专利名称：：癌症的检测与治疗的制作方法癌症的检测与治疗本发明涉及检测和治疗黑素瘤和皮肤癌的方法和组合物。更特别地，本发明揭示了BCSC-1表达在黑素瘤和皮肤癌细胞中改变，使得可以设计针对这种病变的有效检测方法和试剂盒。本发明还揭示了恢复或增加黑素瘤和皮肤癌细胞中BCSC-1的表达会抑制致肿瘤性，并且代表一种新的且有效的治疗黑素瘤和皮肤癌的方法。本发明可用于检测黑素瘤和皮肤癌的存在、阶段或类型，以及任何患所述疾病的倾向。本发明可用于任何哺乳动物对象，特别是人对象。黑素瘤是一种侵润性癌症，具有导致广泛转移的倾向。由于目前唯一成功的治疗是当肿瘤限于皮肤时进行切除，因此早期诊断是必需的。不幸的是，黑素瘤对常规的化疗在很大程度上具有抗性，迫切需要针对转移的黑素瘤的新治疗方法。为了研究色素性皮损和黑素瘤的基因表达谱，使用DATAS技术研究了良性痣和转移性黑素瘤的选择性剪接的全局分析。使用这种方法产生了良性痣-转移性黑素瘤的DATAS文库，其包括217个在良性痣与转移性黑素瘤之间差异表达的克隆。一些克隆通过实时PCR而进行了扫描，它们基于参与细胞凋亡、细胞周期、代谢等可能参与黑素瘤的进展。在这些基因中，我们鉴别了BCSC-1(Martinet.al.PNAS2003)在转移性黑素瘤患者中始终是被下调的。我们通过实时PCR在良性痣、非典型痣、原发黑素瘤或转移性黑素瘤患者的的70个皮肤活检样品中进一步研究了BCSC-1表达。结果示出在所有黑素瘤患者中BCSC、1表达与健康供体相比均降低。这些结果在进行分析的黑素瘤细胞系和所有黑素瘤患者中均得以证实。重要的是，当BCSC-1基因在黑素瘤细胞系中异位表达时，黑素瘤细胞终止增殖并经历细胞凋亡。BCSC蛋白在这些细胞中的表达通过Western印迹证实。另外，我们也揭示了当在体内注射时，BCSC-1降低转移性黑素瘤的小鼠模型中肺转移的数目。总之，本发明揭示了BCSC-1在皮肤癌中是被下调的，且在所述癌细胞中BCSC-1表达的诱导导致肿瘤进展的抑制。这些数据示出BCSC-1在黑素瘤和皮肤癌的发病机制中起关键作用，并且代表黑素瘤和皮肤癌的一种新的预后标志物以及药物开发的有价值靶位。本发明的第一个目的在于检测对象中黑素瘤或皮肤癌的存在、阶段或类型的方法，所述方法包括在体外或离体检测对象样品中改变的BCSC-1基因表达的存在情况，这种改变的BCSC-1基因表达的存在指示所述对象中黑素瘤或皮肤癌的存在、阶段或类型。根据本发明方法的特定实施方案，所述改变的表达是所述样品中BCSC-1基因的表达降低，更优选是所述样品中BCSC-1基因的长同种型表达降低。本发明的另一目的在于检测对象中癌症的存在、阶段或类型的方法，所述方法包括体外或离体地确定所述对象样品中BCSC-1基因或蛋白质的长同种型的(相对)量，所述量是所述对象中癌症的存在、阶段或类型的指示。在一个特殊的实施方案中，将确定的量与对照值或平均值进行对比，或者与在对照样品中测量的值进行对比。在另一个实施方案中，确定BCSC-1长同种型/BCSC-l短同种型的比率，这个比率的任何降低均是这种癌症的存在的指示。这种方法可用于检测任何癌症，特别是实体癌症。在这点上，本发明的另一目的在于检测对象中癌症的存在、阶段或类型的方法，所述方法包括体外或离体地确定BCSC-1长同种型/BCSC-l短同种型的比率，这个比率与对照条件或参考值或平均值相比降低则是这种癌症的存在的指示。这种方法可用于检测任何癌症，特别是实体癌症。本发明的另一目的在于检测对象中癌症的存在、阶段或类型的方法，所述方法包括体外或离体地确定所述对象的体液样品中BCSC-1蛋白的(相对)量，这个量是所述对象中癌症的存在、阶段或类型的指示。典型地，确定BCSC-1蛋白的长同种型的(相对)量，这个量与对照值或参考值相比降低是癌症存在的指示。