一株吡啶降解菌及其应用的制作方法

文档序号:436452阅读:257来源:国知局

专利名称::一株吡啶降解菌及其应用的制作方法
技术领域
:本发明涉及一株吡啶降解菌及其应用。
背景技术
:吡啶在常温下是一种无色有刺激性气味的液体,是目前杂环芳烃中开发应用范围最广的品种之一。吡啶有毒,致癌、致畸、致突变,且易在生物体内富集。可通过吸入、摄取或皮肤接触对人体产生危害,能麻醉中枢神经系统,对眼及上呼吸道有刺激作用。长期吸入出现头晕、头痛、失眠、步态不稳及消化道功能紊乱,可发生肝肾损害,引起皮炎。吡啶是一种良好的溶剂,在工业上可用作变性剂、助染剂,以及其它一系列产品,包括农药、医药、染料、日用化工、香料、饲料添加剂、橡胶助剂等的合成起始物。很多工业废水中都含吡啶,如焦化废水、染料废水、制药废水等。焦化废水等含吡啶工业废水的处理方法一般有物化法、高级氧化法和生物法。相比而言,生物法处理量大,成本低,条件温和,不需要特殊的仪器设备,具有降解彻底和不产生二次污染的优点,是最经济实用的污染处理方法。然而传统的生物处理技术很难达到处理效果,已不能满足环保需求。20世纪70年代出现的生物强化技术可以在不改变现有处理设施的基础上,大大提高污水处理的范围和能力,因而近年来受到了广泛的关注。生物强化技术是通过向废水处理系统中投加从自然环境中筛选出来的高效降解菌或者经过基因重组而得到的基因工程菌,去除某种或某几种污染物,以增强废水处理系统的处理能力、提高处理效率。用生物强化法处理含吡啶废水有诸多优势,已成为研究的热点。生物强化技术的核心是所投加的具有高效降解特性的微生物。人们已经分离出了很多吡腚降解菌株,其中大部分是细菌,如假单胞菌属CPw^fe附o朋力、节杆菌属04wAra6ac敏)、戈登氏菌(GoWom'a"/"c/a)芽孢杆菌(5(3c/〃us)等,也有放线菌和真菌,例如嗜盐放线菌(A^c"Wo/cfesp.)和白腐真菌。这些研究大多停留在实验室阶段,由于水质水力条件及土著菌的竞争等各种原因,一些生物强化系统实际应用效果不理想。因此开发有利于污水处理实际应用的降解菌株及其使用方法十分必要。本发明的高效降解菌株提取自焦化废水,因此在实际应用中可较好适应废水处理运行模式。国际上对幼^^zoog/oeo!Vfc菌的研究很少,目前未见其降解吡啶的报道。
发明内容本发明的目的是提供一株吡啶降解菌及其应用。本发明所提供的吡啶降解菌为幼/"e〃azoog/oeo/cfeyBC026CGMCCJ^.2224。所述幼/"eZ/azoog/oeo/^sBC026CGMCC来源于首钢焦化厂污水处理系统二沉池回流污泥,经驯化、分离、纯化得到。该菌株是阴性革兰氏杆菌,好氧,有运动性,在固体培养基中是黄褐色、表面光滑的圆形小菌落,在液体培养基中有自絮凝现象。幼/"e/Zazoog/oeo/cfesBC026CGMCCW.2224对氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、壮观霉素有抗性,对氯霉素、四环素、头孢敏感。在阿须贝无氮培养基中生长良好,携带有两个大质粒。幼/"e〃azoog/oeo/cfesBC026CGMCCW2.2224的16SrRNA序列如序列表中序列1所示。所述幼/"e〃azoog/oeoW^BC026CGMCCWs.2224,已于2007年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为中国北京市海淀区中关村北一条13号),保藏号为CGMCCW.2224。本发明的幼/朋Z/azoog/oeo/cfeBC026可用于污水体系中吡啶的降解,具体方法可为将S/^eZ/azoog/oeo/cfesBC026CGMCCW2.2224悬浮于含有吡啶和/或其衍生物的污水中,在20—35"C,pH值为5-9的条件下培养。所述幼/we/Zazoog/oeo/^sBC026CGMCCJV2.2224在污水中培养的温度优选为30-35°C,最佳为3(TC,pH值条件优选为pH7-pH8,最佳为pH8。