专利名称：利用伪狂犬病毒gE基因制备主要抗原区蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，特别是一种利用伪狂犬病毒gE基因制备主要抗原 区蛋白的方法。
二背景技术：
伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的多种动物和野生动物的一种疾病，该 病对猪危害最大，给养猪业造成了巨大的经济损失。在欧美等发达国家，主 要采用基因缺失标志疫苗(Marker Vaccine)配合相应的血清学鉴别诊断方 法来根除此病，在我国猪伪狂犬病的根除计划尚未启动。在大多数已启动伪 狂犬病根除计划的国家中，主要采用针对gG, gE和gC这三种糖蛋白的鉴别 诊断方法，其中又以gE缺失的疫苗和gE-ELISA鉴别诊断的应用最为广泛。 但目前商业化应用的gE-ELISA试剂盒多采用细胞培养物来增殖病毒制备抗 原，这种方法的成本高，劳动强度大，还存在散毒的危险。而近年来报道了 用在杆状病毒系统中表达的gE蛋白作为抗原，大肠杆菌表达系统是人们应用 最多，研究最为透彻的外源蛋白表达系统，大肠杆菌(Escherichia coli) 表达系统的主要优点是其遗传背景和生化特性清楚、易于操作、生长迅速、 培养基成本低、易于制备等。因此对于一些非糖基化蛋白或只要求其抗原性 的蛋白，大肠杆菌表达系统是一个极好的选择。
三
发明内容
针对上述情况，本发明之目的就是提供一种利用伪狂犬病毒gE基因制备 主要抗原区蛋白的方法，有效解决主要抗原区蛋白的制备，用于防制伪狂犬 病毒对猪的危害问题，其解决的技术方案是，利用引物及伪狂犬病毒基因组 DNA合成gE基因，对gE基因进行克隆(扩殖)，经连接产物和平板得白色菌 落，再利用其菌落制得含有gE基因的质粒，再进行gE基因抗原区蛋白进行 合成得目的片段和载体片段混合，加入大肠杆菌进行克隆(扩殖)得含有gE 基因的阳性重组菌，再接种于培养液中培养得gE基因主要抗原区蛋白，该方 法先进，易操作，其产品使用效果好，成本低，无毒副作用，是猪病诊断防 治上的一大创造。
具体实施例方式
以下结合实际情况，对本发明的具体实施方式
作详细说明。 本发明在实施中，是由以下步骤实现的
1. 引物的设计与合成
PCR引物的设计根据报道的伪狂犬病毒MinA株gE基因的核苷酸序列， 利用DNAStar和Primer5. 0软件设计1对包含gE基因主要抗原表位区段(54 263位氨基酸)的引物，上游引物P1带有BamHI酶切位点，下游引物P2带 有HindIII酶切位点，上、下游引物之间所扩增片段包括gE基因主要抗原区 630个碱基，上、下游引物分别为-
上游引物Pl (24mer) 5' -AAGGATCCGACGATGACCTCAACG -3' 下游引物P2 (24mer) 5' -GCMGCTTCAGCGTGGCAGTMAG -3';
2. 伪狂犬病毒基因组DNA的提取
将MinA株伪狂犬病毒接种于PK-15细胞，待完全病变后，收集细胞悬 液，lOOOOr/min离心数秒，取沉淀液用适量细胞裂解液悬浮，加入蛋白酶K 至最终质量浓度为100mg/L，在5(TC作用3h，加入等体积的饱和酚，4°C， 10000r/min，离心15min，重复2次；再用等体积的氯仿抽提一次；取上清 液加入2. 5倍体积的无水乙醇，-20。C沉淀3h; 12000r/min离心10min;用 70%的乙醇洗涤沉淀，自然干燥后加入含有Rnase的高纯水溶解得DNA，备用；
3. gE基因主要抗原区的获取
将上述基因组DNA在沸水浴中变性煮沸lOmin，取变性的DNA作为模板， 反应体系为50uL，其中2XPCR缓冲液25uL， dNTPs 8uL， Pl、 P2(终浓 度为20pmo1/ P L)各为1 ii L， Taq酶0. 5U，扩增条件94"C预变性lmin; 94°C 预变性30s， 5(TC预变性30s, 72r预变性2min，如此30个循环，得gE基 因；
