专利名称：：包含脯氨酸特异性蛋白酶的食物产品的制作方法
技术领域：
：本发明涉及包含脯氨酸特异性蛋白酶的食物产品、其制备方法及其降解毒性或变应性麸质肽的用途。
背景技术：
：麸质(gluten)是小麦、大麦、裸麦、斯佩尔特小麦(spelt)和黑小麦中存在的常见膳食蛋白。已知摄入麸质在一些个体中会导致疾病。麸质是富含谷氨酰胺和富含脯氨酸的麸朊(gliadin)和麦谷蛋白(glutenin)的复杂混合物，其被认为会导致多种疾病。由于其氨基酸组成，这些麸质的特定部分能在人胃肠道中抵抗蛋白降解。因此，特定的、富含脯氨酸的肽可能增多，其可能导致不想要的作用，例如，对于多种此类麸质来源的肽不耐受性。例如，文献(Arentz-Hansenetal,J.Exp.Med.2000;6:337-342;Vaderetal,Gastroenterology2002;122:1729-1737)已描述了导致在乳糜污症(celiacdisease)患者中观察到的麸质毒性的肽的氨基酸序列。乳糜泻症是广泛流行的小肠自身免疫疾病。在乳糜泻患者中，观察到了多种自身免疫病症的高度流行，所述病症尤其是I型糖尿病、疱疹样皮炎、自身免疫性甲状腺炎、胶原病、自身免疫性脱发症和自身免疫性肝炎。乳糜泻症偶尔也伴随精神和神经方面的症状，这表明富含脯氨酸的肽的代谢扰乱可能具有非常深远的影响。目前仅终身食用不含麸质的膳食可有效预防乳糜泻症患者的临床症状。但是，对于这些患者来说不幸的是因为麸质是便宜的蛋白，其具有令人感兴趣的应用可能性，因此其广泛用于各类食品中，包括市售的汤、酱油(soysauces)、酱料(sauce)、冰淇淋、薯片和热狗中。麸质不耐受患者因此需要详细的食品列表，以防止摄取有问题的麸质分子。毕竟，摄入低至每天50mg的麸质就可能导致临床症状的重现。现在我们理解到，麸质中存在的有问题的、富含脯氨酸的肽对于胃肽酶和胰腺肽酶(例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等)的切割具有高度抗性。仅那些能水解涉及到脯氨酸的肽键的特异性酶才能大量水解富含脯氨酸的序列，由此破坏与乳糜泻症相关的表位。已有报道，多种酶对于富含脯氨酸的毒性肽的失活有有益作用，例如，脯氨酰寡肽酶(EC3.4.21.26;Shanetal.6W置e297,p2275-2279)和二肽基肽酶IV(EC3.4.14.5;US-A-2002/0041871)。还有多份已公开的专利申请，其中提到了脯氨酸特异性蛋白酶在降低含麸质食品抗原性中的可能应用(如WO-A-2002/45523)以及此类酶在预防乳糜泻和相关疾病的临床症状中的用途(例如，WO03068170禾nWO2005/027953)。最近，还通过使用十二指肠提取物，展示了酶疗法在治疗乳糜泻患者中的有效性(CornelletaLScandinavianJournalofGastroenterology,2005;40:1304-1312)。WO-A-2002/45523特别提到将脯氨酸特异性内蛋白酶(endoproteas)用于对多肽(包括富含脯氨酸的肽)的蛋白水解。其描述了将内蛋白酶加入蛋白质性的食物产品，以遏制苦味或者降低其变异原性。在WO-A-2005/027953中公开，这种特殊的内蛋白酶可理想地适合作为膳食补充剂，以支持对膳食麸质的消化过程，因为其展示出宽的pH最优值，这使得酶在口中、食道、胃中都具有活性，并且在十二指肠也能继续其活性。WO-A-2005/027953目标在于在食物被消费掉之前就从其中除去富含脯氨酸的毒性肽，由此防止身体暴露于富含脯氨酸的毒性肽或者使得这种暴露最小化。其还教导了将经稳定的酶制剂用作为消化助剂。以这种手段，酶与食品一起被被消费，从而在经过胃肠道期间降解食品中富含脯氨酸和/或富含谷氨酰胺的蛋白序列。但是，根据WO-A-2005/027953，酶制剂仅可被加入具有低于0.85的水分活度的富含脯氨酸和/或富含谷氨酰胺的食品中，以使酶保持足够的活性。当食物产品将被贮藏更长的时间时，应当避免与水分或潮湿空气的接触，这暗示要使用经干燥的食物。这种前提限制了可与内蛋白酶组合的食品选择数量。在含水食品(例如植物黄油或类似涂抹酱(spread))中使用酶制剂一般是本领域所广泛已知的。但是，在大多数情况下，酶作为加工助剂加入，而并不想要长期的酶活性，即，在产品包装之后继续的酶活性。例如，DE-A-10104945教导了含有磷脂和酶(例如转谷氨酰胺酶)的低脂涂抹酱，并且不使用乳化剂或稳定助剂。在产品生产阶段期间短时间孵育后，通过在95°C加热2-3分钟使转谷氨酰胺酶失活。WO-A-95/28092关注于稳定助剂(例如多元醇)的使用，以对适用于食物的油包水乳剂加以稳定，其中，所述乳剂包含热不稳定化合物，例如酶。与上面提到的两份申请不同，WO-A-95/28092的目标是对酶活性进行长期稳定。为达到该目的，其举例而言，在水相中有40-50%的甘油。但是，在食物产品中加入如此高含量的多元醇是不被允许的或者是感官上无法接受的。发明描述现已发现，脯氨酸特异性蛋白酶可用作为具有高水分活度并且缺少高含量酶稳定剂的食物产品中的成分。