以上述幼/""^^00^/0£0/^5BC026为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围;该菌剂中可根据需要,添加可接受的辅料。本发明的幼Z"e〃azoog/oeozVfesBC026,当投菌量为0.1g/L时,在30°C,180r/min,pH值为7的条件下,BC026菌可以在17h内将浓度为400mg/L的吡啶完全降解。在吡啶初始浓度为991806mg/L的无机盐培养基中,BC026菌均能保持较高的降解活性;降解最适温度为30。C,最适pH值为8。由氮转化实验推测,BC026菌降解吡啶的第一步是断开两条C-N链,生成氨氮和戊二醛,随后戊二醛被氧化为戊二酸,并最终转化为二氧化碳和水。整个降解过程中吡啶约有50%的氮转化成氨氮。利用本发明的zoog/oeo/^fesBC026用于污水体系中吡啶的降解,不仅具有很高的降解效率,同时本发明的S/^e/Zflzoog/oeo^fesBC026为具有自絮凝的特性,污水处理中可发挥重要的作用,增强系统的耐冲击性。本发明的幼/"e/Zazoog/oeoZ^feyBC026取自于废水处理单元,是废水处理系统中的优势菌种,能适应复杂的实际条件,因而该菌株的应用前景广阔。本发明的幼/we〃azoog/oeo/A^BC026携带两个大质粒,可能编码吡啶降解基因,为以后基因工程菌的4构造创造了条件。图1为BC026扫描电镜照片。图2为BC026菌对吡啶的生物降解。图3为BC026菌对不同浓度吡啶的降解情况。图4为不同温度下吡啶的降解特性研究。图5为不同pH下BC026菌对吡啶的生物降解特性。图6为BC026菌降解过程中吡啶与氨氮的浓度变化。图7为BC026菌对吡啶的可能代谢途径。图8为BC026质粒电泳图。具体实施例方式下述实施例中的方法,如无特别说明,均为常规方法。下述实施例中的百分含量,如无特别说明,均为质量百分含量。实施例l、^/"e//azoog/oeo^feyBC026的分离、纯化及其鉴定1、幼/"e〃fl加og/oeo/c^BC026的分离及纯化S/2/"e〃a加og/c^WesBC026是从首钢焦化厂污水处理系统二沉池的活性污泥中取样,经过驯化、分离及纯化得到的一株革兰氏阴性菌。具体步骤如下取首钢焦化厂废水处理系统二沉池回流污泥。在装有污泥样本的容器中滴加少量吡啶溶液(使吡啶浓度保持100—200mg/L),间歇曝气,定期加入10mL吡啶(300mg/L)、以及50mL原焦化废水,同时加入2mL磷酸盐缓冲液(每L含8.5gKH2P04,21.75gK2HP04,33.4gNa2HP04'7H20,1.7gNH4Cl,pH为7.2)以及2mL微量元素溶液(每L含1.5gFeCl3'6H20,0.024gMCl2'6H20,0.19gCoCl2'6H20,0.002gCuCl2-2H20,0.024gNa2Mo04'2H20,0.07gZnCl2,0.006gH3B03),驯化60天。取200mL上述驯化得到的培养液于三角瓶中,加入2滴0.01%的焦磷酸钠溶液及数粒玻璃微珠,在30。C,180r/min的摇床中震荡30min充分摇匀,然后离心。将沉淀转移到100mL含500mg/L吡啶的无机盐培养基(每L中含:Na2HPCV12H201.42g、KH2P041.36g、MgS04-7H200.216g、CaCl20.006g、MnS04-H201.69g、CoCl26H200.00024g、H3B030.00116g、Na2Mo04.2H200.000024g、FeS04-7H200.00278g、ZnS047H200.00115g、CuS04'5H200.00038g)中培养,30°C,摇床180r/min培养,约4天后,取5mL菌液在无机盐培养基中相同条件下转接培养两次。此时,用灭菌去离子水将菌液稀释10"到10_7倍,各取0.1mL稀释液于无机盐固体培养基(上述无机盐液体培养基中加入2%琼脂而制得)平板中涂布分离,30'C培养,长出明显菌落后,挑取有代表性的单菌落,划线分离纯化。得到7株可以在无机盐固体培养基上生长的菌株,将这些菌株的LB培养液于-7(TC保存在终浓度为15%的甘油中,分别给以编号。