4. gE基因的纯化
用DNA快速回收试剂盒回收DNA，方法如下DNA片段经琼脂糖凝胶电泳 分离，于长波紫外灯下切取含有目的片段的琼脂糖凝胶，放入一无菌的1. 5 mL 的EP管中，加入3倍体积的溶胶液，于56'C水浴5-10min，其间轻弹EP管，使凝胶完全溶化，然后将溶化的液体转至收集管的UNIQ-10柱中，于室温静 置2min， 13000 r/min,离心lmin，倒掉收集管中的废液，用洗涤液洗两次， 最后簡0r/min离心2min，将回收柱转至一干净的1. 5 mL EP管中，加30 uL TE洗脱，于室温放置2 min， 13000r/min离心1 min，收集管中即为纯化的 gE基因的DNA，备用；
5.对gE基因进行克隆(扩殖)
将纯化的gE基因与pGEM-T Vector连接反应，方法是 由纯化的gE基因3uL与pGEM-T VectorlyL、 2XLigation Buffer 5uL、 LigaseluL混合16-C反应连接(过夜)16-18小时，得连接产物；
再对连接产物进行转化，方法是制备抗性平板，进行蓝/白斑筛选，在转 化前2-4h于LB平板上涂X-gal(20mg/mL)40 uL和IPTG (10 mg/mL)7uL，正 放于37'C温箱中，使X-gal和IPTG充分吸入琼脂中，然后按下列步骤进行
(1) 取10uL连接产物无菌条件下加入已放置12 24h的JM109感 受态细胞中，混匀后冰浴30min;
(2) 42'C水浴，热激90s，冰浴3min使冷却；
(3) 无菌加入800uL预热至37'C的LB培养液的瓶中，37°C、 150 210r/min振荡lh，复苏培养lh;
(4) 5000r/min离心5min，无菌弃部分上清液；
(5) 混匀剩余的培养液和细胞沉淀，均匀涂布于含氨苄青霉素 (100ug/mL)的LB琼脂平板上；
(6) 倒置平皿于37'C培养箱培养12 16h后，置平皿于4'C使蓝色充
分显现，挑白色菌落，备用； 6提取质粒pT630
碱裂解法小量提取质粒PT630方法如下
(1) 用无菌牙签从LB平板挑取白色单个菌落，接种于3mL含氨苄青霉 素LB(100ug/mL)培养液中，37。C剧烈振摇(240r/min) 12 16h，同时挑取蓝
菌落提质粒作对照；
(2) 无菌移取1.5mL菌液置Eppendorf管中，12000r/min离心lmin，
弃上清液；
(3) 每管加入lOOuL预冷的溶液I，用涡旋器振荡悬浮；
(4) 加入200UL新配制的溶液II，温和倒置3 4次混匀，然后冰浴 放置5min;
(5) 加入150uL预冷的溶液III，颠倒混和几次，冰浴放置5min;
(6) 12000r/min离心8min,将上清转移至另一 Eppendorf管中，加入 500 UL Tris饱和酚振荡抽提；
(7) 12000r/min离心5min，转移上层水相至一新管中，用体积比的酚 氯仿异戊醇=25:24:1振荡抽提；
(8) 12000r/min离心5min，上层水相加入2倍体积的无水乙醇，置—20°C 沉淀30min以上，12000r/min离心10min;
(9) 沉淀用冰冷的70%乙醇洗涤，离心除去残余乙醇，置室温自然干燥；
(10) 用30uL含RNA酶(20ug/mL)的TE液(pH8. 0)溶解得含有gE基 因的质粒PT630 (简称PT630)，备用；所说的溶液I为50 mmol/L葡萄糖、 25腿ol/L Tris-HCL(PH8.0)、 10 mmol/L EDTA(PH8. 0)制成；所说的溶液II 为0. 2 mmol/LNaOH、再加入溶液总量1%的SDS (十二垸基磺酸钠，使用时再 加入液体中，要新鲜配制)制成；所说的溶液III为5 mmol/L乙酸钾60ml、冰 乙酸11.5ml、水28. 5ml制成；所说的TE液为lmmol/L EDTA 、 10画1/L Tric-HCL(PH8. 0)制成；