此类产品甚至可被巴氏灭菌，以确保足够的耐贮藏性，而不会大量损失相关酶活性。在本发明中表明，在食物产品，例如三明治馅料(filling)、浇料(topping)、佐料(condiment)、酱料(sauce)、多种饮料和乳剂(例如低脂涂抹酱)中，脯氨酸特异性蛋白酶保持有足够活性，足以实现对富含脯氨酸的麸质序列的充分胃水解。通常，食物产品的味道不会被酶的存在所影响或改变。酶在巴氏灭菌处理中的存活是令人吃惊的。因为本领域中认为，在高水分活度的条件下，绝大多数酶不能在巴氏灭菌条件下存活。类似地，人们预计在具有高水分活度的产品中贮藏时，绝大多数酶将在一周内失活。因此，根据本发明我们还出人意料地发现，如果将具有高水分活度的产品贮藏于冷藏条件下时，酶能在长至一年的时间内保持其活性。在冷藏条件下意味着温度低于10°C，优选地，0-10。C之间，更优选地，2至8。C之间。本发明因此涉及经过巴氏灭菌的耐贮藏食物产品，其具有至少0.80，优选至少0.85的水分活度，并且含有脯氨酸特异性蛋白水解活性，所述活性高到足以对富含脯氨酸的蛋白序列进行去毒化。富含脯氨酸的蛋白序列的毒性量被认为是在超过1mg的麸质中所存在的量。根据本发明的另一方面，公开了耐贮藏的食物产品，其具有至少0.80的水分活度，优选至少0.85，且其含有脯氨酸特异性蛋白水解活性，所述活性高到足以对富含脯氨酸的蛋白序列进行去毒化，由此使得食物产品包含少于lw/wy。的蛋白或肽，优选地，食物产品是不含麸质的。本发明还涉及经灭菌的脯氨酸特异性蛋白酶。灭菌表示不含微生物，优选地，还不含微生物孢子。优选地，对脯氨酸特异性蛋白进行过滤，使其不含微生物，优选地，还不含微生物孢子。谷物蛋白可被进一步分为清蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白和谷蛋白。麸质是谷物(例如小麦、裸麦、斯佩尔特小麦、燕麦、大麦、玉米和水稻)经漂洗以除去淀粉和水可溶组分后剩余的水不可溶蛋白。其还可被进一步分为麸朊和麦谷蛋白。麦谷蛋白可被进一步分为高分子量和低分子量亚基。关于麸质蛋白的进一步讨论见WheatGluten(P.R.ShewryandA.S.Tathameds，.Cambridge:RoyalSocietyofChemistry,2000)或Wieser(1996)爿cto户ae^Wr.Sw;p/.412:3-9的综述。根据IUMB的国际公认的对所有酶的分类和命名体系，寡肽酶、二肽基肽酶和内蛋白酶是水解内部肽键的酶，进而可基于其催化机制将其分入亚类。适合本发明目的的优选脯氨酸特异性蛋白酶是来自Am'gw的酸稳定的且胃蛋白酶稳定的内蛋白酶，如WO-A-02/45524和WO-A-2005/027953所述，它们能在脯氨酸残基的羧基侧切割肽和完整蛋白，其还能在非常低的pH条件下和胃蛋白酶存在下切割肽和完整蛋白。该内蛋白酶在胃蛋白酶存在下的酸性条件下能够存活，并且可能在整条十二指肠中都继续保持其活性。最优选的内蛋白酶是源自食品级真菌A^e，7/w的脯氨酸特异性内蛋白酶或者属于丝氨酸蛋白酶S28家族的脯氨酸特异性内蛋白酶。水分活度是物质中水的相对可获得性。其在本领域中被定义为水的蒸汽压除以同样温度下纯水的蒸汽压。因此，纯蒸馏水具有恰好为1的水分活度。在食物产品中水分活度不同于水含量(％水)。水含量是样品中存在的总的水，即，结合的水加上游离的水，而水分活度仅提供对游离水的量度，其通常被表示为aw或者平衡相对湿度百分比(％ERH)。食物产品的水分活度是当食物产品和周围空气之间建立起平衡时食物产品直接邻接区域的空气的恒定相对湿度。该恒定相对湿度进而被称为"％ERH"(如果其表示为百分比的话(0-100%))或者"水分活度"(如果其表示为0至1.0之间的值的话)。用于测定水分活度的方法在AOACInternational(1995),Method978.18的官方分析方法中有详细描述。在本申请文件中，"热处理"表示至少65°C的热处理，优选至少70°C，其持续至少2秒，优选至少20秒。此类热处理的一个例子是巴氏灭菌，如针对奶应用的，S卩，在72。C加热15秒。巴氏灭菌是技术人员已知的概念。得到的食物产品由此是微生物安全产品，其具有提高的保质期。"食物产品"表示下述产品或食物成分，其意欲被用于在不经预先热处理(例如烘焙、煎炸或烹煮)的情况下被消费。具有延长的或提高的保质期的食物产品被理解为具有至少一周直至一年或更长的保质期，在该保质期内可以确保所述产品的感官性质和微生物安全性。明显地，可允许的保质期很大程度上取决于食物产品的实际贮藏条件。很多珍贵的食物产品都必须冷藏，以使其保质期最大化。如果在本发明的食物产品中使用稳定助剂，特别是多元醇，例如甘油、山梨糖醇、蔗糖、聚丙二醇、海藻糖、麦芽糊精、乳糖和葡萄糖，那么其含量通常少于食物产品的10wt%，优选少于5wt%。优选地，根据本发明的食物产品含有少于1。/。w/w的酪蛋白，更优选地，根据本发明的食物产品不含酪蛋白。摄取以丸剂或片剂形式存在的脯氨酸特异性蛋白酶可能允许麸质不耐受患者能够安全消费此类含麸质食物产品。但是，现己发现，蛋白酶还可方便地加入进下述食物产品，所述食物产品自身可不含麸质或含低含量的麸质，但是所述食物产品通常与含麸质食品组合。