通过观察菌的生长速率及检测吡啶降解情况,确定一株菌株(BC026)降解吡啶的能力最强,同时该株菌在液体培养中有自絮凝的特性(菌株培养后肉眼可观察到培养液中出现絮状菌团),这种特性将有助于其在污水处理系统中形成菌胶团,增强生物处理系统的耐冲击性,因而该菌具有较高研究价值。BC026液体培养条件是在250mL锥形瓶中加入100mL培养基,以500mg/L吡啶作为唯一的碳、氮源,摇床设为3(TC,180r/min。LB培养基中加入500mg/L吡啶,保持细菌降解活力,防止杂菌侵入。通过离心收集菌体,离心条件为4000r/min,10min。该BC026菌株是阴性革兰氏杆菌,好氧,有运动性,在固体培养基中是黄褐色、表面光滑的圆形小菌落,在液体培养基中有自絮凝现象。该菌对氨节青霉素、硫酸卡那霉素、壮观霉素有抗性,对氯霉素、四环素、头孢敏感。在阿须贝无氮培养基中生长良好。BC026的扫描电镜照片如图1所示。将该BC026菌株送交微生物所进行的生理生化特征鉴定,鉴定结果如表1所示。表1.BC026菌株的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、S/w'"e〃ofzoog/oeo/flfesBC026的16SrDNA鉴定通过16SrRNA序列分析和Biolog微生物鉴定系统鉴定,确定BC026菌为肠e〃a層g/oeo/cfe。具体步骤如下以TIANGEN基因组DNA提取试剂盒提取BC026菌的基因组DNA,作为PCR反应的模板,设计引物进行PCR片断基因扩增。上下游引物序列分别为27F:5,AGAGTTTGATCATGGCTCAG3'1492R:5'TACGGTTACCTTGTTACGACTT3,PCR设定程序为先94。C预变性2min;然后94。C变性1min,55。C退火1min,72。C延伸lmin,共30个循环;最后72。C终延伸15min,4。C保存。PCR产物用0.8%的琼脂糖凝胶分离,纯化与回收后测序。测序结果BC026菌的16SrDNA具有序列表中序列1的核苷酸序列。将BC026的16SrRNA测序结果导入GenBank中进行同源性比对,结果表明它与CraZ)/ree//ai^cc/za,o/Ma(AB238789)、Zoog/oeflraw扭m(X74915)、Afyco//"""sp.(AB248361)的同源性均为99。/。。为了确认实验室的鉴定结果,委托中国科学院微生物研究所进行专业鉴定,根据该菌的多项生理生化特性,以及Biolog微生物鉴定系统的分析,确定BC026属S//"e〃a加og/oeo/afey。iS"綠e〃azoog7o柳'dey同禾中异名为Cra6free〃aj"cc/aro/M"禾口生枝动胶菌(Zoog/oeflraw/gera),2006年重新分类后命名为5Tn'we〃azoog/oeo〖cfes,暂无中文译名。因此,该细菌被正式命名为幼/朋〃azoog/oeo/^sBC026,已于2007年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为中国北京市海淀区中关村北一条13号),保藏号为CGMCCW.2224。3、幼/Me〃flzoogfoeo/c^BC026为自生固氮菌根据文献,生枝动胶菌是自生固氮菌。通过阿须贝无氮培养基培养,证明BC026菌是一株自生固氮菌。具体方法为将BC026菌涂布于阿须贝无氮培养基上,阿须贝无氮培养基组成为C7H1206,10g/L;KH2P04,0.2g/L;MgS04.7H20,0.2g/L;NaCl,0.2g/L;CaS04-2H20,0.1g/L;CaC03,5g/L。观察BC026菌可在培养基上良好生长,以此判断BC026菌是一株自生固氮菌。实施例2、57'"e//flzoog/oeozVfesBC026CGMCCW2.2224对吡啶的生物降解效果检测1、S/w>7e//azoog/oeoWesBC026CGMCCJ^.2224对吡啶的生物降解能力检测在以吡啶为唯一碳、氮源的条件下,考察BC026对吡啶的降解能力。