7. gE基因抗原区蛋白的合成，方法是
取质粒pT630和pET-28a载体质粒各10 u L于1. 5mL Eppendorf管中， 加入10XPCR buffer 3uL， BSA 2uL ， BamHI1.5uL禾口 HindIII l.OuL， 灭菌水加至30pL置37。C水浴消化3h。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳重组质 粒和载体的酶切产物，切下所需的目的条带(片段)，用Agarose Gel DNA Extract Kit分别回收纯化目的片段和载体片段，备用；
8. 对目的片段与载体的连接转化，方法是，
取目的片段5uL、载体片段1.5pL混合后，加入10XLigation
buffer 2nL， T4 DNA连接酶iuL(3U/uL)，灭菌水补至10uL，混匀后 置16'C连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行克隆(扩殖)， 得含有gE基因的阳性重组菌；
9.将阳性重组菌10uL接种至3mL 2XYT培养液(含100wg/mL Amp) 中37。C振摇(过夜)16-18h，取培养物200uL接种于20mL 2XYT培养液 中，剧烈振摇至ODeoo为0.6 1.0时，加入IPTG(乙丙基硫代半乳糖苷)至 浓度为0.8mmol/L， 37'C诱导表达，获得gE基因主要抗原区蛋白(即gE630 抗原蛋白)。
本发明方法制备的主要抗原区蛋白，经测试和实际应用，均达到了突出 的技术效果，其有关情况如下 a.双酶切鉴定
在0.5mL管中加入10X限制性内切酶缓冲液(bufferK)2uL， BSA (牛 血清白蛋白)2uL，Hindin酶1 u L, BamH I酶1 u L ，主要抗原区蛋白(质 粒)DNA 10uL，灭菌水补至20uL，离心混合均匀，置37。C水浴消化2h; 单酶切鉴定按BamHl和Hind内切酶说明书进行。电泳前加入2uL6X上 样buffer, 0.8%琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。将PCR扩增、酶切鉴定均 为阳性的重组菌液培养后，进行测序(一般由专业公司进行，如送宝生物大 连有限公司测序)，阳性重组质粒命名为pT630。
b.SDS-PAGE电泳
(1)洗净玻璃板，固定在电泳槽上，用2.0%琼脂糖封边。按分子克隆的 配方配制12%的分离胶15mL，迅速注入两玻璃板之间，胶顶覆盖lmL双蒸水。 待分离胶凝固后倾出覆盖层液体，用去离子水冲洗凝胶顶部数次，倒置控干 液体，加入6mL5y。的积层胶溶液，插上梳子，垂直放置电泳槽使其凝固。小 心移去梳子，在电泳装置上、下槽间加入Tris-甘氨酸缓冲液，用注射器冲 洗加样孔数次，将电源负极与上槽相连。收集的菌液12000r/min离心 lmin，用45uL超纯水悬浮，加入15uL的5XSDS上样buffer,混匀， 水浴煮沸5min，用微量进样器上样20uL，打开电源，用80V电压电泳至 溴酚蓝进入分离胶，把电压提高到120V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。 染色取下凝胶用蒸馏水冲洗，用凝胶5倍体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝
胶，放在平缓摇动的平台上室温染色3h。
脱色脱色液浸泡凝胶，在脱色摇床上过夜(16-18小时)，其间更换染色液