更优选地，根据本发明的含内蛋白酶的食物产品是本领域中被认为是"不含麸质"的食物成分。根据CodexAlimentarius的"CodexStandardforGluten-FreeFoods"(CodexStan118-198)，当用于不含麸质的食物中时，源自含麸质谷物的食物成分的氮含量不可超过每100g产品0.05g(50mg)(基于干物质而言)。根据本发明，公开了下述食物产品，其包含高于每份0.5PPU的脯氨酸特异性蛋白水解活性，即，在一份中存在的酶活性能够水解25mg麸质。"一份"是一顿餐食期间消费掉的食物的量，所以其通常是在一个小时之内，优选40分钟之内消费掉的。优选作为脯氨酸特异性蛋白酶载体的食物产品是冷藏贮藏的食物产品。尤其优选的是含蛋白酶的食物产品是佐料，S卩，用于增强其它食物(尤其是含麸质食物)味道的食品。佐料具有下述优点在家庭和餐厅、餐馆及超市中丰富存在，典型地，具有长期保质期。佐料的优选例子是番茄酱或番茄汁。此类产品典型地具有低于4.2的pH，更优选地，低于4.0，这表明它们仅需要有限的巴氏灭菌处理。需要有限巴氏灭菌处理，并且优选适合作为活性脯氨酸特异性蛋白酶载体的其它酸性产品的例子是果汁和水果浓縮物。事实上，甚至经过酸化或碳酸化的瓶装水也将是酶的优秀载体。"Shots"例如蔬菜或水果浓縮物也在该类别中。类似地，含有食品级防腐剂(例如苯甲酸盐或山梨酸盐)的酸性产品也是酶的优秀载体。例如，三明治馅料或浇料通常与具有高于0.85的水分活度值的含麸质食物(例如面包)一起被消费。根本不需要巴氏灭菌的非常酸性的产品，例如，可乐，也是优秀的载体，因为脯氨酸特异性蛋白酶在这些条件下是非常稳定的。此外，所述的酶与含有高浓度存活益生菌的制品相当相容。通常，此类益生菌产品具有高于0.95的水分活度，其被低于4.0的pH所稳定。此外，本发明涉及制备含有本发明酶制剂的食物产品的工艺，其中，在对所述食物产品进行巴氏灭菌处理之后向食物产品中加入脯氨酸特异性蛋白酶。在该手段中，可在无菌条件下将酶加入进已经过巴氏灭菌的产品中。能够用于进行该手段的技术的例子是无菌添加技术，例如TetraPak所出售的(TetmAldoseTMS;参见，例如http:〃www.tetrapak扁processing.de/produkte/pdf/aldose.pdf)。本发明的又一实施方式是油包水或水包油乳剂、涂抹酱，优选地，植物黄油或低脂涂抹酱。广泛使用的、意欲用于与含麸质食品一起消费的低脂涂抹酱特别适合作为酶促消化助剂的载体。这些产品的高水分含量允许向其中引入大量的酶，典型地，所述产品被贮藏于冷的条件下，传统地，7。C或更低的温度下。因为酶被限定进水相，此类乳剂也属于具有至少0.85的水分活度的产品类别。本发明的该实施方式的其它重要优点在于，面包和涂抹酱在口中被彻底混合，由此引发脯氨酸特异性蛋白酶对麸质分子的降解。此外，已知，脂肪化合物的存在能通过口感机制来抑制胃的排空。这两种机制都导致酶和麸质之间更强烈和更长期的相互作用，由此使得酶和麸质可在食糜到达十二指肠之前最大化地相互作用。这很重要，因为已知十二指肠是能引起富含脯氨酸的麸质分子的病原性反应的胃肠道的最上游部分。我们发现，脯氨酸特异性蛋白酶，特别是根据WO-A-2002/45523的来自Am'ger的酸稳定脯氨酸特异性内蛋白酶，具有宽pH最优值，这使得其可在口中、食道、胃和十二指肠中都具有活性。脯氨酸特异性内蛋白酶被加入乳剂之后仍展示出这样的高度保留的活性这一事实是相当出人意料的。现有的文献都一致认定，与乳化剂接触以及随后加入乳剂中会对酶造成显著的胁迫，很容易导致酶的失活(见，例如，Gatoraeetalin"StabilityandStabilisationofEnzymes,ElsevierSci.Publish.1993,p329或DeRoosandWalstra,ColloidsandInterfacesB;Biointerfaces6(1996)201-208)。因此，特别适合本发明的是下述酶具有脯氨酸特异性内蛋白酶活性，以及具有与WO2002/45523的SEQIDNO:2相同的氨基酸序列，或者与WO2002/45523的SEQIDNO:2的第1至526位氨基酸具有至少80%、至少90%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。氨基酸序列间的同一性水平通过WO2002/45523第15页提到的方法来测定。根据本发明的酶制剂必须以对应于待消化的蛋白总量的量加入食物产品中。例如，典型地，向面包片上应用低脂涂抹酱。典型地，向每片18克的面包应用5克的涂抹酱。典型地，面包含有8%的蛋白，其中7%是麸质，即，一片面包含有1.5克蛋白。为在胃肠消化期间使用WO2002/45523所述的酶实现对存在的所有蛋白(即包括麸质级分)的充分水解，需要相对每克蛋白而言大约20PPU(定义见"材料和方法"章节)。因此，消化1.5克蛋白需要20PPU的1.5倍，即30PPU。这30PPU必须由5克低脂涂抹酱来提供，这表明低脂涂抹酱具有6000PPU/kg的酶活性。