发现BC026菌对吡啶有较好的去除效果,能在较短时间内完成降解。具体步骤如下.-1)取2mL培养至对数期的幼/"e〃azoog/oewVfeBC026CGMCCJV2.2224的LB培养液,收集菌体沉淀,接种到装有200mL无机盐培养基的三角瓶中,培养至对数期。2)离心菌液,所得S/n'"e化zoogfoecH'cfcBC026菌体沉淀用无机盐培养基重悬、离心三次以去除幼/"e/fezoog/oeo/cfeyBC026菌表面吸附的杂质,再转移到一定体积的灭菌无机盐液体培养基中,制备成菌液光密度值OD6。2为12的幼/"e/tozoog/oeoWeyBC026菌悬液,作为降解实验的接种液,同时用干重法测定实际接种量。3)将步骤2)制备的^/"e//azoog/oeo/<i^BC026菌悬液以干菌体接种量为0.1g/L(干重法测定)接种于100mL含有400mg/L吡啶的无机盐培养基中,用封口膜密封,在3(TC,180rpm的摇床中振荡培养。设未加菌的含有400mg/L吡咬的无机盐培养基,进行同等条件下的实验作为空白对照。4)在步骤3)所述的培养过程中,间隔12小时分别取在步骤3)所述的处理及空白对照的反应液,测定吡啶浓度和菌液吸光度。检测方法如下所述菌密度用岛津UV2401型紫外-可见光分光光度计,在吸收波长为602nm处检测菌液吸光度。吡啶浓度发酵液样品由0.22pm滤膜过滤后,通过高效液相色谱(岛津LC10ADVP,SPDIOAVPUV-VisDetector;DiamonsilC18色谱柱,250x4.6mm,5pm)测定吡啶浓度。结果如图2所示,由图2可以看出,未接种菌液的空白实验中,吡啶浓度变化较小,降低部分应为吡啶的少量挥发所致;而在接种菌液的降解实验中,随着吡啶浓度的降低,菌密度增长,当吡啶消耗完全后,菌密度快速衰减。这说明BC026菌可以吡啶为唯一碳、氮源,并且可在较短时间内将吡啶完全降解。BC026菌接种到入培养液后,立即吸附部分吡啶,使吡啶浓度在开始的4h迅速降低。在4h至lj6h内,菌密度增长速率开始加快,这说明BC026菌经过抑制期适应了生长环境,开始降解吡啶。6h之后,细菌达到对数生长期,吡啶降解速度加快。在15.5h,吡啶去除率达到98.7%,此时作为碳、氮源的吡啶缺乏,细菌因得不到足够的营养而死亡,因此菌密度迅速下降。图2中A为空白对照的吡啶浓度变化曲线;图2中B为BC026菌在含有400mg/L吡啶的无机盐培养基中培养过程中吡啶浓度变化曲线;图2中C为BC026菌在含有400mg/L吡啶的无机盐培养基中培养过程中菌密度(OD602)变化曲线。2、幼/朋Z/azoog/oeo/cfeyBC026菌在不同吡啶初始浓度下的降解特性由不同吡啶初始浓度下的降解实验发现随着吡啶初始浓度的增加,降解抑制期变长,降解期的吡啶降解速率变快。具体步骤如下1)取2mL培养至对数期的S/z/"e〃azoog/oeo/^fesBC026CGMCCN2.2224的LB培养液,收集菌体沉淀接种到装有200mL无机盐培养基的三角瓶中,培养至对数期。2)离心菌液,所得幼/"6/^200§/060^^8(:026菌体沉淀用无机盐培养基重悬、离心三次以去除幼/"e/Zazoog/oeo/tfeyBC026菌表面吸附的杂质,再转移到一定体积的灭菌无机盐液体培养基中,制备成菌液光密度值OD602为12的5/>^/&zoog/oeo/a^BC026菌悬液,作为降解实验的接种液。同时用干重法测定实际接种量。3)在4个装有100mL无机盐培养基的250mL三角瓶中分别加入吡啶,其终浓度分别为99mg/L、473mg/L、932mg/L、1806mg/L,然后分别将步骤2)制备得到的幼/we〃azoog/oeo/flfeyBC026菌悬液以干菌体接种量为0.06g/L接种于上述三角瓶中,以未接种装有100mL含吡啶终浓度为1896mg/L的无机盐培养基的250mL三角瓶为空白对照,将各个三角瓶用封口膜密封,在3(TC,180rpm的摇床中振荡培养。4)在步骤3)所述的培养过程中,间隔12小时分别取在步骤3)所述的处理及空白对照的反应液,测定吡啶浓度和菌液吸光度。