在一个典型的实施方案中，所述体液样品得自(例如通过稀释、浓縮、纯化、分离等)全血、血清、血浆、尿液等。这种方法可用于检测任何癌症，特别是实体癌症。本发明的另一目的在于一种评价对象中黑素瘤和皮肤癌的治疗功效的方法，所述方法包括对比(体外或离体)在所述治疗之前与之后的对象样品中的BCSC-1基因表达，所述表达增加是对治疗的阳性应答的指示。本发明还涉及BCSC-1蛋白或者编码BCSC-1蛋白的核酸在生产治疗黑素瘤或皮肤癌的药物中的应用，以及相应的治疗方法。本发明还涉及BCSC-1激动剂在生产治疗黑素瘤或皮肤癌的药物组合物中的应用，以及相应的治疗方法。本发明的另一方面在于刺激BCSC-1基因表达的化合物在生产治疗黑素瘤或皮肤癌的药物组合物中的应用，以及相应的治疗方法。本发明还涉及治疗需要治疗的对象的黑素瘤或皮肤癌的方法，包括给予所述对象有效量的上述化合物。在一个优选的实施方案中，所述对象具有改变的BCSC-1基因表达。本发明进一步涉及选择对于黑素瘤或皮肤癌具有生物学活性的化合物的方法，所述方法包括选择模拟或剌激BCSC-1表达或活性的化合物的步骤。在一个特定的实施方案中，所述方法包括将测试化合物与包含报道构建体的重组宿主细胞接触以及选择剌激所述报道基因表达的测试化合物，所述报道构建体包含在BCSC-1基因启动子控制下的报道基因。所述皮肤癌可以选自基底细胞癌、鳞状细胞癌、Merkel细胞癌、原发性皮肤淋巴瘤，以及选自皮肤或相关表面组织的任何其它细胞增殖性疾病。BCSC-1基因表达可以通过本领域已知的任何技术检测，例如通过测序、选择性杂交、选择性扩增和/或特异性配体结合。在一个特定的实施方案中，本发明使用可以检测BCSC-1的长同种型、或者区分长与短同种型、或者测量长同种型/短同种型的比率的试剂和/或技术。本发明的另一方面涉及核酸引物，其可以(特异性)扩增BCSC-1的长同种型，或者可以区分长与短同种型。本发明的另一方面涉及核酸探针，其(特异性)杂交BCSC-1的长同种型，或者可以区分长与短同种型。本发明的另一方面涉及抗体(包括其衍生物及生产杂交瘤)，其(特异性)结合BCSC-1蛋白的长同种型或者可以区分长与短同种型。本发明进一步涉及包含上述引物、探针或抗体的试剂盒。这种试剂盒包含容器或支持物，和/或进行扩增、杂交或结合反应的试剂。本发明的一特定方面在于包含引物、探针和/或抗体的组合物，其被设计为特异性检测BCSC-1的至少一种同种型。附图简述图h色素性皮损的进展模型。图2:BCSC-1表达在黑素瘤患者中被下调。由实时PCR检测良性痣或黑素瘤皮损患者的皮肤活检组织中BCSC-1基因的RNA表达。值O表示这个基因在良性痣患者(健康供体)中的平均表达水平。具有转移性黑素瘤的所有患者与健康供体中的平均表达值相比均示出较低的表达水平(低约20倍)。图3:BCSC-1的长同种型在黑素瘤患者中被选择性下调。本领域己经描述了一些同种型。不同外显子的实时PCR分析示出仅在长同种型中存在的外显子(外显子13-18)是在黑素瘤患者中降低的外显子。图4:BCSC-1表达在黑素瘤患者和黑素瘤细胞系中被下调。所述结果在较大的患者群及在黑素瘤细胞系中被证实。BCSC-1基因的较长同种型的表达在黑素瘤患者和黑素瘤细胞系中明显降低。图5:BCSC-1的异位表达降低黑素瘤细胞增殖。黑素瘤细胞系用编码BCSC-1的慢病毒载体(lentivector)转导。表达BCSC-1的黑素瘤细胞与阴性对照相比阻止或显著降低其增殖。这种作用在也用BCSC载体转导的非黑素瘤细胞系(Hda)中未观测到。图6:BCSC-1的异位表达通过Western印迹和实时PCR证实。