加入根据本发明的酶制剂几乎不会影响到低脂涂抹酱的制备和性质。但是，为避免苦味的影响(这是用具有蛋白水解活性的酶处理之后的奶产品中通常报道的)，根据本发朋的涂抹酱优选缺乏疏水蛋白，例如酪蛋白。可通过加入经发酵的乳清蛋白来改善涂抹酱的味道，以提供典型的黄油味。我们发现，在经发酵的乳清中存在的残余蛋白会被脯氨酸特异性酶水解，但是这没有负面的感官影响。优选在形成乳剂之前向水相加入脯氨酸特异性蛋白酶，最优选地，在对水相巴氏灭菌之后，但在形成乳剂之前，在无菌条件下加入脯氨酸特异性蛋白酶。存在有若干种方法来高效生产低脂涂抹酱。根据一种方法，含有乳化剂、香料、维生素和色素的油相被保持适当加热，温和搅动，以对油的质量不造成不利影响。然后将水相和油相混合起来，加入螺旋式换热器(votatOT)。制备乳剂的更详细描述可见文献，例如，Moustafain:PracticalhandbookofSoybeanProcessingandUtilization;DavidR.Ericksoneditor,其是AOCSPress禾口UnitedSoybeanBoard的联合出版物。现在，加入健康促进化合物，例如植物甾醇/甾垸醇(phytosterols/stanols)或花生四烯酸的涂抹酱正越来越受欢迎。因为它们是油可溶的化合物，因此，酶在水相中的稳定性不会被这些化合物影响。因此，本发明涉及制备含有本发明的酶制剂的食物产品的工艺，其中，在对所述食物产品进行巴氏灭菌之前或之后向食物产品中加入脯氨酸特异性蛋白酶。原则上，能水解涉及脯氨酸残基的肽键的其它酶，例如，脯氨酰寡肽酶(EC3.4.21.26)或二肽基肽酶IV(DPPIV，EC3.4.14.5)或二肽基肽酶II(DPPII，EC3.4.14.2)也可使用。这些蛋白酶已由例如Augustyns等人(CurrentMedicinalChemistry,2005，12，971-998)列出。然而，为使脯氨酸特异性蛋白酶适于作为食物产品(含麸质食物或意欲与含麸质食物组合使用的食物产品)中的消化助剂，脯氨酸特异性蛋白应当0展示出允许在胃中主要的酸性pH值下有充足活性的pH最优值，优选低于pH5;ii)在上述酸性条件下，存在胃肠蛋白水解酶胃液素的时候能够存活；iii)在含水环境中，至少在食物产品的保质期内保持活性。此外，还可能包括进辅酶，以获得针对麸质蛋白水解的协同性。明显地，辅酶必须满足与食物产品中脯氨酸特异性酶相同的稳定性要求。本发明还涉及将脯氨酸特异性蛋白酶作用作为消化助剂，用于对上文所述的具有至少0.85的水分活度的经巴氏灭菌食物产品的生产中，以预防乳糜泻症或与之相关的病症的临床症状。优选地，食物产品被意欲用于与含麸质食物产品组合消费。乳糜泻症是对某些富含脯氨酸和谷氨酰胺的肽的不耐受导致的。对这些肽的不完全降解导致乳糜泻症的发展和严重性。乳糜泻症偶尔伴随精神和神经方面的症状。在1979年，Panksepp(TrendsinNeuroscience1979;2:174-177)就己提出了阿片肽过量理论，其中，他提出，被扰乱的阿片肽代谢是孤独症发病机理的一部分。因此，含有本发明的内蛋白酶的食物产品还可被遭受精神性病症的患者使用，所述病症包括孤独症、精神分裂症、ADHD、双相性障碍和抑郁症，这些全部都与对富含脯氨酸的膳食蛋白的消费相关。与乳糜泻症相关的其它病症包含自身免疫性疾病，尤其是I型糖尿病、疱疹样皮炎、肠癌、肠非霍奇金淋巴瘤、自身免疫性甲状腺炎、胶原病、自身免疫性脱发症和自身免疫性肝炎。此外，肠易激综合征(IBS)已经与难于消化的富含脯氨酸的蛋白序列联系起来。可从本发明受益的患者可能遭受上述任何病症。这些患者可以是任何年龄的，包括成年和儿童。儿童会从预防益处中特别受益，因为预防对毒性麸质肽的早期暴露可预防疾病的最初发展。弓1入脯氨酸特异性内蛋白酶制剂对于这类患者尤其有好处，因为佐料，特别是蛋黄酱和茄汁是该群体所欢迎的。可通过针对先天易感的遗传测试，例如，通过HLA分型、通过家族病史、通过T细胞检验或者通过其它医药手段，来鉴定适合进行预防的儿童。图例图1:从"胃"中回收的T-细胞刺激表位的水平(没有脯氨酸特异性内蛋白酶)。条件在实施例3中解释。指具有反应活性的a-麸朊分子的水平，"y'指具有反应活性的7-麸朊分子的水平，"HMW"指具有反应活性的高分子量-麦谷蛋白的水平，"LMW"指具有反应活性的低分子量-麦谷蛋白的水平。图2:从"胃"中回收的T-细胞剌激表位的水平(含有脯氨酸特异性内蛋白酶)。条件在实施例3中解释。关于"a"、"7"、"HMW"和"LMW"的解释见图1。图3:从"胃"中回收的T-细胞刺激表位的水平(有和没有加入的脯氨酸特异性内蛋白酶，在用抗a-麸朊的Western印迹杂交中测试)。条件在实施例3中解释。图4:在53。C使低脂涂抹酱熔融，向水相中加入脯氨酸特异性内蛋白酶，以及在53。C对水/脂肪混合物进行10、70和IOO分钟的振荡之后，水相中残余的酶活性百分比。条件在实施例4中解释。图5:在多种温度下保持的低脂涂抹酱水相中脯氨酸特异性内蛋白酶的保质期。条件在实施例5中解释。材料和方法酶活性测试用CBZ-Gly-Pro-pNA(Bachem,Bubendorf，Switserland)作为底物，于37。