吡啶浓度和菌液吸光度检测方法如步骤1中的步骤4)所述。结果如图3所示,其中吡啶浓度变化曲线如图3中B所示,由图3中B可以看出在吡啶初始浓度为991806mg/L的培养液中,S/z/"e〃azoog/oeo/^sBC026菌都可降解吡啶,但各吡啶初始浓度条件下,抑制期的长短和降解速率不同。在吡啶初始浓度为99mg/L的培养液中,W/"e〃flzoog/oeo/^sBC026几乎没有表现出抑制期,吡啶浓度直线下降。随着吡啶初始浓度的升高,抑制期时间变长,说明吡啶初始浓度越高,细菌适应越慢。但是一旦进入降解期,吡啶初始浓度高的培养液中微生物降解速率快,从图中看即为斜率绝对值较大,这是因为细菌完全适应了生长环境,高浓度的吡啶给细菌提供更充足的营养基质从事生命活动并大量繁殖,而细菌数量增大后,所需的碳、氮源多,吡啶的降解速率相应提高,二者相互促进。菌液吸光度的变化曲线如图3中A所示;图3中A可以看出,四个浓度下,菌量都随着吡啶的降解而升高。在吡啶初始浓度为99mg/L的培养液中,菌密度曲线很快达到最高点,与图3中B对照,表明在吡啶初始浓度为99mg/L的培养液的吡啶浓度降到20mg/L时,可利用的基质过少成为幼/"eZ/azoog/oeo/tfesBC026生长的限制因素,S/^e/Zazoog/oeoW^BCOSG菌量开始下降。从吡啶初始浓度为1806mg/L的菌液吸光度的变化曲线可以看出实验初期细菌生长速度较慢,吡啶的降解速率也比较慢,但随着吡啶的降解,高浓度吡啶对幼/朋//"200^/0£0/&58(:026生长的抑制作用逐渐减弱;当吡啶浓度降为400mg/L左右时,幼/朋Z/azoog/oeo^eyBC026生长进入对数期,菌量迅速增大。在不同的吡啶浓度下,所能达到的最大菌密度及所需时间各不相同,四条曲线中,最大菌密度分别为0.217g/L、0.623g/L、0.857g/L、1.375g/L,所需时间分别为15.5h、17.5h、27.5h和56.5h。随着吡啶初始浓度的升高,培养液中碳、氮源的量变大,最大菌密度递增。但是这种增长并不成正比,这说明,幼/"e/^zoog/oeo^eyBC026的生长的限制因素不仅有吡啶的浓度,还有其它的因素,例如与代谢产物的积累以及细菌对生存空间的竞争有关。图3中A中的99mg/L、473mg/L、932mg/L、1806mg/L分别指S/n'"e〃azoog/oeo/ofe;yBC026在上述含吡啶浓度为99mg/L、473mg/L、932mg/L或1806mg/L的培养基中培养过程中菌密度(OD602)的变化曲线;图3中B中的99mg/L、473mg/L、932mg/L、1806mg/L、空白对照分别指S/z/"e〃azoog/oeo/^feBC026在上述含吡啶浓度为99mg/L、473mg/L、932mg/L或1806mg/L的培养基培养或上述空白对照处理过程中吡啶浓度变化曲线。3、S/w'"e〃azoog/oeoW^BC026菌在不同温度下的降解特性在不同温度下实施降解实验,发现BC026菌在3035C具有较高的吡啶降解效率,从实际应用的角度看,选择3(TC较为适宜。具体步骤如下在无机盐培养基中加入终浓度为500mg/L吡啶后,将步骤2中的步骤2)制备得到的幼f"e〃azoog/oeo/^fesBC026菌悬液以干菌体接种量为0.14g/L接种于该培养基中,分取100mL培养液分装至四个250mL三角瓶中,分别置于20°C、25°C、30°C、35。C的摇床中培养。将一个装有lOOmL未接菌、终浓度为500mg/L吡啶的无机盐培养基在35'C的摇床中同时培养,以设为空白对照。然后按照步骤l中的步骤4)所述的方法进行取样,测定培养过程中的吡啶浓度变化,绘制吡啶浓度变化曲线。结果如图4所示,结果表明,由于实验加大了干菌体投菌量(0.14g/L),因此细菌直接进入对数降解期。从图4可以看出,2(TC时的降解速度最慢,25"C时的速度稍快,3(TC和35。C时的降解速率最高。3(TC与35。C的降解能力相差很小,在反应12h时的降解速率几乎同时达到85y。。