3 4次。待蓝色背景完全脱净后，将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色，进行 Western-blotting分析，
(2) 转印剪8块滤纸与1块硝酸纤维素膜(NC)，大小与凝胶相等，在 转移缓冲液中浸泡5min，在正极板上按4层滤纸、NC膜、凝胶、4层滤纸的 顺序叠放整齐，确定无气泡后盖上负极板，按胶体积0. 65mA/cm2转移2h。
(3) 封闭转移完成后，取下NC膜，切下标准分子量Marker,置氨基 酸染色液中浸染20min，取出后漂洗脱色，直至背景蓝色脱尽。其余NC膜 用PBS冲洗，加入10ml封闭液，室温轻轻振摇1-2h。
(4) 与抗体的结合封闭结束后，用PBS冲洗NC膜4 5次，加入PBST 按照1 : 1000倍稀释的伪狂犬阳性血清10mL， 37。C结合3 h，用PBST冲 洗4 5次，每次在摇床缓慢摇动。加入1 : 500倍稀释的兔抗猪IgG(二抗)， 室温下轻摇孵育lh,取出用PBST冲洗3 4次，每次10min。
(5)底物显色将NC膜转移到10mL底物溶液中，室温避光轻摇3min观 察显色情况，等出现明显条带时，立即转入PBST缓冲液中终止显色，室温保存。
c. gE蛋白的复性
利用分光光度计测定变性溶解的重组gE630蛋白浓度，分别在gE630变 性液中加入相应体积的稀释液，调整其蛋白终浓度在100mg/L以下，并使溶 液中尿素浓度保持在lmol/L。然后加入GSH和GSSG，使其终浓度分别达到 0.9咖ol/L和O. lmmol/L， 4。C放置20h以上对gE630蛋白进行复性。复性 后用缓冲液透析48h，每隔6h换液1次。透析完全后溶液中应不含尿素， 再用PEG20 000浓縮透析液。将复性后的蛋白过滤除菌，小量分装冻存于一 20。C。
d. gE复性蛋白浓度、纯度的测定
复性gE630蛋白经浓縮后，经紫外分光光度计测定样品在A260nm和 A280nm波长的光吸收值，按照公式计算样品中蛋白质浓度蛋白质浓度
(mg/mL) = (1.45X A280 —0.74 X A260) X稀释倍数。蛋白质纯度测定用 SDS-PAGE电泳检测纯化的蛋白，用薄层扫描仪扫描分析目的蛋白的纯度， e.间接elisa试验最佳条件选择。
抗原包被和待检血清最佳稀释倍数的测定以pH9.6的碳酸盐缓冲液将 抗原1:40倍比稀释至1:1280， 4'C24h包被；然后用含0. 05%吐温20的 0. 05moL/L PBS(简称PBST， PH为7. 4)洗5minX3次，加入含1%牛血清白蛋白 (BSA)的PBST, 200uL/孔，37。C封闭2h;PBST洗5minX3次，将阳性血清分别1: 40倍比稀释至1: 1280， 100uL/孔，37。C作用lh进行方阵试验；再用PBST洗 5minX3次，每孔加1: 2000稀释的酶标抗体100uL/孔，37。C作用lh;PBST洗 5min X 3次，加入OPD底物溶液100uL/孔，避光显色1-5min;用2M的H2S04 50uL/ 孔进行终止后,用酶标仪0D490读数，每个稀释度重复一次，取其平均值。
抗原包被时间的选择用重组蛋白gE630以其最佳抗原包被浓度条件下 包被ELISA反应板，将血清及其酶标二抗都作最佳稀释倍数，包被时间分别 为4。C过夜(16-18小时)、37°C lh加4。C过夜(16-18小时)、37°C 2h加 4 。C过夜(16-18小时)，阳性血清按1 : 40确定稀释倍数，进行ELISA测定， 其它步骤前。
酶标抗体工作浓度的选择:抗原和待检血清按最佳工作浓度稀释，将酶
标抗体分i: 2000， i: 3000， i: 4000， i: 5000， 4个稀释度进行elisa试
验，100uL/孔，其它步骤同前。