，在柠檬酸盐/磷酸二钠缓冲液pH4.6中，对Am'ger脯氨酸特异性内蛋白酶活性加以测试。在405nm对反应产物进行分光光度监测。405nm处吸光度随时间的增加是酶活性的量度。脯氨酸蛋白酶单位(PPU)被定义为在规定的条件下，0.37mMZ-Gly-Pro-pNA的底物浓度下，每分钟释放出1^imol对硝基苯胺的酶的量。对T细胞刺激性表位的定量检测使用基于单克隆抗体(mAB)的竞争检验，对动态胃肠体外模型的可溶级分中麸朊和麦谷蛋白的T细胞剌激性表位的浓度加以测定。为达到该目的，在含有50mMNa2HP04/NaH2P04pH7.0、150mMNaCl、0.1%Tween-20和蛋白酶抑制剂混合物(Complete,RocheDiagnosticsGmbH,Penzberg,Germany)的缓冲液中稀释样品。检验都按照前文所述双份重复进行(Spaenij-Dekkingetal，(2004)53，1267-1273)。通过IDSDS-PAGE和Western印迹杂交进行蛋白分析为测定动态胃肠体外模型的不同样品固体(沉淀)级分中T细胞剌激性表位的水平，进行IDSDS-PAGE实验。将固体级分溶解于6x蛋白样品缓冲液(60%甘油、300mMTris(pH6.8)、12mMEDTApH8.0、12%SDS、864mM2-巯基乙醇、0.05%溴酚蓝)中，在12.5%SDS-PAGE凝胶上跑。直接用ImperialProteinStain(Pierce,RockfordIL，USA)对蛋白进行观察，或者在用对来自ot-麸朊和Y-麸朊(Spaenij-Dekkingetal,(2004)Gm53，1267-1273)禾QHMW-麦谷蛋白和LMW-麦谷蛋白(Spaenij-Dekkingetal.,Gastroenterology2005;797-806)的刺激性T细胞表位特异的mAb在PVDF膜上进行Western印迹杂交之后，对蛋白进行观察。基于抗体的竞争检验为进行基于抗体的检验，在BalbC小鼠中，针对已知的T细胞剌激性a-麸朊、y-麸朊和LMW麦谷蛋白肽，产生单克隆抗体。将小鼠的脾与小鼠骨髓瘤细胞系融合后，获得产生抗体的杂交瘤。通过有限稀释来对它们加以克隆，对这些细胞分泌的mAb加以测试，所述测试针对它们在mAb竞争检验中的用途来进行。针对每种特异性，选择两种合适的mAb，对不同mAb识别的表位加以测定(表l)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>用mAb来发展竞争检验，由此可以低水平定量检测出在完整蛋白和大小为大约ll个氨基酸的小肽(T细胞表位的大小)中都存在的T细胞刺激性表位。在竞争检验中，将样品的不同稀释液与固定浓度的生物素化的指示肽(其编码T细胞表位)混合。为对麸朊检验加以定量，使用浓度范围为10pg/ml-10ng/ml的欧洲麸朊标准物IRMM-480来制作标准曲线。用范围为1吗/ml-1ng/ml的编码T细胞刺激性表位的合成肽，来对针对LMW麦谷蛋白的检验加以定量。而用范围为1(ig/ml-1ng/ml的重组HMW麦谷蛋白胃蛋白酶/胰蛋白酶消化物，来对针对HMW麦谷蛋白的检验加以定量。通过经标记的链亲和素观察被生物素化的肽结合的抗体的存在。实施例1对脯氨酸特异性内蛋白酶的过滤灭菌过滤是对酶加以灭菌的优选选择。可在色谱纯化之后获得将被灭菌的酶溶液，酶溶液可包含一种或多种溶剂或者其它添加剂，以调节酶活性，以及以进一步对酶加以稳定。合适的稳定剂例如山梨糖醇和甘油。甘油溶剂可以以酶溶液的IO至70w/w。/。的浓度加入，或者更优选地，30至60%w/w。可通过将酶溶液泵经灭菌过滤器来实现过滤灭菌。优选地，通过预过滤接着进行滤经0.22nm过滤筒的第二次过滤来进行过滤灭菌。通过灭菌计量设备，将由此灭菌的酶溶液加入容纳容器中，所述容器含有之前已经巴氏消毒或灭菌的水性食物产品或食物成分。含酶的产品或食物成分可被直接包装。如果酶溶液必须被并入脂肪涂抹酱或低脂涂抹酱，那么经灭菌的酶溶液可以与经巴氏灭菌的水相混合，然后再在合适的、升高的温度下用脂肪或油对其进行乳化。为获得用于实验室规模的灭菌酶溶液，通过下述流程对从Am'ger获得的脯氨酸特异性内蛋白酶溶液加以过滤灭菌。将lml酶浓縮物装入注射器，将灭菌过滤器(来自Millipore的表面积为4.91cm2的MillexGV0.22/mi)放到注射器顶部。用手压后，酶溶液被压流经0.22ym的Millipore过滤器，由此提供酶活性与过滤灭菌前的酶溶液活性相应的经灭菌溶液。实施例2在存在和不存在脯氨酸特异性内蛋白酶时，在动态胃肠体外模型中消化面包食物经过胃肠道是非常动态的过程，其不能在体外模型中被静态模拟。TNO(Zeist，TheNetherlands)开发的动态胃肠体外模型是有效的消化模型，其能高度模拟胃和小肠中连续的动态过程(Minekusetal,ATLA1995,23，197-209;Larssonetal,JSciFoodAgic1997，74，99-106)。这些模型中获得的结果显示了与在人和动物中进行的研究获得的结果非常好的相似性。