这说明细菌最适的生长、降解温度可能处于3035。C之间,考虑到污水处理工艺的实际情况,BC026菌的培养温度选择3(TC较为合理。图4中的标注20。C、25°C、30°C、35°C、空白对照分别是上述幼/朋〃azoog/oewVfeBC026在20°C、25°C、3(TC或35。C条件下培养或上述空白对照处理过程中吡淀浓度变化曲线。4、幼!'Me/Zazoog/oeoWesBC026菌在不同pH值下的降解特性由不同起始pH值条件的降解实验,发现BC026菌的最适降解pH值为8。具体步骤如下在7个250mL三角瓶中装入相同体积的无机盐培养基,分别调节pH至4、5、6、7、8、9、10,均以接种量为0.13§化接种步骤2中的步骤2)制备得到的幼^//0zoog/oeo^^BC026菌悬液,并分别加入吡啶至终浓度为500mg/L,培养液终体积均11为100mL。将各个三角瓶用封口膜密封,在30。C,180rpm的摇床中振荡培养。培养过程中,按照步骤1中的步骤4)所述的方法进行取样,测定培养过程中的吡啶浓度变化,绘制吡啶浓度变化曲线。结果如图5所示,从图5分析得出,pH值为4和10时,BC026菌对吡啶没有降解作用。pH为4的培养液中,溶液很清亮,细胞凝聚成小颗粒沉淀。pH值为10时,培养基中的部分成分生成沉淀,破坏了培养基组成。实验中测定在pH值为4和10的条件下菌量略有降低。在pH为59的条件下,细菌都能以吡啶为唯一的碳、氮源生长,只是降解的速率不同,降解最快的pH值为8,其它依次为pH7〉pH6-pH5>pH9。图5中的pH二4、pH=5、pH=6、pH=7、pH=8、pH=9、pH二10分别指W/"e〃"zwg/oeoW^BC026在pH为4、5、6、7、8、9或10条件下培养过程中吡啶浓度变化曲线。5、幼/"e〃azoog/oeo/cfeyBC026菌对吡啶代谢途径的检测测定降解过程中的氨氮浓度与吡啶的变化关系,推测出BC026菌对吡啶的可能代谢途径。具体步骤如下1)取2mL培养至对数期的幼/"e〃azoog/oeo/tfeyBC026CGMCCW.2224的LB培养液,收集菌体沉淀接种到装有200mL无机盐培养基的三角瓶中,培养至对数期。2)离心菌液,所得zoog/oeo/tfeyBC026菌体沉淀用无机盐培养基重悬、离心三次以去除幼/"eZ/azoog/oeoW^BC026菌表面吸附的杂质,再转移到一定体积的灭菌无机盐液体培养基中,制备成菌液光密度值OD6Q2为12的S/e/ZazoogfoeoWMBC026菌悬液,作为降解实验的接种液。同时用干重法测定实际接种量。3)将步骤2)制备得到的幼/we〃flzoog/oewVfesBC026菌悬液以干菌体接种量为0.1g/L接种于100mL含有400mg/L吡啶的无机盐培养基中,用封口膜密封,在30°C,180rpm的摇床中振荡培养。取未加菌、含有400mg/L吡啶的无机盐培养基进行相同条件下的培养,以设为空白对照。4)间隔23h取培养菌液样品,按照下述步骤测定吡啶和氨氮的浓度。间隔34h取培养菌液样品,按照下述步骤测定中间产物。检测方法为吡啶浓度样品由0.22pm滤膜过滤后,通过高效液相色谱(岛津LC10ADVP,SPD10AVPUV-VisDetector;DiamonsilC18色谱柱,250mmx4.6mm,5(im)测定。氨氮浓度样品经0.22(im滤膜过滤,用水杨酸-次氯酸盐光度法(GB7481-87)测定。中间产物样品经0.22pm滤膜过滤、二氯甲烷等体积萃取,然后用预先烘干的无水硫酸钠过滤,在GC/MS(Agilent6890NGC/5973MSD,DB-5MS毛细管柱,30mx0.25mmx0.25)im)上定性分析。结果如图6所示,由图6表明,降解过程中产生氨氮。吡啶开始减少的同时,氨氮的量升高,这说明吡啶降解的第一步就脱去氮原子,氮分子以氨氮的形式释放到溶液中。吡啶完全降解后,氨氮的量不再增加,这进一步证明没有其他的中间产物可以脱氮转变成氨氮。而根据文献吡啶能促使与戊二醛、戊二酸脱氢酶有关的辅酶产生,结合吡啶完全对称的结构推测,吡啶脱氮时打开了两个C-N键。