(左侧)BCSC-1蛋白的产生通过Western印迹证实，使用抗-HA抗体在用增加量(2和20nl)的编码BCSC-1的慢病毒载体转导的SK-Mel23细胞中在第12天证实，但是在空载体转导的细胞中无BCSC-l蛋白产生(C-)。用BCSC-1的长同种型和短同种型的载体转染的293T用作阳性对照，也用抗HA抗体检测BCSC-1。(右侧)实时PCR示出SK-Mel23细胞在转导之前及用空载体转导的第8天不表达可检测水平的BCSC-1。然而，用BCSC-1载体转导的SK-Md23细胞表达高水平的BCSC-1mRNA。图7:BCSC-1的异位表达阻断黑素瘤细胞系增殖。图8:BCSC-1阻断细胞周期G2-M期中的黑素瘤细胞。图9:编码BCSC-1的Hda细胞在细胞周期的G2和M期被停滞。A)用BCSC-1的短同种型转导的Hela细胞；B)用BCSC-1的长同种型转导的Hela细胞。图10:BCSC-1降低转移性黑素瘤的小鼠模型中的肺转移数目。发明详述黑素瘤的发生率不断增加。这是一种迅速蔓延的癌症，具有导致广泛分布的倾向。需要基于研究全局基因表达的新方法，以了解基本的黑素瘤发生事件。如图1所示，可以使用形态学技术分析良性痣(左侧)、发育不良性痣(中间)和恶性黑素瘤(右侧)之间的转变。然而，目前仅部分了解控制这些转变的分子机制。为了鉴别控制良性痣与黑素瘤之间转变的分子机制，我们选择使用称作DATAS(具有选择性剪接的转录体的差异分析)的基因表达谱技术研究色素性黑素瘤中的选择性剪接。通过这种全局基因表达分析，我们获得了得自肿瘤相关剪接事件的新序列。对从共70名患者的活检组织(包括良性痣(阴性对照)及不同阶段色素性皮损的活检组织)中提取的RNA进行实时半定量RT-PCR，我们可以证实BCSC-1在转移性疾病患者中被选择性下调。此外，我们可以鉴别BCSC-1的长同种型在黑素瘤中被选择性下调，而其短同种型基本不受影响。再者，用HA标记的编码BCSC-1的慢病毒载体在黑素瘤细胞系中的异位表达诱导这些细胞的增殖显著降低。总之，我们的结果鉴别了一种新基因(BCSC-1)，其在黑素瘤和皮肤癌中被选择性下调。仅是选择的这个基因的"长"同种型(c,f)在转移性黑素瘤中被下调，而"短"同种型看起来不受影响，由此可以开发更具特异性的诊断工具以检测转移性肿瘤中缺少的同种型。最后，异位表达减缓转移性黑素瘤细胞系的细胞增殖，提示BCSC-1在转移性疾病迸展中起作用。本发明因此提出使用BCSC-1基因和相应的表达产物来诊断及治疗黑素瘤和皮肤癌，以及用于筛选治疗活性药物。本发明因此可用于各种对象，特别是人，包括成人和儿童。定义在本发明中，术语"BCSC-1基因"是指细胞或生物体中所有BCSC-1核苷酸序列，包括编码序列、非编码序列、控制转录和/或翻译的调节序列(例如启动子、增强子、终止子等)，以及所有相应的表达产物如RNA(例如mRNA)。术语"基因"应解释为包括任何类型的编码核酸，包括基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)、合成或半合成DNA，以及任何形式的相应RNA。术语基因特别包括重组核酸，即例如通过装配、切割、连接或扩增序列而人工产生的任何非天然产生的核酸分子。基因典型是双链的，尽管也可以包括其他形式，如单链形式。基因可以得自各种来源，且可以根据本领域已知的各种技术获得，例如通过筛选DNA文库或者通过从各种天然来源中扩增而获得。重组核酸可以通过常规技术制备，包括化学合成技术、遗传工程技术、酶学技术或者所述技术的组合。BCSC-1基因序列可以在基因库中找到，例如NM—014622和NM一198315。也见SEQIDNO:14所示，其中外显子边界以粗体字表示，起始和终止密码子以下划线示出。术语"BCSC-1基因"包括上述任何编码序列的任何变体、片段或类似物。