为测试在存在和不存在源自A^ger的脯氨酸特异性内蛋白酶的情况下白面包的消化情况，在该动态胃肠模型中进行实验。这些实验在摄取了半固体食物后的年轻成人的胃肠道平均生理条件下进行。面包首先被"咀嚼"，即在存在或不存在(参照)来自Am'gw的脯氨酸特异性内蛋白酶的情况下与唾液酶仔细混合5分钟。在实际的实验中，在存在或不存在100PPU脯氨酸特异性内蛋白酶的情况下，将70克白面包(含有5克麸质)与11ml胃液一起均质。均质后，将混合物的25%加入体外消化系统。"吞咽"的唾液酶(淀粉酶)立即出现，而胃的酶(胃蛋白酶和胃脂肪酶)则逐渐分泌。胃蛋白酶在低于5.0的pH下开始变得有活性。在2.5小时中，胃的内容物逐渐通过"幽门瓣"释放迸小肠。在十二指肠区室中，通过分泌碳酸氢盐将pH控制为pH6.5。胰液(含有淀粉酶、脂肪酶和蛋白水解酶(例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶))和胆汁逐渐分泌进十二指肠区室。分泌产物通过蠕动混合，混合经过来自胃的食物，并逐渐转进空肠和回肠区室。4-5小时后，小肠内容物的大约80%逐渐通过"回盲瓣"被递送进"大肠"(采样瓶)。经消化的化合物经由半透中空纤维膜系统从空肠和回肠区室被持续渗析出来。渗析瓶每2小时更换一次。在麸质蛋白(和食物)经过动态系统的区室过程中，在下述时间点，从胃、十二指肠和空肠区室取大约2ml的小样t=0、15、30、45、60、90、120、150、180和240分钟。采集后立即在干冰上对样品进行冷冻，以终止酶活性。在每项实验的末尾，在干冰上采集多种区室中的残余物，在零下20°C贮藏于两支10ml试管中。实施例3针对毒性麸质表位的存在对体外消化的面包加以测试有两种类型的试剂可用于测量食物样品中麸质肽的存在从乳糜泻症患者的小肠分离出来的T细胞克隆和特异于多种麸质肽的单克隆抗体。当麸质肽与易导致疾病的HLA-DQ2或HPA-DQ8分子结合后，T细胞克隆就对麸质肽产生应答。这些炎性T细胞应答被认为是乳糜泻症的主要病因。特异于ot-麸朊、Y-麸朊、LMW麦谷蛋白和HMW麦谷蛋白中的肽的T细胞克隆是可获得的(c.f.Walvande,Y.etal.，Eur.J.Immunol.29,3133-3139(1999)和Vaderetal.，Gastroenterology,122:1729-1737(2002))。特异于T细胞刺激性a-麸朊、Y-麸朊和低分子量(LMW)麦谷蛋白肽和高分子量(HMW)麦谷蛋白肽的单克隆抗体也是可获得的，其已被包括进竞争检验，用于检测食物样品中的这些肽(Spaenij-Dekkingetal.,Gut，53:1267-1273(2004))。在时间点t=0、15、30、45、60、90和120分钟收集、并且在加入和不加入脯氨酸特异性内蛋白酶的情况下制备胃和十二指肠级分，按照下述方案对其进行预处理，以使脯氨酸特异性内蛋白酶失活。首先使用1MNaOH将样品pH升高至11-12，然后立刻使用1MHC1进行中和。在14000rpm离心10分钟之后，收集多种样品的沉淀团和上清液，在85。C加热10分钟，以终止任何残留的酶活性。在20mM磷酸盐缓冲液pH7，150mMNaCl、0.1%Tween-20、2x蛋白酶抑制剂混合物(没有EDTA)中，制备上清液的1:40、1:200、1:IOOO和l:5000稀释液。这些稀释液和沉淀团级分都被贮藏于-20。C，直到第二天的测量。对样品解冻之后，在竞争检验中，使用特异于a-麸朊、Y-麸朊和特异于LMW-麦谷蛋白和HMW-麦谷蛋白的单克隆抗体，对样品的水溶性级分加以测试。为实现此目的，按照"材料和方法"一节所述，对样品进行处理，对若干稀释液加以测量。采用这些水溶性胃样品获得的结果示于图1(在没有脯氨酸特异性内蛋白酶的情况下产生的)和图2(在有脯氨酸特异性内蛋白酶的情况下产生的)中。除了HMW-麦谷蛋白的例外之外，其它所有麸质组分都可被检测到。获得的数据清楚表明，加入来自A的脯氨酸特异性内蛋白酶对于可溶级分中这些麸质蛋白的存在具有显著的影响甚至在t=0(即，向口服制剂中加入酶后不到1分钟)时都可观察到麸质蛋白/肽存在的强烈减少。在另一项实验中，对胃样品的水不溶性级分(即，沉淀团)进行SDS-PAGE，之后将分离的蛋白转到PVDF-膜上。然后用ot-麸朊特异性抗体对这些膜染色(图3)。虽然抗体在没有脯氨酸特异性内蛋白酶的所有级分中都检测到了麸朊，但是加入脯氨酸特异性内蛋白酶使得在45分钟后的时间点时，信号强烈降低。在90和120分钟的时间点，在从存在脯氨酸特异性内蛋白酶的情况下消化的材料获得的胃样品中，几乎不能检测到任何麸朊。从这些数据可以推断出一旦麸质分子存在于水溶性级分中，那么脯氨酸特异性内蛋白酶对于破坏麸质分子是非常高效的。因为用于本检验的抗体是特异于比T细胞刺激所需要的氨基酸序列要短的氨基酸序列的，这表明用脯氨酸特异性内蛋白酶进行的处理导致水溶性级分中可能有害的麸质样分子的强烈降低。因为这些水溶性肽被认为会与那些与乳糜泻症相关的受体位点高效相互作用，因此用水溶性麸质级分获得的这些数据与体内状况高度相关。