专利名称：人非小细胞肺癌中的易位和突变的ros激酶的制作方法
技术领域：
本申请基本上涉及癌症中涉及的蛋白质和基因，本申请还涉及癌症的 检测、诊断和治疗。
背景技术：
许多癌症的特征在于导致细胞过程控制异常或者导致细胞生长和增殖 失控的细胞信号途径的破坏。这些破坏经常是由于特定的信号蛋白如激酶 的活性改变引起的。这些癌症中之一是非小细胞肺癌(NSCLC)。 NSCLC是 美国癌症患者死亡的首要原因，并且约占所有肺癌的大约87°/。。在美国每 年新增加约151,000名NSCLC患者，据估计仅美国每年因该病死亡的患者 超过120,000人。见"Cancer Facts and Figures 2005，" American Cancer Society。 NSCLC包括三种不同的亚型，通常在转移后才能被检测到，因此 诊断后的两年内的死亡率为75%。
已知导致激酶融合蛋白异常信号活性的基因易位可以直接导致某些癌 症。例如，己直接证实BCR-ABL癌蛋白， 一种酪氨酸激酶融合蛋白，是人 慢性髓性白血病(CML)的致病因子。据发现在至少90-95%的CM病例中 LBCR-ABL癌蛋白是通过9号染色体上的c-ABL蛋白酪氨酸激酶的基因序 列易位到22号染色体的BCR序列上产生的，产生所谓的Philadelphia染色 体。参见如Kurzock等N.Engl. J.Med. 319:990-998(1988)。在急性淋巴性 白血病和AML病例中都能发现易位。
已经描述了导致突变或融合蛋白的基因易位也出现在许多其它的癌症 中。例如，Falini等，Blood 99(2): 409-426 (2002)，概括了已知出现在血癌 中的易位。到目前为止，仅描述了小量的存在于肺癌中的基因易位和突变 的蛋白，包括涉及Notch 3的t( 15; 19)的易位。参考Dang等，J. Natl. Can. Instit.
692(16): 1355-1357(2000)。在小细胞肺癌和非小细胞肺癌中都发现RNA结合 蛋白-6 (RBM-6)表达和/或活性缺陷。参考Drabkin等，Oncogene 8(16): 2589-97 (1999)。然而，到目前为止，还没有描述在人NSCLC癌症中涉及 蛋白激酶的易位。
在人的卵巢癌中己经发现SLC34A2表达和/或活性缺陷。参见Rangel 等，Oncogene 22(46): 7225-7232 (2003)。同样地，已描述了在成胶质细胞瘤 中由于FIG-ROS dd(6)(q21，q21)易位导致的ROS激酶表达缺陷。参见 Charest等，Genes Chromos. Canc. 37(1): 58-71 (2003)。还描述了能够在小鼠 中驱动肿瘤生长的ROS激酶的截短形式。参见Birchmeier等，Mol. Cell. Bio. 6(9): 3109-3115 (1986)。到目前为止，在ROS激酶中还没有己知的激活点突 变。
鉴定人癌症中的易位和突变是非常需要的，因为这可以开发靶向所述 融合或突变蛋白的新的治疗剂和鉴定具有所述基因易位的患者的新的诊断 剂。例如，BCR-ABL已经成为用于开发治疗白血病的治疗剂的靶。最近， Gleevec (Imatinib mesylate, STI-571), —种ABL激酶的小分子抑制剂， 已经被批准用于治疗CML。这种药是最先设计干扰促进癌细胞生长的信号 途径的新的抗增殖药。这种药物的发展表现出比传统用于CML和ALL的 治疗方法、化疗和放疗显著的进步，传统用于CML和ALL的治疗方法、 化疗和放疗由于熟知的副作用令人苦恼，并由于它们不能特异性靶向导致 恶性肿瘤的根本原因从而经常导致有限的效果。同样地，为了鉴定患者最 可能应答的靶向抑制剂如Gleevec ,已经描述了特异性检测患者中 BCR-ABL融合蛋白的试剂和方法。
因此，还需要鉴定在人癌症包括肺癌如NSCLC发展中导致融合或突变 蛋白的新的基因易位，和需要发展用于研究和检测所述融合蛋白的新的试 剂和方法。鉴定所述融合蛋白能够使选择用于靶向治疗的患者以及筛选抑 制所述突变/融合蛋白的新药的新方法成为可能。
发明简述