血清不同作用时间的选择将标准阳性、阴性血清按最适稀释度稀释， 分别作用30、 60、 90和120min,按间接ELISA程序测定。
酶标抗体不同作用时间试验将标准阳性、阴性血清作l: 80稀释，酶标 抗体作1: 3000稀释，分别作用30、 60、 90和120min，按间接elisa程序测 定。
间接ELISA方法阴阳性临界值的确定
随机取实验室保存的的猪血清(已知为PrV抗体阴性)20份进行间接 elisa检测。每份血清做最佳稀释倍数后，100uL/孔。按照已经确立的elisa 程序进行测定，读出0D490值。每份样品重复两孔，结果取其平均值，进行
样本0D值平均值(X)、标准方差(SD)的计算。根据统计学原则，样本的0D490 值〉阴性样本0D均值(X)+3XSD时，可以在99.9%的水平上判为阳性。 f.血清中抗E. coli成分的除去 受体菌按诱导表达的方法进行培养，但不加IPTG诱导，然后按包涵体提 取的方法离心细菌,弃去上清，用蒸馏水洗两次，再用1/10原培养体积的TE (10. 0mmol/L Tris.HCl (pH 8. 0) ， 1. 0mmol/L EDTA)缓冲液重悬细菌沉淀。 置于冰浴中超声波裂解细菌(80W，作用3s，间隔9S， 99次)，此时，溶液 由粘稠变为清亮。4°C， 12000r/min离心10分钟，收集上清备用(简称E. coli 上清)，用E. coli上清吸附血清中抗E. coli抗体。
g. 特异性试验
交叉反应性按上述ELISA操作步骤，用猪瘟病毒、猪细小病毒、乙脑 病毒、猪繁殖呼吸障碍综合症的阳性血清，以及伪狂犬阳性血清、阴性血清 各1份作对照进行交叉试验。
h. 阻断试验
将阳性血清按最佳稀释度进行稀释，加入等体积最适稀释度重组抗原， 于37'C作用60min，将上述混合液加入已包被抗原的酶标板，测其0D值。 同时设立对照组，比较结果。计算(N-P)/N值，若此值大于0.5，则判为阻 断阳性。(N-P)/^(未阻断孔0D值-阻断孔0D值)/(未阻断孔0D值)
i. 敏感性试验
将阳性血清做i: 80, i: 160， i: 320， i: 640， i : 1280， i : 2560，
1:5120 7个稀释度，其余条件按最佳反应条件进行ELISA。 j.间接ELISA重复性试验
批内重复试验:取10份不同0D值的血清样品，使用同批次的包被、封闭 的酶标板，用间接ELISA方法进行3次检测，计算批内变异系数，以检验其重 复性。
不同批次酶标板检测相同样品的重复性试验用3块不同批次的酶标板 同时检测30份不同的血清样品，按优化的间接ELISA方法进行检测，观察0D 值变化情况。
本发明经临床应用取得了满意的效果，其临床诊断应用的方法是将本 发明主要抗原区蛋白和空白载体抗原用0. 05mol/L碳酸盐缓冲液(PH9. 5)稀 释至最佳浓度后隔列包被96孔酶标板，100 u L/孔，37t放置lh后转移至4 "C过夜。甩去包被液，用PBST洗板3次，每次2-3min。然后加入200 yL/ 孔的封闭液于37'C封闭2h。取出洗板同上，用封闭液将血清样品稀释至最佳 稀释度后，每孔加100uL，每份血清样品设两个重复，37。C反应45min后。 取出洗板同上，再加入免抗猪酶标二抗，100uL/孔，37。C反应45min后，取 出洗板同上，然后加入底物溶液，避光反应3-5min后加2mol/LH2S04终止反 应，立即于ELISA仪上读出490nm处每孔吸光度值，同时设定阳性对照孔、 阴性对照孔和调零孔(调零孔同样包被抗原，不加血清和二抗，但加底物和 终止液)，以此作为包被抗原建立间接ELISA方法检测猪伪狂犬抗体，用包被 的主要抗原区蛋白经对来自河南不同地区的50个猪场的3000份血清样本进 行伪狂犬抗体检测，结果阳性率为72. 5%;阴性率为27. 5%，准确率为96. 3%。 本发明的研制成功开创了猪伪狂犬病病毒gE-ELISA诊断的新技术，是防 治伪狂犬病病毒对猪进行毒害的一大创新，具有巨大的经济和社会效