当吡啶降解完全后,氨氮的量开始降低,这证明培养液中还有可以充当碳源的物质,即吡啶脱氮后的中间代谢产物。实验过程中取样由GC-MS测定,没有检出中间代谢产物,这与文献报道相同。降解过程中的pH值随着吡啶的降解而降低,吡啶完全降解后,pH值开始升高。这说明吡啶降解产生酸性的中间产物,根据文献报道,推测这种中间代谢产物有可能是戊二酸,而这种物质可能由戊二醛氧化而来。戊二醛可能并不是经由吡啶脱氮羟基化所得的产物氧化而来,因此推测吡啶脱氮后生成戊二醛,这与文献报道的吡啶中间产物为氨基乙酸和丙二酸不同。在17h左右,氨氮量不再减少,而氨氮是BC026菌可利用的一种氮源,根据文献报道,生枝动胶菌为化能异养菌,这说明培养体系中缺乏可利用的有机碳,因此可推断戊二酸进一步转化为BC026无法利用的无机碳。一般情况下,生物通过同化与异化作用将一部分碳转化为自身的生命物质外,其它碳由呼吸作用,最终以二氧化碳的形式释放,因此这种无机碳可能为二氧化碳。由吡啶和氨氮的对应关系可以看出,在降解过程中,吡啶中的氮约有50%转化为氨氮。另有50%的氮在生物体内或环境中以其他形式存在。图6中的吡啶-N是BC026培养过程中吡啶浓度变化曲线,氨氮是BC026培养过程中氮浓度变化曲线。综上所述,推测当BC026菌以吡啶为唯一碳、氮源时的代谢途径如图7所示。继续对菌液进行培养,氨氮的量基本没有变化,当向培养液中补加灭菌葡萄糖溶液后,测定体系中的氨氮量,发现氨氮浓度快速降低至零,这是因为吡啶是培养液中的唯一碳、氮源,而吡啶的碳、氮比远小于微生物生长的最佳碳、氮比,因此证明培养后期表现出来的细菌衰亡是由缺乏碳源引起的。6、zoog/oemVfeyBC026菌的质粒提取用QIAGEN试剂盒提供的方法提取BC026菌中的质粒。证明了幼/"eZ/flzoog/oeo^esBC026中有两个大质粒,其功能还在进一步验证中。具体步骤如下1)在LB培养液中加入终浓度为500mg/L的吡啶,接种zoog/oeo^esBC026,培养至对数后期。2)根据QIAGEN质粒提取试剂盒的方法提取质粒。3)用琼脂糖凝胶电泳分离。结果如图8所示,结果表明,S/2/"e//flzoog/oeoW^BC026中有两个大质粒(图8中质粒1条带,质粒2条带)。图8中,泳道L1为分子量标准,泳道L2—L7序列表<160>1<210〉1<211>1449<212>DNA<213>iS7z/"e〃ofzoog/o柳V/es<楊>1catggctcag33Cg犯CgCtggcggcaggcttaacacatgc犯gtcgsac60gccccgcaaggggagtggcagacgggtgagt咖gcgtgggaatctacccatctctacgg120犯t犯ctcsggg3a3cttgtgctaataccgtatacgcccttcgggggaaagatttatcgg180卿tggatg3gcccgcgttggatt3gctsgttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacg240atccatagctggtctg卿ggatg3tcsgccacattgggactg3gscacggcccaaactc300ctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgcc360gcgtgagtgatgaaggccctagggttgtaaagctctttcaCCggtg犯g3taatgacggt420aaccggagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacg肌gggggct■agcgttgttcggaattactgggcgt犯3gcgcacgtaggcgggt3ttt犯gtc鄉ggtg540aaatcccggagctcaactccggaactgcctttgatactgggta_cct3gagtatgga^gsg600gtaagtggaattccgagtgt卿ggtg犯attcgtagatattcgg鄉肌caccagtggc660gaaggcggcttactggtccattactgacgctgaggtgcga33gCgtggggagcaaacagg720attagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgttagccgtcggcatgcatgca780tgtcggtggcgC3gCt犯Cgcattaaaca"ttccgcctggggagtacggtc840aeictcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggeigcatgtggtttaattcgaagc■犯cgcgcag3accttaccagcccttgacatgtcggtcgcggattacagagatgttttcct960tcagttaggctggaccgaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagat1020gttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcccttagttgccagcattcagttggg1080C3ctctaagggg3CtgCCggtgataagccgagagg鄉gtggggatgacgtcaagtcctc1140acggcccttacgggctgggctacacacgtgctacaMggtggtgacagtgggceigcg卿1200cagcgatgtcgagctaatctccaa3Eigcc3tctcagttcggattgcactctgcaactcga1260gtgC3tgaagttggaatcgctagtaatcgcgga_tcagcatgccgcggtgeiatacgttccc1320gggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggttttacccgaaggcgatgcgc1380taaccgcaaggaggcagtcgaccacggtagggtcagcgactggggtgaagtcgtaacaag1440gtaaccgta1449权利要求1、ShinellazoogloeoidesBC026CGMCC№.2224。2、S/zZ"e〃azoog/oeo/tfesBC026CGMCCJY2.2224在降解含氮杂环化合物中的应用。3、根据权利要求2所述的应用,其特征在于所述含氮杂环化合物为吡啶或其衍生物。4、根据权利要求3所述的应用,其特征在于所述降解含氮杂环化合物为降解污水中的吡啶和/或其衍生物,具体方法为将幼/"e/Zazoog/oeoW^BC026CGMCCW2,2224悬浮于含有吡啶和/或其衍生物的污水中,在20—35。C,pH值为5-9的条件下培养。5、根据权利要求4所述的应用,其特征在于所述幼/"e〃azoog/oeo/cfeBC026CGMCC在污水中培养的温度为30-35°C,pH值条件为pH7-pH8。6、根据权利要求5所述的应用,其特征在于所述幼,"e〃azoog/oeo^^BC026CGMCCWs.2224在污水中培养的温度为30°C,pH值条件为pH8。7、以幼/"e〃azoog/oeo/cfesBC026CGMCCW2.2224为活性成分的生物菌剂。全文摘要本发明公开了一株吡啶降解菌及其应用。该吡啶降解菌为ShinellazoogloeoidesBC026CGMCC№.2224。利用本发明的ShinellazoogloeoidesBC026用于污水体系中吡啶的降解,不仅具有很高的降解效率,同时本发明的ShinellazoogloeoidesBC026为具有自絮凝的特性,污水处理中可发挥重要的作用,增强系统的耐冲击性。文档编号C12N1/20GK101255403SQ20071030387公开日2008年9月3日申请日期2007年12月26日优先权日2007年12月26日发明者唐孝炎,孙庆华,柏耀辉,温东辉,翠赵申请人:北京大学
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