选出生长速度快的菌落进行摇瓶实验,观察菌种生长速度快,特征明显(活菌总数大于50亿/ml,干酪乳杆菌菌落直径大于3ml,啤酒酵母菌大于7ml,枯草芽孢杆菌大于5ml)的菌株在4'C温度加以保存;C.性能试验将歩骤b中三种菌种分别接种在液体营养琼脂培养基中培养,培养温度为30。C,在转速为220转/分的恒温摇床中进行恒温培养,24小时一28小时后取样,利用平板计数法进行菌落总数测定,菌落总数大于40亿/ml的菌种可用于生产制种;d.制作生产用菌种将筛选出的枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、啤酒酵母菌、分别转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中在35r温度下培养45小时一50小时,沼泽红假单胞菌接入装有PDA培养基的茄子瓶中,2(TC温度下培养7天,待茄子瓶表面菌苔布满,并白中带黄时即可取出,然后放入2—6'C的冰箱中保存;营养琼脂培养基..牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15—20g、水1000ml、pH7.0-7.2,12rC灭菌20min;马铃薯培养基(PDA):马铃薯200g、蔗糖或葡萄糖20g、琼脂15—20g、水1000ml、pH自然;第二步复合菌种的液体高速培养a.按以下比例称取各菌种枯草芽孢4菌20%、干酪乳杆菌22%、啤酒酵母菌30%、沼泽红假单胞菌(光合细菌)28%。b.干酪乳杆菌和啤酒酵母菌的液体培养将按歩骤a的比例称取的干酪乳杆菌和啤酒酵母菌,用无菌生理盐水冲洗,制成复合菌种液,混合后在一起进行复合培养将混合菌苔按l:20的比例接种于12rC、30min高温灭菌的液体培养基中,在发酵罐中搅拌25min—35min,其转速为200r/min,搅拌均匀后放入消毒后的塑料桶中静置5—7天,静置过程中每天测定Ph值并释放产出的气体;发酵过程中抽样3次,显微镜下检测菌体生长情况和测定Ph值,当活菌总数达到40亿/ml浓度和Ph值达到3.0-4.5时停止发酵;乳酸菌和啤酒酵母菌的液体培养基组成及重量百分比为玉米浆3%、糖蜜12%、酵母膏O.2%、硫酸镁0.2%、硫酸铵0.5%、磷酸氢二钠0.2%、无菌水83.9%。c.枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌的液体培养将枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌菌苔用用无菌生理盐水冲洗,制成复合菌种液,按l:20—25的比例接种于121'C、30min高温灭菌的液体培养基中,发酵时通气量维持在l:1,发酵时间28小时;枯草芽孢杆菌及沼泽红假单胞菌培养基组成及重量百分比可溶性淀粉3%、豆粕粉l.2%、玉米浆4%、磷酸二氢钾0.4。/。、草酸1.6%、硫酸镁0.8%、消泡剂0.5%、.无菌水88.5%。第三歩菌种的固体复合发酵a.将步骤2复合培养的菌液混合后按1:20的比例接入12rC、30min高温灭菌的固体扩大培养基中,在培养基中添加O.08%的二乙胺四乙酸作产酶诱导剂,搅拌30—45min至均匀,倒入消毒密封罐中密封发酵,温度32。C,时间8天;b、发酵过程中取样三次,测定水分和Ph值,发酵结束后取样,测定水分为35%-40%、Ph值为4.5—5.5;固体扩大培养基重量百分配比为清糠12%、麸皮30%、大豆粉8%、糖蜜8%、玉米粉8%、磷酸二氢钾O.5%、氯化钾1%、硫酸镁O.4%、0.08%的二乙胺四乙酸、无菌水31.3%;第四步添加氨基酸锌和铁将市场购买利用蛋白生物合成技术生产的氨基酸铁和氨基酸锌制品按l:l混合,将混合后的氨基酸锌和铁按l;50的比例添加到第三步的发酵产品中,混合均匀;第五步粉碎与包装将步骤3发醛完全的产品混合均匀,装入带有单项透气阀的包装袋中,扎紧袋口,系好标识牌,转入成品库有序堆放;取样检测,主要参数水份35%—40%、活菌数》50亿/g、总蛋白量》19%,赖氨酸》1.2%;物理性状深黄色粉末状固体实施例2:第一步发酵菌株选育同实施例l第二步复合菌种的液体高速培养a.按以下比例称取各菌种枯草芽孢杆菌24%、干酪乳杆菌27%、啤酒酵母菌35%、沼泽红假单胞菌(光合细菌)14%。b.乳酸菌和啤酒酵母菌的液体培养将按步骤a的比例称取的干酪乳杆菌和啤酒酵母菌,用无菌生理盐水冲洗,制成复合菌种液,混合后在一起进行复合培养将混合菌苔按l:25的比例接种于125'C、45min高温灭菌的液体培养基中,在发酵罐中搅拌35min,其转速为220r/min,搅拌均匀后放入消毒后的塑料桶中静置5—7天,静置过程中每天测定Ph值并释放产出的气体;发酵过程中抽样3次,显微镜下检测菌体生长情况和测定Ph值,当活菌总数达到40亿/ml浓度和Ph值达到3.0-4.5时停止发酵;乳酸菌和啤酒酵母菌的液体培养基组成及重量百分比为玉米浆5%、糖蜜15%、酵母膏O.4%、硫酸镁O.5%、硫酸铵O.7%、磷酸氢二钠O.5%、无菌水77.9%。