权利要求
1、一种利用伪狂犬病毒gE基因制备主要抗原区蛋白的方法，其特征在于，由以下步骤实现一、引物的设计与合成PCR引物的设计根据伪狂犬病毒MinA株gE基因的核苷酸序列，利用DNAStar和Primer5.0软件设计1对包含gE基因主要抗原表位区段的引物，上游引物(P1)带有BamHI酶切位点，下游引物(P2)带有HindIII酶切位点，上、下游引物之间所扩增片段包括gE基因主要抗原区630个碱基；二、伪狂犬病毒基因组DNA的提取将MinA株伪狂犬病毒接种于PK-15细胞，待完全病变后，收集细胞悬液，10000r/min离心数秒，取沉淀液用适量细胞裂解液悬浮，加入蛋白酶K至最终质量浓度为100mg/L，在50℃作用3h，加入等体积的饱和酚，4℃，10000r/min，离心15min，重复2次；再用等体积的氯仿抽提一次，取上清液加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀3h；12000r/min离心10min；用70％的乙醇洗涤沉淀，自然干燥后加入含有Rnase的高纯水溶解得DNA，备用；三、gE基因主要抗原区的获取将上述基因组DNA在沸水浴中变性煮沸10min，取变性的DNA作为模板，反应体系为50μL，其中2×PCR缓冲液25μL，dNTPs 8μL，上游引物、下游引物浓度为20pmol/μL，各为1μL，Taq酶0.5U，94℃预变性1min；94℃预变性30s，50℃预变性30s，72℃预变性2min，如此30个循环，得gE基因；四、gE基因的纯化用DNA快速回收试剂盒回收DNA，DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离，于长波紫外灯下切取含有目的片段的琼脂糖凝胶，放入一无菌的1.5mL的EP管中，加入3倍体积的溶胶液，于56℃水浴5-10min，其间轻弹EP管，使凝胶完全溶化。然后将溶化的液体转至收集管的UNIQ-10柱中，于室温静置2min，13000r/min，离心1min，倒掉收集管中的废液，用洗涤液洗两次，最后13000r/min离心2min，将回收柱转至一干净的1.5mL EP管中，加30uL TE洗脱，于室温放置2min，13000r/min离心1min，收集管中，即为纯化gE基因的DNA，备用；五、对gE基因进行克隆将纯化的gE基因3μL与pGEM-T Vector1μL、2×Ligation Buffer5μL和Ligase1μL混合16℃反应16-18小时，得连接产物；再对连接产物进行转化，在转化前2-4h于LB平板上涂X-gal，浓度为40uL 20mg/mL，和IPTG浓度为7uL 10mg/mL，正放于37℃温箱中，使X-gal和IPTG充分吸入琼脂中，然后按下列步骤进行(1)取10μL连接产物无菌条件下加入已放置12～24h的JM109感受态细胞中，混匀后冰浴30min；(2)42℃水浴，热激90s，冰浴3min使冷却；(3)无菌加入800μL预热至37℃的LB培养液的瓶中，37℃、150～210r/min振荡1h，复苏培养1h；(4)5000r/min离心5min，无菌弃部分上清液；(5)混匀剩余的培养液和细胞沉淀，均匀涂布于含氨苄青霉素浓度为100μg/mL的LB琼脂平板上；(6)倒置平皿于37℃培养箱培养12～16h后，置平皿于4℃使蓝色充分显现，挑白色菌落，备用；六、提取质粒pT630(1)用无菌牙签从LB平板挑取白色单个菌落，接种于3mL含氨苄青霉素LB培养液中100μg/mL，37℃240r/min振动12～16h，同时挑取蓝菌落提质粒作对照；(2)无菌移取1.5mL菌液置Eppendorf管中，12000r/min离心1min，弃上清液；(3)每管加入100μL预冷的溶液I，用涡旋器振荡悬浮；(4)加入200μL新配制的溶液II，温和倒置3～4次混匀，然后冰浴放置5min；(5)加入150μL预冷的溶液III，颠倒混和几次，冰浴放置5min；(6)12000r/min离心8min，将上清转移至另一Eppendorf管中，加入500μL