专利名称：甘蔗花叶病和宿根矮化病病原的多重pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种甘蔗病害的检测方法，主要是针对甘蔗花叶病病 毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)禾口甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease, RSD )病原细菌木质部赖氏杆菌木质部亚种 "ei/^ /72'a subsp. iy厶'，Lxx)的同时检测方法。
背景技术：
甘蔗花叶病(Sugarcane mosaic virus, SCMV)和甘蔗宿根矮化 病(Ratoon Stunting Disease, RSD)是两种世界范围内广泛发生的 主要病害，它们在我国各蔗区也相当普遍和严重，所有的甘蔗栽培品 种都受到不同程度的危害。
甘蔗花叶病由甘蔗花叶病毒引起，甘蔗花叶病毒是正单链RNA病 毒，是马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属的重要成员之一，病毒株系繁 多，变异较大。它主要危害甘蔗叶片，染病植株细胞内的叶绿体颗粒 的发育受病毒抑制，在数目及体积上均逊于正常细胞，使叶组织发生 透绿现象，尤以新叶基部症状最为明显，症状一般是黄绿相间不规则 的嵌纹、条斑或斑驳。病斑长短大小不一，布满叶片，感病植株叶片 黄化，植株矮化、分蘖减少。部分品种在夏季高温时症状会消失，即 所谓"隐症"现象。宿根病蔗发芽缓慢，生长不良，还会表现出茎溃 疡即茎外皮发生水渍状条纹或斑块，外皮下组织先变紫红色，终致
坏死而皱縮，由于坏死组织和健康组织生长不平衡，致茎外皮被推挤 而破裂，形成所谓茎溃疡，感病株节间縮短。据调査，华南各地尤其
是广西旱地甘蔗花叶病的发病率达到30%以上，产量损失3%-50% 。 甘蔗宿根矮化病症状较隐蔽，易与干旱造成的损害症状相混，感 病植株节间短縮、品质劣变，蔗汁中还原糖增加，蔗糖的结晶率降低。 甘蔗宿根矮化病蔗株平均感染率50%左右，宿根年限愈长发病率愈 高。该病通常造成甘蔗减产12% 37%，在干旱的情况下减产高达 60%，蔗糖分降低0.5% (绝对值)，宿根性减弱，即使是无病无毒 的健康种苗在生产上使用5年后也是100%感染宿根矮化病。
防止这两种病害的发生和蔓延对甘蔗产业的稳健发展十分重要。 SCMV初期外观症状不明显，而RSD则无特异的外观症状，这给诊断 这两种病害带来了困难。随着甘蔗健康种苗在甘蔗生产上的运用，迫 切需要建立能稳定、准确、灵敏并能同时检测出这两种病原的检测方 法，它可为甘蔗健康种苗的生产和应用、健康甘蔗种质资源交换、品 种调运等提供有效的监控手段。
目前对SCMV的检测方法有蔗株直观测定、生物测定、电镜诊 断、血清学测定、核酸分子杂交、多聚酶链式反应(PCR)等检测方 法，其中PCR是一种较为灵敏准确的检测方法。甘蔗RSD诊断技术经 历了从内部症状观察(剖茎检视)、相差显微镜检查、免疫技术和PCR 快速检测等4个阶段。由于特异性不明显，剖茎检视只能作为检测感 染RSD的辅助标志；而如果含菌量低则用相差显微镜也不能检出；免 疫技术检测则存在对Lxx数量密度要求较高(要求含菌量达103
107Cells/ml以上)和假阴性或假阳性过高的问题；PCR技术能检测 到含1-10个菌体的RSD，是较灵敏准确的检测方法。目前对甘蔗进 行这两种病害的检测需要分两步PCR进行提取甘蔗总RNA再通过 RT-PCR方法检测SCMV;提取甘蔗的总DNA，再通过PCR方法检测RSD。 这样检测较为烦琐，检测成本也很高。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘蔗花叶病和宿根矮化病病原的多重 PCR检测方法，它是在SCMV RT-PCR和RSD单一 PCR检测体系的基础 上，建立能同时检测这两种病原的一步法多重PCR检测方法。