这些变体包括例如由于个体之间的等位基因变异而天然存在的变体(例如多态性)、突变的等位基因、选择性剪接形式等。术语变体还包括来自其它来源或生物体的BCSC-1基因序列。变体优选与上述编码序列基本同源，即具有至少大约65%的核苷酸序列相同性，典型具有至少大约75%相同性，优选具有至少大约85%相同性，更优选具有至少95%序列相同性。BCSC-1基因的变体和类似物典型包括与上述序列(或其互补链)在严格杂交条件下杂交的核酸序列。典型的严格杂交条件包括温度高于30°C，优选高于35°C，更优选超过42。C，和/或盐度低于大约500mM,优选低于200mM。杂交条件可以由技术人员通过更改温度、盐度和/或其它试剂如SDS、SSC等的浓度而调节。BCSC-1基因的片段是指上述序列的至少大约8个连续核苷酸的任何部分，优选至少大约15个核苷酸，更优选至少大约20个核苷酸，进一步优选至少30个核苷酸。片段包括长度在8-100个核苷酸、优选15-100个核苷酸、更优选20-100个核苷酸的所有可能的核酸。存在BCSC-1基因的一些同种型，其得自选择性剪接。在这点上，BCSC-1的长同种型和短同种型可以根据其保留的外显子(的数目)而定义。更特别地，BCSC-1基因组DNA包含18个外显子，其可以被选择性剪接。每个外显子的位置在SEQIDNO:14中标示出，并概括于下表中，其中位置参考SEQIDNO:14的cDNA序列而指定。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在本发明中，长BCSC-1同种型是包含外显子13-18的至少一个外显子的核苷酸序列或相应氨基酸序列的同种型。短BCSC-1同种型是不包含外显子13-18的任一外显子的核苷酸序列或相应氨基酸序列的同种型。长BCSC-1同种型的例子包含外显子1-13、1-14、1-15、1-16、1-17或1-18的核苷酸序列或相应的氨基酸序列。长同种型见NM—014622，其含有外显子11-18的所有外显子。相似地，缺失外显子8-16但含有外显子18的AY366504和AY366507描述的同种型在本发明中是长同种型。长同种型的其它例子在AY366508中揭示。BCSC-1蛋白是指由上述BCSC-1基因编码的任何蛋白质或多肽。术语"多肽"是指包含一段氨基酸序列的任何分子。该术语包括各种长度的分子，例如肽和蛋白质。所述多肽可以被修饰，例如通过糖基化和/或酰化和/或化学反应或化学结合进行修饰，并且可包含一或几个非天然或合成的氨基酸。BCSC-1多肽的特定例子包括NM—014622或NM—198315(也见SEQIDNO:13)中描述的所有或部分序列。检测/诊断本发明现在提供了基于监测对象中BCSC-1基因同种型的诊断方法。在本发明中，术语"诊断"包括在各个阶段包括早期、临床前期和晚期在成人或儿童中进行检测、监测、给药、对比等。诊断典型包括预后、评价患病倾向或发病的危险性、鉴定最适合对象的治疗方案(药物遗传学)等。本发明的一般目的在于检测对象中癌症的存在、阶段或类型的方法，所述方法包括在体外或离体检测对象样品中改变的长同种型BCSC-1基因表达的存在，这种改变的长同种型BCSC-1基因表达的存在是所述对象中癌症的存在、阶段或类型的指示。本发明的另一方面是检测对象中癌症、特别是实体癌症的方法，包括检测所述对象样品中BCSC-1长同种型，其表达的降低是癌症的存在、阶段或类型的指示。本发明的特定目的在于检测对象中黑素瘤或皮肤癌的存在、阶段或类型的方法，所述方法包括在体外或离体检测对象样品中改变的BCSC-1基因表达的存在，这种改变的BCSC-1基因表达的存在是所述对象中黑素瘤或皮肤癌的存在、阶段或类型的指示。