Tris饱和酚振荡抽提；(7)12000r/min离心5min，转移上层水相至一新管中，用体积比的酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1振荡抽提；(8)12000r/min离心5min，上层水相加入2倍体积的无水乙醇，置-20℃沉淀30min以上，12000r/min离心10min；(9)沉淀用冰冷的70％乙醇洗涤，离心除去残余乙醇，置室温自然干燥；(10)用30μL含RNA酶浓度为20μg/mL的TE液pH8.0，溶解得含有gE基因的质粒PT630，备用；所说的溶液I为50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-HCL(PH8.0)、10mmol/L EDTA(PH8.0)制成；所说的溶液II为0.2mmol/LNaOH、1％SDS(新鲜配制)制成；所说的溶液III为5mmol/L乙酸钾60ml、冰乙酸11.5ml、水28.5ml制成；所说的TE液为1mmol/L EDTA、10mmol/L Tric-HCL(PH8.0)制成；七、gE基因抗原区蛋白的合成取质粒pT630和pET-28a载体质粒各10μL于1.5mL Eppendorf管中，加入10×PCR buffer 3μL，BSA 2μL，BamHI1.5μL和HindIII 1.0μL，灭菌水加至30μL置37℃水浴消化3h，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳重组质粒和载体的酶切产物，切下所需的目的条带，用Agarose Gel DNA ExtractKit分别回收纯化目的片段和载体片段，备用；八、对目的片段与载体的连接转化取目的片段5μL、载体片段1.5μL混合后，加入10×Ligationbuffer 2μL，T4 DNA连接酶1μL浓度为3U/μL，灭菌水补至10μL，混匀后置16℃连接过夜，将连接产物转化至大肠杆菌BL2中进行克隆，得含有gE基因的阳性重组菌；九、将阳性重组菌10μL接种至3mL 2×YT培养液中浓度为100μg/mL Amp，37℃振摇16-18小时，取培养物200μL接种于20mL 2×YT培养液中，剧烈振摇至OD600为0.6～1.0时，加入IPTG至终浓度0.8mmol/L，37℃诱导表达，获得gE基因主要抗原区蛋白。
全文摘要
本发明涉及利用伪狂犬病毒gE基因制备主要抗原区蛋白的方法，有效解决主要抗原区蛋白的制备，用于防止伪狂犬病毒对猪的危害问题，其解决的技术方案是，利用引物及伪狂犬病毒基因组DNA合成gE基因，对gE基因进行克隆，经连接产物和平板得白色菌落，再利用其菌落制得含有gE基因的质粒，再进行gE基因抗原区蛋白进行合成得目的片段和载体片段，混合，加入大肠杆菌进行克隆得含有gE基因的阳性重组菌，再接种于培养液中培养得gE基因主要抗原区蛋白，该方法先进，易操作，其产品使用效果好，成本低，无毒副作用，是猪病诊断防治上的一大创造。
文档编号C12N15/09GK101186914SQ20071019306
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月6日 优先权日2007年12月6日 公开号200710193064.8
发明者吴凤笋, 唐桂芬, 李文刚, 樊淑华 申请人:郑州牧业工程高等专科学校 被以下专利引用 (1),