根据本发明，在人非小细胞肺癌(NSCLC)中已经鉴定出新基因易位 (4pl5, 6q22),该易位导致了组合了钠依赖性磷酸盐转运蛋白同工型NaPi-3b 蛋白(SLC34A2)的部分和原癌基因酪氨酸蛋白激酶ROS前体(ROS)激酶的融合蛋白。估计这两种SLC34A2-ROS融合蛋白保留了 ROS酪氨酸激酶活 性并驱动表达所述融合蛋白的癌症亚型中NSCLC的增殖和存活。
因此，本发明部分提供了分离的多核苷酸和编码公开的突变ROS多肽 的载体、检测它们的探针和方法、分离的突变ROS多肽、重组突变多肽、 和检测突变ROS多核苷酸和多肽的试剂。公开的鉴定新的突变ROS激酶蛋 白和SLC34A2易位使检测在生物样品中存在突变ROS多核苷酸或者多肽 的新方法成为可能，使筛选抑制突变激酶蛋白的方法成为可能，以及使抑 制以表达突变ROS多核苷酸或者多肽为特征的癌症的发展的方法成为可 能，所述突变ROS多核苷酸或者多肽也由本发明提供。本发明的各个方面 和实施方案将在下文更详细地描述。
图1分别表示SLC34A2基因和ROS基因在染色体4p和6q的位置(A 组)，全长SLC34A2和ROS蛋白的结构域位置以及两个SLC34A2-ROS融 合蛋白变体的结构域位置(组B和组C)。在第一个变体(长的)中，融合 接头(fosion junction)位于ROS的跨膜结构域上游的第1750个残基处， 而在第二个变体(短的)中，接头位于第1853个残基处。
图2A是人SLC34A2-ROS融合蛋白第一个变体(长的)的氨基酸序列 (一个字母编码)(SEQIDNO: 1)(上组)，并指出了编码DNA序列(SEQ IDNO:2)(下组)；SLC34A2部分的残基为斜体，而ROS的激酶结构域的 残基为粗体。
图2B是人SLC34A2-ROS融合蛋白第二个变体(短的)的氨基酸序列 (一个字母编码)(SEQIDNO:3)(上组)，并指出了编码DNA序列(SEQ ID NO: 4)(下组)；SLC34A2部分的残基为斜体，而ROS的激酶结构域的 残基为粗体。
图3是人SLC34A2蛋白的氨基酸序列(一个字母编码)(SEQIDNO: 5) (SwissProt登录号为095436 X上组)，并指出了编码DNA序列(SEQ ID NO: 6) (GeneBank登录号NM—006424)(下组)；下划线部分是易位的残基。 图4A是人ROS激酶的氨基酸序列(一个字母编码)(SEQ ID NO. 7) (SwissProt登录号P08922);下划线的是第一个变体(长的)易位涉及的 残基，而下划线粗体的为第二个变体(短的)易位涉及的残基。图4B是人ROS激酶的编码DNA序列(SEQ ID NO: 8) (GeneBank登 录号NM—002944);下划线的是第一个变体(长的)易位涉及的残基，而下 划线粗体的残基为第二个变体(短的)易位涉及的残基。
图5是人NSCLC细胞系(HCC78)提取物的蛋白质印迹分析，该图表示 了具有比全长/野生型ROS低很多的分子量的ROS型的表达。
图6是通过5' RACE产物用ROS引物经历2轮PCR后检测ROS的凝 胶图；给出了所使用的引物(SEQIDNO: 13-15)。
图7是通过RT-PCR检测由SLC34A2和ROS易位形成的融合基因的凝 胶图；给出了两种变体(长的和短的)各自的外显子4/外显子32融合接头 的蛋白(和DNA)序列(SEQIDNO: 9和SEQIDNO: 10)和外显子4/外显子34 融合接头的蛋白(和DNA)序列(SEQIDNO:ll和SEQIDNO: 12)。
图8是表示SLC34A2基因中外显子1-4和ROS基因中的外显子32-34 的位置，这些外显子参与了形成融合蛋白的易位；箭头指出了用于PCR扩 增所述融合蛋白变体的引物位置，并且给出了引物序列(SEQ ID NO: 17-20)。
图9是表示SLC34A2-ROS融合蛋白(长(短)变体)在转染的293 细胞(人胚胎肾细胞)中表达的凝胶图，并与对照作比较(泳道1和2)。
图10表示在人NSCLC细胞系中siRNA对突变ROS激酶的抑制作用 A组表示在转染siRNA后细胞抑制图，B组表示ROS的特异性敲低 (knock-down)和增加凋亡(在突变ROS驱动的细胞系中)的免疫印迹，C 组是表示ROS下游的信号分子活性降低的免疫印迹。