相当令人吃惊地，脯氨酸特异性内蛋白酶还能水解存在于水不溶相中的麸质分子。90分钟后，在用酶处理过的级分中不再能检测到麸朊分子，而对照样品中仍存在此类分子。本实施例中描述的结果合在一起表明根据本发明的脯氨酸特异性内蛋白酶能在模拟人胃中存在的条件的条件下降解麸质。此外，所述的酶可以非常高效地进行这一工作，使得几乎不留下任何毒性麸质表位。实施例4脯氨酸特异性内蛋白酶与低脂涂抹酱生产的相容性为测试脯氨酸特异性内蛋白酶是否能在升高的温度下暴露给乳化剂并且并入水/油乳剂的情况下保持活性，进行下述测试。在当地超市购买WinnerFoodBV,L叩ik,TheNetherlands生产的低脂涂抹酱"Halvarinevooropbrood"(40%脂肪)。列出的成分是作为乳化剂的脂肪酸单甘油酸酯和二甘油酸酯(E471)，作为防腐剂的山梨酸(E200)，柠檬酸，植物油和脂肪，水、香料、维生素A和D和盐。在振荡恒温箱中测试低脂涂抹酱的熔融性质。在53°C低脂涂抹酱完全液化，导致水性层和脂肪层的缓慢分离。为将足够量的脯氨酸特异性内蛋白酶包括进低脂涂抹酱，在50mlGreiner管中对含有大约10PPU/ml(关于酶的定义，参见"材料和方法")的15ml液体酶浓縮物进行冷冻干燥。将干燥的粉末(大约2.25克)与25克低脂涂抹酱混合，之后在振荡恒温箱中于53°C使混合物熔融，由此溶解经冷冻干燥的酶粉末。在熔融和水/脂肪自发分离后立刻从水层取样(300^U)进试管，冷却至室温。第一次取样后，对含有液化乳剂和酶的试管进行10秒钟的剧烈振荡，放置于53°C。10、70和100分钟后，再次从水性层取300pl样品，取样后接着进行剧烈振荡。最后用pH4.2的100mM乙酸盐缓冲液对从水性层获得的所有样品进行1000倍的稀释，在微滴定板(MTP)检验中测量残留的酶活性。为达到此目的，于40。C在TECANGeniosMTP读数计(Salzburg,Vienna)中，于405nm采用10分钟动力学测量，进行对合成肽底物Ala-Ala-Pro-pNA(Pepscan，Lelystad,TheNetherlands)的水解，产生三肽Ala-Ala-Pro和有颜色的pNA分子。使用底物Ala-Ala-Pro-pNA(而非Z-Gly-Pro-pNA)，因为Ala-Ala-Pro-pNA允许对小得多的酶的量加以测量。每个孔含有250底物溶液、3mMAAP-pNA(处于pH4.2的100mM乙酸盐缓冲液)中，在TECANGeniosMTP读数计中于40°C对其进行10分钟的预加热。通过加入50pl合适的酶稀释液(在该情况下，1000倍)来开始反应。pNA分子的释放进行15分钟。用Magellan软件(Tecan)来进行数据采集。记录405nm处光密度的增加，在Excel中对其进行进一步处理，产生图4所示的图。涂抹酱熔融后脯氨酸特异性内蛋白酶的即刻活性被定义为100%。如这些结果所示，在53°C时，酶活性基本不被低脂涂抹酱环境所影响。甚至对熔融的涂抹酱加以振荡以模拟乳化过程，也没有影响或仅有极少影响，虽然会产生过多的泡沫。实施例5脯氨酸特异性内蛋白酶在低脂涂抹酱水相中的耐贮藏性为测试脯氨酸特异性内蛋白酶在低脂涂抹酱水相中的耐贮藏性，制备含乳酸的水相，其具有4.5的pH和0.98的水分活度。为防止水相的微生物污染，在无菌条件下加入苯甲酸钠的浓縮溶液，达到600ppm的浓度。然后在无菌条件下加入经灭菌过滤的脯氨酸特异性内蛋白酶，达到15PPU/克的酶活性。然后将该溶液分装进大量的小灭菌管。其中一些小管放置于零下20。C用作为参照，其它小管放置于8。C和30°C。每隔数周测量若干小管中残留的脯氨酸特异性酶活性。按照"材料和方法"章节详细描述的流程来测量酶活性。如图5所示的结果表明，如果被放置于8。C的环境温度下，酶在这样的高aw条件下能在至少50周的时间内保持完美的活性。实施例6用含酶的树莓浇料对吐司面包进行体外消化为阐释使用含酶的浇料来促进对食物中毒性麸质分子破坏的概念，进行下述实验。首先，制备250ml耐贮藏树莓浇料。向204g液体酶浓縮物(12PPU/ml)中加入20.7克蔗糖、1.0克拧檬酸、0.02%树莓香料(Givaudan,76525-36)和20.7g0.5%的糖精水溶液。各种成分溶解后，加入3.11克黄原胶(KeltrolRD,CPKelco,，Il)，通过仔细搅拌使其溶解。粘性物质的最终pH为3.7，最终的酶浓度为大约9.8PPU/g浇料，最终的水分活度为大约0.99。将苯甲酸盐浓度调节至大约600ppm。以同样的方式，制备空白产物，其含有提到的所有成分但是不含活性的脯氨酸特异性酶。作为先前实验的对照(见实施例2和实施例3)，还在测试中包括进了纯的、未增稠的酶溶液。为测试这些不同制备物在降解毒性麸质表位中的效力，进行体外消化测试，其中，多种表位的消失及时发生。为达到此目的，向每片(大约10克，含有1.4g蛋白质)可商业获得的、烘烤的白小麦面包(Bolletje,"Engelsetoast")应用各种存在形式的酶。由此一片被含酶的树莓浇料覆盖，一片被空白浇料(不存在酶活性)覆盖，并且向一片上加入纯的液体酶。在用含酶浇料和纯的液体酶时，添加的酶活性都等于20PPU/g存在的蛋白。