c.枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌的液,体培养将枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌菌苔用用无菌生理盐水冲洗,制成复合菌种液,按l:25的比例接种于125°C、45min高温灭菌的液体培养基中,发酵时通气量维持在l:1.0_1.2,发酵时间30小时;液体培养基重量比百分比同实施例l。第三步菌种的固体复合发酵a.将步骤2复合培养的菌液混合后按1:25的比例接入125'C、45min高温灭菌的固体扩大培养基中,在培养基中添加O.1%的二乙胺四乙酸作产酶诱导剂,搅拌45min至均匀,倒入消毒密封罐中密封发酵,温度335i:,时间8天;b、同实施例l。固体复合发酵的培养基组成及百分配比为清糠14%、麸皮33%、大豆粉ll%、糖蜜10%、玉米粉10%、磷酸二氢钾1%、氯化钾1.5%、硫酸镁O.7%、0.1%的二乙胺四乙酸、无菌水18.7%。第四步添加氨基酸锌和铁a.同实施例l。b、将混合后的氨基酸锌和铁按3:100的比例添加到第三歩的发酵产品中,混合均匀。c.同实施例l。第五歩粉碎与包装同实施例l。使用时按本制剂的10%与全价饲料或饲料原料的90%比例充分搅拌,均匀后即可饲喂。注意本品需存放于密封千燥处,避免与农药、强刺激物品等混合堆放,开封后三日内尽快使用,本产品在研发过程中经2006年9月上海市农科院畜牧研究所的对比试验表明,使用本产品后提高保育仔猪日增重9.30%,改善保育仔猪词料利用率7.54%,提高生长猪日增重23%,改善生长猪词料利用率3.66%。2007年3月在上海金山种猪养殖基地进行的应用试验数据为<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>以上数字表明,本专利技术产品的有关数据表明,本专利技术产品能明显降低多种抗营养因子对饲料营养的影响,显著提高词料利用率,提高动物的适口性和采食量,达到增产、增效,降低成本的养殖效果。权利要求1.一种复合微生物的发酵料,其特征在于,由以下重量百分比原料组成枯草芽孢杆菌20%-24%、干酪乳杆菌22%-27%、啤酒酵母菌30%-35%、沼泽红假单胞菌14%-28%。2.根据权利要求l所述的一种复合微生物发酵料的制备方法,其特征在于,生产菌种通过射线诱导和生产性能试验相结合,筛选产量高、产酶量大的生产菌种,生产工艺采用益生菌共生配伍设计和多级复合发酵技术,培养基中添加产酶诱导剂,在包装上采用单项生物透气阀,其制作程序和生产工艺为第一歩发酵菌株选育a.传代培养采用农业部菌种保存中心提供的枯草芽孢杆菌菌株、干酪乳杆菌、啤酒酵母菌通过营养琼脂培养基传代培养,沼泽红假单胞菌通过马铃薯培养基PDA培养基在18'C—22。C光照条件下培养,选育生长速度快、菌落特征明M的菌种,在(TC一4。C温度下保存菌种;b.诱导选育将枯草芽孢杆菌菌株、干酪乳杆菌和啤酒酵母菌分别在紫外线的照射下进行诱导,将保存的菌种制作菌悬液,稀释至10—7,在30cm处用功率为15W的紫外灯,波长为250nm,处理18—20s,处理后的菌悬液在营养琼脂平板中温度为3(TC—34°C,倒置培养45小时一50小时,选出生长速度快的菌落进行摇瓶实验,观察菌种生长速度快,特征明显即活菌总数大于50亿/ml,干酪乳杆菌菌落直径大于3ml,啤酒酵母菌大于7ml,枯草芽孢杆菌大于5ml的菌株在(TC一4'C温度加以保存;c.性能试验将步骤b中三种菌种分别接种在液体营养琼脂培养基中培养,培养温度为30。C一34。C,在转速为220转/分一250转/分的恒温摇床中进行恒温培养,24小时一28小时后取样,利用平板计数法进行菌落总数测定,菌落总数大于40亿/ml的菌种可用于生产制种;d.制作生产用菌种将筛选出的枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、啤酒酵母菌、分别转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中在35'C—4(TC温度下培养45小时一50小时,沼泽红假单胞菌接入装有马铃薯培养基PDA培养基的茄子瓶中,20'C温度下培养5—9天,待茄子瓶表面菌苔布满,并白中带黄时即可取出,然后放入2—6。C的冰箱中保存;第二歩复合菌种的液体高速培养a.