本发明的另一目的是如上所述的方法，包括提供对象样品的第一个步骤。诊断剂用于分析和预测对治疗或药物的应答或者对治疗或药物的副作用，其可用于确定个体是否应该用特定的治疗药物进行治疗。例如，如果诊断剂表明个体对于用特定药物进行治疗将出现阳性应答，则该药物可以给予该个体。反之，如果诊断剂表明个体很可能对于特定药物的治疗将出现阴性应答，则可以改用另一种治疗方案。阴性应答可以解释为不存在有效的反应或者存在毒性副作用。改变的BCSC-1表达可以通过本领域已知的任何技术确定，例如在RNA或多肽水平确定。如本发明所揭示，BCSC-1表达在黑素瘤或皮肤癌细胞中被改变。更特别地，在黑素瘤或皮肤癌细胞中BCSC-1的表达水平与在非癌细胞中相比或者与平均值相比降低。更特别地，在癌细胞中长BCSC-1同种型的表达水平与在非癌细胞中相比或者与平均值相比降低。因此，在优选的实施方案中，本发明的方法包括检测BCSC-1基因、特别是其长同种型的表达水平降低的步骤。在典型的实施方案中，所述方法包括确定样品中BCSC-1RNA或多肽、特别是BCSC-1RNA或多肽长同种型的(相对)量的步骤，并将所述量与参考值或平均值对比或者与在对照组织(例如非癌细胞)中测量的值对比，其中较低的值是癌症存在的指示。在另一个特定的实施方案中，所述方法包括分别确定长BCSC-1RNA或蛋白质同种型/短BCSC-1RNA或蛋白质同种型的比率，这个比率与对照/参考值或样品相比的任何变化均是癌症存在的指示。尽管可以确定一些长同种型的(相对)量，但是测量仅一个长同种型或者确定一个长同种型/一个短同种型的比率即足够。这种测量可例如基于使用相应的探针或引物检测外显子13、14、15、16、17或18，或者使用特异性配体检测编码的氨基酸残基，如下文所述。另外，本发明还包含检测BCSC-1基因或多肽中与癌症相关的结构变化。BCSC-1基因或多肽中的这种变化可以是编码区和/或非编码区中单独或组合的任何形式的突变、缺失、重排和/或插入。突变更特别包括点突变。缺失可包含基因的编码区或非编码区中两或多个残基的任何区域，如缺失两个残基直至整个基因。典型的缺失影响较小的区域，如低于大约50个连续碱基对的结构域(内含子)或重复序列或片段，但是也可以出现较大的缺失。插入可包含在所述基因的编码区或非编码区中加入一或几个残基。插入可典型包含在所述基因中加入l-50个碱基对。重排包括序列的倒位。BCSC-1的结构变化可导致产生终止密码子、移码突变、氨基酸取代、特定的RNA剪接或加工、产物不稳定性、截短的多肽产生等。所述变化可导致功能、稳定性、靶向或结构改变的BCSC-1多肽产生。本领域已知的各种技术可用于检测或量化改变的BCSC-1表达，包括测序、杂交、扩增和/或结合特异性配体(如抗体)。其它合适的方法包括等位基因特异性寡核苷酸(ASO)、等位基因特异性扩增、Southern印迹(对于DNA)、Northern印迹(对于RNA)、单链构象分析(SSCA)、PFGE、荧光原位杂交(FISH)、凝胶移位、夹板变性梯度凝胶电泳、异源双链分析、RNase保护、化学错配裂解、ELISA、放射性免疫测定(RIA)和免疫-酶学测定(正MA)。扩增可以根据本领域已知的各种技术进行，例如通过聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)及基于核酸序列的扩增(NASBA)。这些技术可以使用可商购的试剂和方案进行。优选的技术使用等位基因特异性PCR或PCR-SSCP。扩增通常需要使用核酸引物以起始反应。用于从BCSC-1基因或RNA中扩增序列的核酸引物与BCSC-1基因或RNA的一部分互补且与其特异性杂交。可用于所有或部分BCSC-1基因或RNA的引物可以基于BCSC-1自身的序列设计。