本发明是集中一步法RT-PCR和多重PCR的优势，在已有RSD单 一 PCR检测体系的基础上，根据SCMV的中国大陆优势株系SCMV-A及 其它四个株系SCMV-B、 D、 E、 SC的保守序列区设计反转录引物和PCR 检测引物对，建立并优化了一步法多重RT-PCR反应体系和反应程序， 加快了诊断速度又节约了检测费用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案根据甘蔗花叶病毒 和甘蔗宿根矮化病病原细菌在甘蔗植株内的分布特点，确定取甘蔗植 株茎基部带鞘叶片为检测样品，这保证了能无遗漏的同时检测出在待 检材料中可能存在的两种病原；根据公知的甘蔗花叶病病毒中国大陆 优势株系SCMV-A及其它四个株系SCMV-B、 D、 E、 SC的基因保守序列 区设计反转录引物和PCR检测引物对，确保能检测出中国大陆和台湾 省导致甘蔗花叶病的甘蔗花叶病病毒；结合已有的检测甘蔗宿根矮化 病病原细菌引物对，对甘蔗花叶病毒和甘蔗宿根矮化病病原的基因片
段进行扩增；利用总核酸提取方法提取总核酸，并用RT-PCR反转录 试剂盒将其中的RNA反转录成cDNA;设计该一步法多重RT-PCR的反 应体系和扩增程序，将核酸进行扩增，利用凝胶电泳分析扩增结果及 特异性，同时利用十倍递进稀释法检测该一步法多重RT-PCR的敏感 度。
本发明与现有技术相比所具有的优点和积极效果 目前对甘蔗进行这两种病害检测需要分两步PCR进行(1)提 取甘蔗总RNA再通过RT-PCR方法检测SCMV; (2)提取甘蔗的总DNA， 再通过PCR方法检测RSD。这样检测较为烦琐，检测成本也很高。而 本发明所设计的甘蔗花叶病和宿根矮化病病原的多重PCR检测方法 集中一步法RT-PCR和多重PCR的优势，只需提取甘蔗的总核酸，在 同 一个PCR管中完成反转录后通过一次PCR反应就可以同时检测出这 两种病害的病原，具有操作简单、节省时间、成本低，同时还具有较 高的特异性和敏感性等优点。利用该检测方法能特异扩增出甘蔗花叶 病毒和宿根矮化病病原的基因片段且最低能检测到10—5ug的总核酸 模板，可用于SCMV和RSD的同时早期诊断和田间病原调查研究，可 为甘蔗健康种苗的生产和应用、健康甘蔗种质资源交换、品种调运等 提供有效的监控手段，对防止这两种病害的发生和蔓延及甘蔗产业的 稳健发展都具有十分重要的意义，还对甘蔗其它病原的检测也具有一 定的参考价值。
具体实施方式
下面对本发明作进一步详细说明。本发明所设计的甘蔗花叶病和宿根矮化病病原的多重PCR检测
方法包括下列步骤
1、 在甘蔗植株上确定最佳检测取样部位
由于SCMV和Lxx在甘蔗植株内各自的分布特点，为了保证在待
检材料中能无遗漏的检测出是否存在两种病原，应以待检测甘蔗植株 茎基部带鞘叶片作为提取总核酸的材料。
2、 根据公知的甘蔗花叶病毒中国大陆优势株系SCMV-A及其它四 个株系SCMV-B、 D、 E、 SC (在GenBank数据库中的序列号分别为U7354、 U57355、 1157356、 U57357、 D00948)的核酸保守序列区设计反转录引 物(5， -CCTTCATCTGCATG-3，)和PCR检测引物对cpcl， cpc2; RSD 引物对为F1， F2;用于扩增检测甘蔗花叶病病毒的基因片段大小为 400bp，上游引物cpcl为5， -GAGTTTGATAGGTGGTATGAAGCC-3，，下游 引物cpc2为5' -CCTTCATCTGCATGTGGGC-3，；用于扩增Lxx的基因片段 的引物为已有引物上游引物F1为5， -CTGGCACCCTGTGTTGTTTTC-3，， 下游引物F2为5， -TTCGGTTCTCATCTCAGCGTC-3'，扩增的Lxx基因片段 大小为265bp;
3、 总核酸的提取及cDNA的合成
利用RNAplant试剂盒提取甘蔗总核酸取约0. lg感病样品， 液氮研磨至粉末后加入0. 5ml 4"C的提取试剂，振荡至彻底混匀，室 温放置5 min后于4°C 12000rpm离心10 min，将上清转入新的无Rnase 的离心管后加入0. lml 5MNaCl，温和混均再加入0. lml氯仿，上下 颠倒数次混匀，然后4°C12000rpm离心10 min，取上层水相转入新
的无Rnase离心管后再加入等体积的异丙醇，混匀，温室放置10 min， 4。C12000rpm离心10 min，弃上清，力n lml 75%乙醇，4。C5000卬m 离心3 min，弃上清，短暂离心然后用枪头吸出液体，室温晾干2-3 min，加50 ul无Rnase水溶解(力口 2 ul RNasin Inhibitor),于-70 'C保存。