按以下比例称取各菌种枯草芽孢杆菌20%—24%、千酪乳杆菌22%—27%、啤酒酵母菌30%—35%、沼泽红假单胞菌14%—28%;b.干酪乳杆菌和啤酒酵母菌的液体培养将按步骤a的比例称取的干酪乳杆菌和啤酒酵母菌,用无菌生理盐水冲洗,制成复合菌种液,混合后在一起进行复合培养将混合菌苔按l:20的比例接种于12(TC—128i:、30—45min高温灭菌的液体培养基中,在发酵罐中搅拌25min—35min,其转速为200—220r/min,搅拌均匀后放入消毒后的塑料桶中静置5—7天,静置过程中每天测定Ph值并释放产出的气体;发酵过程中抽样3次,显微镜下检测菌体生长情况和测定Ph值,当活菌总数达到40亿/ml浓度和Ph值达到3.0-4.5时停止发酵;c.枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌的^体培养将枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌菌苔用无菌生理盐水冲洗,制成复合菌种液,按l:20—25的比例接种于12(TC—128。C、30min—45min高温灭菌的液体培养基中,发酵时通气量维持在l:1.0-1.2,发酵时间24—35小时;第三歩菌种的固体复合发酵a.将步骤2复合培养的菌液混合后按1:20的比例接入12(TC—128。C、30min—45min高温灭菌的固体扩大培养基中,在培养基中添加O.08%—0.1%的二乙胺四乙酸作产酶诱导剂,搅拌30—45min至均匀,倒入消毒密封罐中密封发酵,温度32—35'C,时间8—IO天;b.发酵过程中取样三次,测定水分和Ph值,发酵结束后取样,测定水分为35%-40%、Ph值为4.5—5.5;第四步添加氨基酸锌和铁a.根据发酵料的用途不同进行添加如果用于豆粕、玉米的发酵则添加氨基酸铁和氨基酸锌,具体做法是市场购买利用蛋白生物合成技术生产的氨基酸铁和氨基酸锌制品按l:l混合;b.将混合后的氨基酸锌和铁按2—3:i00的比例添加到第三歩的发酵产品中,混合均匀;c.如果用于全价饲料则不添加;第五歩粉碎与包装将歩骤3发酵完全的产品混合均匀,装入带有单项透气阀的包装袋中,扎紧袋口,系好标识牌,转入成品库有序堆放;取样检测,主要参数水份35%—40%、活菌数》50亿/g、总蛋白量》19%,赖氨酸》1.2%;物理性状深黄色粉末状固体。3.根据权利要求2所述的一种复合微生物发酵料的制备方法,其特征在于,所述的步骤2中乳酸菌和啤酒酵母菌的液体培养基组成及重量百分比为玉米浆3%—5%、糖蜜12%—15%、酵母膏O.2%-0.4%、硫酸镁O.2%—0.5%、硫酸铵O.5%-0.7%、磷酸氢二钠O.2%-0.5%、无菌水77.8%-83.9%。4.根据权利要求2所述的一种复合微生物发酵料的制备方法,其特征在于,所述的步骤2中枯草芽孢杆菌及沼泽红假单胞菌培养基组成及重量百分比可溶性淀粉2%—5%、豆粕粉O.6%—1.2%、玉米浆1%-6%、磷酸二氢钾O.2%-0.6%、草酸1.4%-1.8%、硫酸镁O.4%-1%、消泡剂O.5%-1%、.无菌水86%-93%。5.根据权利要求2所述的一种复合微生物发酵料的制备方法,其特征在于,所述的歩骤3中的固体扩大培养基为无菌水再加清糠、豆粕粉、糖蜜、玉米粉、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、尿素、二乙胺四乙酸中的至少四种混合物组成,其重量百分配比为清糠12%—14%、麸皮30%—33%、大豆粉8%—11%、糖蜜8%—10%、玉米粉8%—10%、磷酸二氢钾O.5%—1%、氯化钾1%—1.5%、硫酸镁O.4%—0.7%、0.08%—0.1%的二乙胺四乙酸、无菌水18.7%一32.02%。全文摘要本发明涉及一种复合微生物发酵料,其特征在于,生产菌种通过射线诱导和生产性能检测结合,筛选生长速度快、产酶量大的生产菌种,生产工艺采用创新的益生菌共生配伍设计和多级复合发酵技术,产品中有益活菌数达到50亿/g,同时含有多糖、多肽、活性酶、有机酸、植物甾醇、三帖皂甙等活性代谢产物。培养基中添加特殊的产酶诱导剂,在包装上采用最新的单项生物透气阀,既可在畜禽全价饲料中添加,又可直接添加到饲料原料中,可有效促进大分子营养物质在畜禽肠道的分解和吸收,消除饲养原料中的抗营养因子作用,显著提高饲料利用率,降低饲养成本。文档编号C12N1/20GK101186896SQ20071017144公开日2008年5月28日申请日期2007年11月30日优先权日2007年11月30日发明者瀚江申请人:上海创博生态工程有限公司
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