用于本发明中的最优选的引物可以扩增BCSC-1的长同种型，即含有与位于BCSC-1基因或RNA的外显子13-18任一外显子内的序列互补且与其特异性杂交的序列。在这方面，本发明还涉及核酸引物，所述核酸引物与位于BCSC-1基因或RNA的外显子13-18任一外显子内的序列互补且与其特异性杂交。这种引物的使用可以检测样品中BCSC-1基因或RNA的长同种型。本发明的典型的引物是长度为大约5-60个核苷酸、更优选大约8-25个核苷酸的单链核酸分子。该序列可以直接衍生自BCSC-1基因的序列。优选完全互补，以保证高度特异性。然而，容许存在一些错配。这种引物的特定例子在实验部分的表1中揭示(SEQIDNO:1-12)。本发明还涉及上述核酸引物或核酸引物对在检测对象中癌症的存在或者易患病倾向的方法中的应用，或者在评价对象对于癌症治疗方案的应答的方法中的应用。在另一个实施方案中，通过使用选择性杂交的技术进行检测。特定的检测技术包括使用特异于BCSC-1基因或RNA的核酸探针，随后检测杂交体的存在和/或(相对)量。所述探针可以于悬浮液中或者固定于基质或支持物上(如在核酸阵列或芯片技术中)。所述探针典型地被标记以便于检测杂交体。在这点上，本发明的一个特定实施方案包括将对象样品与特异于BCSC-1的长同种型的核酸探针接触，并评价杂交体的形成。在一个特定的实施方案中，所述方法包括将对象样品同时与分别特异于BCSC-1的各种长同种型的一系列探针接触。在本发明中，探针是指与BCSC-1基因或RNA(的靶部分)互补且能特异性杂交、并适于检测其在样品中的存在或者(相对)量的多核苷酸序列。探针优选与BCSC-1基因或RNA的序列完全互补。探针典型包含长度为8-1000个核苷酸的单链核酸，例如10-800个核苷酸、更优选15-700个核苷酸、典型为20-500个核苷酸。应了解也可以使用较长的探针。本发明优选的探针是长度为8-500个核苷酸的单链核酸分子，其可特异性杂交BCSC-1基因或RNA的外显子13-18任一外显子内包含的区域。特异性是指与靶序列杂交产生特异性信号，该信号有别于通过非特异性杂交产生的信号。优选完全互补的序列以设计本发明的探针。然而，应了解可以容许一定程度的错配，只要所述特异性信号有别于非特异性杂交产生的信号即可。所述探针的序列可以衍生自本发明提供的BCSC-1基因和RNA的序列。可以对所述探针进行核苷酸取代以及化学修饰。完成这种化学修饰可以增加杂交体的稳定性(例如嵌入基团)或者对所述探针进行标记。所述标记的典型例子包括但非限于放射性标记、荧光标记、发光标记、酶标记等。本发明还涉及上述核酸探针在检测对象中癌症进展的存在、类型或阶段的方法中的应用，或者在评价对象对于癌症治疗方案的应答的方法中的应用。本发明还涉及包含上述探针的核酸芯片。这种芯片可以通过本领域已知的技术原位产生或者通过保藏克隆而产生，且典型包含在基质上展示的核酸阵列，所述基质例如是(玻璃、聚合物、金属等)载玻片。如上文所述，BCSC-1基因表达中的变化也可以通过检测BCSC-1多肽的存在或(相对)量而检测。在这点上，本发明的一个特定实施方案包括将样品(其可包含生物学体液如血液、血浆、血清等)与特异于BCSC-1多肽的配体接触，并确定复合物的形成。可以使用不同类型的配体，如特异性抗体。在一个特定的实施方案中，将所述样品与特异于BCSC-1多肽的抗体接触，并确定免疫复合物的形成。可以使用各种检测免疫复合物的方法，如ELISA、放射性免疫测定(RIA)及免疫-酶测定(正MA)。15在本发明中，抗体是指多克隆抗体、单克隆抗体以及其基本具有相同抗原特异性的任何片段或衍生物。片段包括Fab、Fab'2、CDR区域等。衍生物包括单链抗体、人抗体、多功能抗体等。