在面包上应用各种产品5分钟之后，切碎面包，将其与60ml(对于对照和酶的液体种类而言)禾Q62.3ml(对于凝胶制剂而言)pH5.0的胃液模拟溶液(NaCl(4.8g/L、KC1(2.2g/L)、CaCl2(0.22g/L)和NaHC03(1.5g/L))混合，将含有来自猪胃的胃蛋白酶(Sigma，P-7012)的2.3ml同样的溶液以500KU/L的浓度加到每种面包上。在O分钟获得第一份样品(即，加入胃蛋白酶溶液后5分钟)。然后将每种混合物的pH逐渐降低，以模拟胃内容物的缓慢酸化。pH从pH5降低至pH4.5，第一次取样之后15分钟，取第二份样品。在下一个15分钟内，pH降低至pH4，在从实验开始起算30分钟时，取第三份样品。按照下文所述取后续样品:t=45分钟(pH降低至3.5后)；t=60分钟(pH降低至3.0后)；1=90分钟(pH降低至2.5后)；然后pH降低至2.0，在120分钟再取样，最后在150分钟取样。所有样品都立刻冷冻于液氮中，之后贮藏于-80。C。为测量多种制备物中残留的麸质表位水平的水平，首先对冷冻的样品进行完全的酶失活程序。将冷冻的样品加热至95摄氏度，30分钟，然后将样品的pH升高至11-12，然后降低至2，最后中和至pH6。然后再在95摄氏度对样品加热15分钟，之后取1ml小样，在Eppendorf离心管中离心30分钟。得到的上清液含有水溶性级分，沉淀团含有非水溶性级分。按照Spaenij-Dekkingetal，(2004)Gut53,1267-1273(还见"材料和方法"章节)，使用基于单克隆抗体的竞争检验，来定量水溶性级分中残留的T细胞刺激性表位的水平。这些竞争检验的结果(两次独立测量测得的平均值)示于表2中。Western印迹杂交后，观察沉淀团级分中T细胞刺激性表位的残留水平(见实施例3)。与针对水溶性级分获得的数据类似，后一实验中的结果(照片未示出)证实了两种含酶制备物对多种T细胞刺激性表位的有效破坏。总而言之，获得的数据清楚表明，在类似胃的条件下孵育大约30分钟的情况下，两种含酶制备物(纯的游离形式的酶或者具有高水分活度的凝胶化果酱状产品)都能有效破坏大多数T细胞刺激性麸质表位。在目前的(体外)实验设置中，仅LMW(低分子量)级分看起来对酶促降解有一定抗性。表2:水溶性级分中残留的T细胞刺激性表位(以微克/毫升表示)的水平<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>权利要求1.一种经巴氏灭菌的食物产品，其具有至少0.80的水分活度，优选至少0.85，并且包含脯氨酸特异性蛋白酶。2.—种食物产品，其具有至少0.80的水分活度，优选至少0.85，并且包含脯氨酸特异性蛋白酶，其中，所述食物产品包含少于1w/wC/。的蛋白或肽。3.根据权利要求1或2所述的食物产品，其是不含麸质的食物产品。4.根据前述任意一项权利要求所述的食物产品，其是佐料、浇料、三明治馅料、酱料、饮料或乳剂，例如涂抹酱。5.根据前述任意一项权利要求所述的食物产品，其是低脂涂抹酱。6.根据前述任意一项权利要求所述的食物产品，其中，所述脯氨酸特异性蛋白酶在1至7之间的pH值下具有最优活性，优选在2至6之间的pH值下具有最优活性。7.根据前述任意一项权利要求所述的食物产品，其中，所述脯氨酸特异性蛋白酶源自^^er^7/w或者属于丝氨酸蛋白酶的S28家族。8.—种工艺，用于制备根据前述任意一项权利要求所述的食物产品，其中，向所述食物产品中加入脯氨酸特异性蛋白酶，接着对所述食物产品进行巴氏灭菌。9.一种工艺，用于制备根据权利要求1或2-6所述的食物产品，其中，向经过巴氏灭菌的食物产品中加入脯氨酸特异性蛋白酶。10.根据权利要求8或9所述的工艺，其中，向经过巴氏灭菌的食物产品中加入灭菌的脯氨酸特异性蛋白酶。11.脯氨酸特异性蛋白酶在生产经巴氏灭菌的根据权利要求1-7中任意一项所述的食物产品中的用途。12.根据权利要求11所述的脯氨酸特异性蛋白酶的用途，用于防止富含脯氨酸的食物导致的任何有害影响。13.根据权利要求11所述的脯氨酸特异性蛋白酶的用途，用于防止乳糜湾症或与其相关的病症的临床症状。14.根据权利要求11至13所述的用途，其中，所述食物产品是意欲与含麸质食物一起消费的。15.根据权利要求12或13所述的用途，其中，所述有害影响或与乳糜泻症相关的病症包括自身免疫性疾病，尤其是I型糖尿病、疱疹样皮炎、肠癌、肠非霍奇金淋巴瘤、肠易激综合征、自身免疫性甲状腺炎、胶原病、自身免疫性脱发症和自身免疫性肝炎，以及精神病症，包括孤独症、精神分裂症、ADHD、双相性障碍和抑郁症。16.灭菌的脯氨酸特异性蛋白酶。全文摘要本发明涉及经巴氏灭菌的食物产品，其具有至少0.80的水分活度，优选至少0.85，并且包含脯氨酸特异性蛋白酶。文档编号A23J3/00GK101511211SQ200780004484公开日2009年8月19日申请日期2007年1月30日优先权日2006年2月2日发明者埃米尔·德德克,路泊·埃登斯申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司