图11是使用双色断裂-分离探针(2-colorbreak-a-part probe)通过FISH 特异性检测SLC34A2-ROS融合/易位(在人NSCLC细胞系中)的图像。
发明详述
根据本发明，以前已知的能导致突变激酶融合蛋白SLC34A2-ROS的基 因易位已在人非小细胞肺癌(NSCLC)中被鉴定，非小细胞肺癌是肺癌的亚 型。发生在染色体(4pl5)和染色体(6q22)之间的易位产生了两个融合蛋白变 体，该融合蛋白变体组合了钠依赖性磷酸盐转运蛋白同工型NaPi-3b蛋白 (SLC34A2)的N端和原癌基因酪氨酸蛋白激酶ROS前体(ROS)激酶的跨膜 和激酶结构域，其中所述钠依赖性磷酸盐转运蛋白同工型NaPi-3b蛋白是具有690个氨基酸的磷酸盐转运蛋白，所述原癌基因酪氨酸蛋白激酶ROS前 体激酶是具有2347个氨基酸的受体酪氨酸激酶。得到的SLC34A2-ROS融 合蛋白分别具有724个氨基酸(长的变体)和621个氨基酸(短的变体)， 估计这两种SLC34A2-ROS融合蛋白保留了激酶活性并驱动表达所述融合 蛋白的人NSCLC肿瘤亚型的增殖和存活。
尽管一些导致涉及ROS激酶的异常融合蛋白的基因易位己被描述，包 括在成胶质细胞瘤中FIG-ROS dd(6)(q21，q21)的易位(参见Charest " (2003)，同上.)和ROS的截短的活性型式(参见Birchmeier"al.，同上.)，最 近公开的SLC34A2-ROS易位和融合蛋白是新的，该融合激酶是第一次被报 道存在人NSCLC。 SLC34A2是磷酸盐转运蛋白，在人肺和小肠中表达，其 具有钠依赖活性。在卵巢癌中已发现SLC34A2表达和/或活性缺陷。参见 Rangel等，同上。ROS是跨膜受体酪氨酸激酶，属于胰岛素受体亚家族 (subfamily),参与了细胞增殖和分化过程。ROS在人、各种不同组织的上 皮细胞中表达。在成胶质细胞瘤和中枢神经系统的肿瘤中己发现ROS表达 禾口/或活性缺陷。参见如Charest等(2003),同上。
如下文进一步的描述，目前已分离和测序了 SLC34A2-ROS易位基因和 融合蛋白，并已经制备了表达突变激酶蛋白的cDNA。因此，本发明一部分 提供了编码SLC34A2-ROS融合多肽的分离多核苷酸，能与所述多核苷酸杂 交的核酸探针，以及使用所述多核苷酸制备重组突变ROS多肽的方法、载 体和宿主细胞。本发明另一部分还提供了包括编码SLC34A2-ROS融合多肽 的氨基酸序列的分离的多肽、重组突变多肽和能特异结合和/或检测 SLC34A2-ROS融合多肽但不结合或者检测野生型SLC34A2或野生型ROS 的分离的试剂。本发明的这些方面将在下文进一步详细地描述，这些方面 对于进一步研究由突变ROS激酶表达/或活性所驱动的癌症机制以鉴定肺 癌和以SLC34A2-ROS易位和/或融合蛋白为特征的其它癌症特别有用，在 下文中还将进一步描述本发明的实施方法。
鉴定新的ROS激酶突变体和易位对于有效地诊断和治疗以易位和/或 融合蛋白为特征的疾病如NSCLC具有非常重要的意义。NSCLC是美国癌 症患者死亡的主要原因，NSCLC难以诊断，经常在转移后才能被诊断，从 而增加了有效治疗和治愈该疾病的难度。因此，NSCLC在诊断后两年内的 死亡率为75%。参见American Cancer Society,同上。尽管目前耙向EGFR-抑制剂己被批准用于治疗NSCLC，但是据估计这种治疗对于患有表达突变 ROS激酶(不是或者除EGFR外)并受该激酶部分或全部驱动的肿瘤的患者 可能部分或完全无效。
因此，在NSCLC中由于基因易位导致形成、预期能驱动NSCLC肿瘤 亚型的增殖和存活的SLC34A2-ROS融合蛋白的发现使准确鉴定哺乳动物 肺癌(如NSCLC)以及表达SLC34A2-ROS融合蛋白或截短的ROS激酶的 其它癌症的重要新方法成为可能。这些肿瘤很可能对突变ROS激酶的激酶 活性的抑制剂起反应。尽可能早地鉴定受突变ROS激酶驱动的癌症的能力 将有力地支持在临床上确定哪种治疗剂或者组合哪些治疗剂对于特定患者 是最合适的，从而有助于避免开出靶向其他激酶的抑制剂的处方，而所述 其他激酶事实上不是驱动该癌症的主要信号分子。