利用RNA反转录试剂盒进行cDNA的合成在PCR管中，加入如 下样品提取的总核酸样品4ul、 Nuclease-free Water 10ul、 SCMV 反转录引物lul、 7CTC热激5min后置冰浴上冷却2min、在管中继续 力口入Nuclease-free Water 1.5ul、 5XRT Reaction Buffer 5ul、 dNTP Mixter 1.25ul、 RNasin 1.25ul、 M-MLV RTlul、将反应管42 'C保温60 min、终止反应，反应液就是PCR反应中的cDNA模板。
4、 一步法多重RT-PCR的扩增
建立一步法多重RT-PCR:通过不同反应条件PCR扩增效果的比 较，该一步法多重RT-PCR反应体系设计为以"5 + 20"反应模式 即反转录物5ul+PCR反应试剂20ul,在同一个PCR管内进行反转录 和多重PCR。反转录反应体系是5XRT Reaction Buffer lul，反 转录引物(RT) 0. 5ul， dNTPs 0. 5ul,总核酸提取物lul， RNAsafe 0. 25ul， M—MLV Reverse Transcriptase 0. 25ul， Nuclease-free Water 5ul。反应结束后立即在同一 PCR管中加入20ul PCR反应试剂 Nuclease-free Water 12. 35ul 、 10 X PCR Buffer 2. 5ul ， dNTP Mixter 2ul， RSD上下游引物各lul, SCMV上下游引物各0.5ul, Taq靈 聚合酶0. 15ul。 PCR扩增程序为94。C预变性5min; 94。C变性20s，
53。C退火30s， 72°C 45s，循环30次；最后72。C延伸5min。
5、 琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果
用TAE电泳缓冲液配制1 %琼脂糖凝胶，在TAE电泳槽中进行水 平电泳，加10ulPCR扩增产物，以健康甘蔗总核酸的反转录物为模 板的PCR产物为阴性对照，以DL2000 Marker为标准分子量， 100v/85mA电泳40分钟，用凝胶成像系统拍摄电泳结果，若在265bp 处出现扩增条带说明RSD为阳性，若在400bp处出现扩增条带说明 SCMV为阳性，若在265bp和400bp均出现扩增条带说明RSD和SCMV 均为阳性，无扩增条带说明RSD和SCMV均为阴性。
6、 一步法多重RT-PCR特异性及敏感性检测
一步法多重RT-PCR敏感性检测用分光光度计测定呈阳性的 RSD、 SCMV单一感染样品和混合感染的核酸，按十倍递进稀释法进行 稀释，然后各取lul进行一步法多重PCR，借助凝胶电泳观察结果， 找出肉眼可见特异电泳条带所用核酸的最小临界值，依此得出一步法 多重RT-PCR的敏感性。
权利要求
1、一种甘蔗花叶病和宿根矮化病病原的多重PCR检测方法，其特征在于包括下列步骤1)、在甘蔗植株上确定最佳检测取样部位以待检测甘蔗植株茎基部带鞘叶片作为提取总核酸的材料；2)、根据公知的甘蔗花叶病毒中国大陆优势株系SCMV-A及其它四个株系SCMV-B、D、E、SC的核酸保守序列区设计反转录引物(5’-CCTTCATCTGCATG-3’)和PCR检测引物对cpc1，cpc2；RSD引物对为F1，F2；用于扩增检测甘蔗花叶病病毒的基因片段大小为400bp，上游引物cpc1为5’-GAGTTTGATAGGTGGTATGAAGCC-3’，下游引物cpc2为5’-CCTTCATCTGCATGTGGGC-3’；用于扩增Lxx的基因片段的引物为已有引物上游引物F1为5’-CTGGCACCCTGTGTTGTTTTC-3’，下游引物F2为5’-TTCGGTTCTCATCTC AGCGTC-3’，扩增的Lxx基因片段大小为265bp；3)、总核酸的提取及cDNA的合成利用RNAplant试剂盒提取甘蔗总核酸取约0.1g感病样品，液氮研磨至粉末后加入0.5ml 4℃的提取试剂，振荡至彻底混匀，室温放置5min后于4℃12000rpm离心10min，将上清转入新的无Rnase的离心管后加入0.1ml 