因此，本发明部分地提供了采用本发明的融合特异性和突变特异性试 剂检测癌症中存在的SLC34A2-ROS易位(t(4，6)(p15, q22))和/或融合多肽的 方法。这种方法可以被用于例如鉴定癌症如NSCLC肿瘤，这种肿瘤可能对 突变蛋白的ROS激酶活性的抑制剂起反应。本发明还部分地提供了确定一 种化合物是否能抑制以SLC34A2-ROS融合多肽为特征的癌症的发展的方 法。本发明还提供了通过抑制突变多肽的表达和/或活性抑制表达 SLC34A2-ROS融合多肽的癌症的发展的方法。这些方法详细描述如下。
在下文中将更详细地描述本发明的其它方面、优点和实施方案。所有 引用的参考文献以全文并入本文参考。
定义
"抗体"是指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE， 包括其Fab或抗原识别片段，包括嵌合、多克隆和单克隆抗体。本文所使用 的术语"人源化抗体"是指为了与人抗体更相似在非抗原结合区的氨基酸被 取代但保留了原有结合能力的抗体分子。
术语"生物活性"是指具有天然存在分子的结构、调节或者生物化学功能 的蛋白质。同样，"免疫学活性"是指天然、重组或合成的SLC34A2-ROS融 合多肽或截短的ROS多肽、或者其任何寡肽能够在适当的动物或细胞中诱 导特异性免疫反应并结合特异抗体的能力。
术语"生物样品"采用其最广泛的意义，意指被怀疑含有SLC34A2-ROS 融合体或截短的ROS多核苷酸或多肽或其片段的生物样品，可以包括细胞、从细胞中分离的染色体(例如，伸展的中期染色体)、基因组DNA(在溶液中 或结合到固体支持物上如用于Southern分析)、RNA(在溶液中或结合到固体 支持物上如用于northern分析)、cDNA(在溶液中或结合到固体支持物上)、 细胞提取物、血液、尿、骨髓或组织等。
涉及癌症和突变ROS多核苷酸或者多肽使用的"以、、、为特征"是指存 在SLC34A2-ROS基因易位和/或表达的融合多肽的癌症，与之相对的是不 存在所述基因易位和/或融合多肽的癌症。所述融合多肽的存在可以全部或 者部分地驱动所述癌症的生长和存活。
"共有"是指一种核酸序列，其被重新排序以分辨不需要的碱基，或者是 使用XL-PCR (Perkin Elmer， Norwalk， Conn.)在5'和/或3'方向进行延伸并 重新排序，或者是用GELVffiW Fragment Assembly系统(GCQ Madison, Wis.)从多于一个Incyte克隆的重叠序列组装，或者被延长并进行了组装。
"ROS激酶抑制治疗剂"是指任何包含一或多种化学或生物化合物的组 合物，所述化合物直接或间接抑制单独存在和/或作为SLC34A2-ROS融合 蛋白的一部分的野生型或截短的ROS的表达和/或活性。
"衍生物"是指编码SLC34A2-ROS融合多肽的核酸序列或编码多肽本 身的化学修饰。这种修饰的实例可以是用烷基、酰基或氨基对氢进行取代。 核酸衍生物编码的多肽保留了天然分子的必要生物特性。
本文公开的多肽、多核苷酸或试剂中涉及的"可检测标记"意指化学、生 物或其它修饰，包括但不限于荧光、质量、残基、染料、放射同位素、标 记或标签修饰等，通过这些可检测感兴趣分子的存在。
SLC34A2-ROS融合多肽在生物样品中的"表达"意指与融合多肽不显著 表达的对照样品相比所述融合多肽显著表达。
"重同位素标记的肽"(与AQUA肽可交换使用)意指包含至少一种重同 位素标记的肽，该重同位素标记适合绝对量化或检测蛋白质，如 WO/03016861 、 "Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry" (Gygi et al.)所述，在下文还将进一 步讨论。关于所述AQUA肽涉及的术语"特异性检测"意指所述肽只检测和 量化含有AQUA肽序列的多肽和蛋白质，且基本上不检测不含有AQUA肽 序列的多肽和蛋白质。