5MNaCl，温和混均再加入0.1ml氯仿，上下颠倒数次混匀，然后4℃12000rpm离心10min，取上层水相转入新的无Rnase离心管后再加入等体积的异丙醇，混匀，温室放置10min，4℃12000rpm离心10min，弃上清，加1ml 75％乙醇，4℃5000rpm离心3min，弃上清，短暂离心然后用枪头吸出液体，室温晾干2-3min，加50ul无Rnase水溶解(加2ul RNasin Inhibitor)，于-70℃保存；利用RNA反转录试剂盒进行cDNA的合成在PCR管中，加入如下样品提取的总核酸样品4ul、Nuclease-free Water 10ul、SCMV反转录引物1ul、70℃热激5min后置冰浴上冷却2min、在管中继续加入Nuclease-free Water 1.5ul、5×RT Reaction Buffer 5ul、dNTP Mixter 1.25ul、RNasin 1.25ul、M-MLV RT1ul、将反应管42℃保温60 min、终止反应，反应液就是PCR反应中的cDNA模板；4)、一步法多重RT-PCR的扩增建立一步法多重RT-PCR通过不同反应条件PCR扩增效果的比较，该一步法多重RT-PCR反应体系设计为以“5+20”反应模式即反转录物5ul+PCR反应试剂20ul，在同一个PCR管内进行反转录和多重PCR；反转录反应体系是5×RT Reaction Buffer 1ul，反转录引物(RT)0.5ul，dNTPs 0.5ul，总核酸提取物1ul，RNAsafe0.25ul，M-MLV Reverse Transcriptase 0.25ul，Nuclease-free Water5ul；反应结束后立即在同一PCR管中加入20ul PCR反应试剂Nuclease-free Water 12.35ul、10×PCR Buffer 2.5ul，dNTP Mixter2ul，RSD上下游引物各1ul，SCMV上下游引物各0.5ul，Taq DNA聚合酶0.15ul。PCR扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性20s，53℃退火30s，72℃ 45s，循环30次；最后72℃延伸5min；5)、琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果用TAE电泳缓冲液配制1％琼脂糖凝胶，在TAE电泳槽中进行水平电泳，加10ul PCR扩增产物，以健康甘蔗总核酸的反转录物为模板的PCR产物为阴性对照，以DL2000 Marker为标准分子量，100v/85mA电泳40分钟，用凝胶成像系统拍摄电泳结果，若在265bp处出现扩增条带说明RSD为阳性，若在400bp处出现扩增条带说明SCMV为阳性，若在265bp和400bp均出现扩增条带说明RSD和SCMV均为阳性，无扩增条带说明RSD和SCMV均为阴性；6)、一步法多重RT-PCR特异性及敏感性检测一步法多重RT-PCR敏感性检测用分光光度计测定呈阳性的RSD、SCMV单一感染样品和混合感染的核酸，按十倍递进稀释法进行稀释，然后各取1ul进行一步法多重PCR，借助凝胶电泳观察结果，找出肉眼可见特异电泳条带所用核酸的最小临界值，依此得出一步法多重RT-PCR的敏感性。
全文摘要
本发明公开了一种甘蔗花叶病和宿根矮化病病原的多重PCR检测方法，其特征是(1)取甘蔗植株茎基部带鞘叶片为检测样品；(2)设计反转录引物和PCR检测引物对cpc1、cpc2，RSD引物对F1、F2；对甘蔗花叶病毒和甘蔗宿根矮化病病原的基因片段进行扩增；(3)提取总核酸，将其中的RNA反转录成cDNA；(4)设计该一步法多重RT-PCR的反应体系和扩增程序，将核酸进行扩增；(5)利用凝胶电泳分析扩增结果及特异性，同时利用十倍递进稀释法检测该一步法多重RT-PCR的敏感度。本发明所提供的检测方法通过提取甘蔗的总核酸，在同一个PCR管中完成反转录及PCR反应就可以同时检测出这两种病害的病原，具有操作简单、节省时间、成本低、特异性和敏感性高等优点。
文档编号C12Q1/68GK101186948SQ20071019381
公开日2008年5月28日 申请日期2007年11月23日 优先权日2007年11月23日
发明者张显勇, 张树珍, 杨本鹏, 蔡文伟 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所