"分离的"(或"基本上纯化的")是指离开天然环境的、被分离的或分开的核酸或氨基酸序列。其优选至少60%、更优选75%、最优选卯％或更高地 不含有与它们天然结合的其它成分。
"模拟物"是指结构源自SLC34A2-ROS融合多肽或其部分的结构的分 子，由此该分子能发挥与易位相关蛋白质样分子的一些或所有作用。
"突变ROS"多核苷酸或者多肽意指本文所述的SLC34A2-ROS融合多 核苷酸或者多肽。
"多核苷酸"(或"核苷酸序列")是指寡聚核苷酸、核苷酸、或者多核苷酸、 和其片段或部分；和指基因组或者合成的DNA或RNA，其可以是单链或 双链，可以代表有义链或反义链。
"多肽"(或"氨基酸序列")是指寡肽、肽、多肽、或蛋白质序列、和其片 段或部分；和天然存在的或合成的分子。本文中"氨基酸序列"是指天然存在 的蛋白质分子的氨基酸序列，"氨基酸序列"和类似术语如"多肽"或"蛋白质" 并不将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整天然氨基酸序列。
"SLC34A2-ROS融合多核苷酸"是指本文所述的基本上纯化的 SLC34A2-ROS易位基因产物或融合多核苷酸的核酸序列，所述易位基因产 物或融合多核苷酸从任何物种中获得，尤其是哺乳动物，包括牛、绵羊、 猪、鼠、马，并优选人；并可以从任何来源获得如天然、合成、半合成或 重组来源。
"SLC34A2-ROS融合多肽"是指本文所述的基本上纯化的 SLC34A2-ROS融合多肽的氨基酸序列，所述融合多肽从任何物种中获得， 尤其是哺乳动物，包括牛、绵羊、猪、鼠、马，并优选人；并可以从任何 来源获得如天然、合成、半合成或重组来源。
在提到抗体和蛋白或肽相互作用时的术语"特异性结合"(或者"特异性 结合"或"特异结合")意指所述相互作用依赖于蛋白质上特定结构(即抗原决 定簇或表位)的存在，也就是抗体识别并结合特异蛋白结构而不是一般蛋白 质。对于与不是特异性的序列或抗原决定簇的抗体结合的术语"不结合"意指 与抗体与抗体特异性的抗原决定簇或序列的结合相比基本上不反应。
关于序列或探针杂交条件的术语"严格条件"是指在大约Tm减去5X:(低 于探针或者序列的溶解温度的(Tm)5'C)到约低于L的2(TC-25"C的范围的 "严格性'，。典型的严格条件为在42。C在含有50%甲酰胺、5X,SSC(750 mMNaCl， 75mM拧檬酸三钠)、50 mM磷酸钠(pH 7.6)、 5XDenhardt's溶液、10%硫酸葡聚糖和20微克/毫升变性剪切鲑精DNA的溶液中保温过夜， 然后在约65'C用0.1XSSC的洗涤滤膜。本领域技术人员可以理解的是为 了鉴别或者检测相同或相关多核苷酸序列，可改变杂交的严格性。
SLC34A2-ROS融合多肽的"变体"是指一或多个氨基酸改变的氨基酸序 列。变体可以具有"保守"改变，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性 质，例如用异亮氨酸置换亮氨酸。在少数情况下，变体可以具有"非保守" 改变，例如用色氨酸置换甘氨酸。类似少量的改变还可以包括氨基酸缺失 或插入，或者二者。可以使用本领域已知的计算机程序例如DNASTAR软 件找到确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不丧失生物活性或 者免疫活性的教导。
A、人NSCLC中的突变ROS激酶的鉴定。
本文公开的新的人基因易位发生在人NSCLC的染色体(4pl5)和染色体 (6q22)之间，并导致了组合了 SLC34A2的N端(外显子1-4)和ROS的跨 膜结构域和激酶结构域(分别为外显子32-43或者外显子34-43)的两种变 体融合蛋白的表达，所述易位是在检测人一种肺癌亚型非小细胞肺癌 (NSCLC)的细胞系(HCC78)提取物中的总的磷酸化肽谱(profile)时被意外 地发现的。在图1中给出了涉及这种易位的染色体、基因和选择性剪接产 物(长的和短的)。
使用最近描述的从复杂混合物中分离和质谱表征修饰的肽的技术阐述 了这种细胞系的磷酸化谱。(参见美国专利
发明者A·波塞马托, 郭爱兰 申请人:细胞信号技术有限公司