最优选的配体特异于BCSC-1的长同种型，即结合外显子13-18任一外显子编码的氨基酸序列中包含的表位。特异于BCSC-1多肽的抗体是指选择性结合BCSC-1多肽的抗体。更特别地，其是指对抗BCSC-1多肽或者其包含表位的片段而产生的抗体。尽管可以发生对于其它抗原的非特异性结合，但是与靶BCSC-1多肽的结合是以高度亲和性发生，且可以可靠地有别于非特异性结合。在一个特定的实施方案中，本发明的方法包括将对象样品与特异于BCSC-1多肽的抗体(包被的支持物)接触，并确定免疫复合物的存在。在一个特定的实施方案中，所述样品可以同时或并行或相继与各种特异于不同BCSC-1同种型的抗体(包被的支持物)接触。在另一特定的实施方案中，本发明涉及检测对象中癌症的存在或易患病倾向的方法，所述方法包括体外或离体将对象样品(其可包括生物学体液如血液、血浆、血清等)与特异于BCSC-1多肽的长同种型接触，并确定形成的复合物的(相对)量，这个量是癌症存在或易患病倾向的指示。本发明还涉及上述配体、优选抗体、其片段或衍生物在检测对象中癌症的存在、阶段或类型的方法中的应用，或者在评价对象对于癌症治疗方案的应答的方法中的应用。本发明还涉及诊断试剂盒，其包含检测对象样品中BCSC-1基因、RNA或多肽的存在或(相对)量的产品和试剂。本发明的诊断试剂盒包含本发明中描述的任何引物、任何引物对、任何核酸探针和/或任何配体(优选抗体)。本发明的诊断试剂盒可进一步包含进行杂交、扩增或者抗原-抗体免疫反应的试剂和/或方案。本发明的诊断方法可以在体外、离体或者在体内进行，优选体外或离体进行。所述方法使用对象样品，评价BCSC-1基因表达的任何改变。所述样品可以是得自对象的任何生物学样品，含有核酸或多肽。这种样品的例子包括体液、组织、细胞样品、器官、活检组织等。最优选的样品是活检组织，例如皮肤癌细胞、组织或样品。所述样品可以根据常规技术收集，并直接用于诊断或贮存。可以在进行所述方法之前对所述样品进行处理，以保证或改善核酸或多肽的检测可利用性。所述处理包括例如裂解(例如经机械、物理、化学等方法)、离心等。同样，核酸和/或多肽也可以通过常规技术预先纯化或富集，和/或降低复杂性。核酸和多肽也可以经酶或其它化学或物理处理方法处理，以产生其片段。鉴于本发明方法的高度灵敏性，因此极少量的样品即足以进行测定。如本文所述，所述样品优选与试剂如探针、引物或配体接触，以评价BCSC-1基因或RNA或多肽的存在和减滩对)量。可以在任何合适的装置中进行接触，所述装置如平板、试管、孔、玻璃等。在特定的实施方案中，所述接触是在用所述试剂如核酸阵列或特异性配体阵列包被的基质上进行的。所述基质可以是固体或半固体基质，如任何支持物包括玻璃、塑料、尼龙、纸、金属、聚合物等。所述基质可以是任何形式和大小的，如载玻片、膜、珠、柱、凝胶等。所述接触可以在适于所述试剂与样品的核酸或多肽之间形成复合物的任何条件下进行。发现样品中改变的BCSC-1表达表示黑素瘤或皮肤癌进展的存在、类型、或阶段。确定改变的BCSC-1表达的存在也可以设计合适的治疗干预方法，其是更有效和个性化的。同样，这种在临床前期水平的确定使得可以应用预防方案。药物筛选本发明还提供了筛选引物候选物或引导物的新目标和方法。所述方法包括结合测定和/或功能测定，可以在体外、在细胞系统中、在动物中等进行。在这点上，本发明的目的在于选择对于黑素瘤或皮肤癌具有生物学活性化合物的方法，所述方法包括选择模拟或剌激BCSC-1表达或活性的化合物的步骤。本发明的另一目的是选择对于黑素瘤或皮肤癌具有生物学活性的方法，所述方法包括将测试化合物与包含报道构建体的重组宿主细胞接触，并选择剌激所述报道基因表达的测试化合物，所述报道构建体包含在BCSC-1基因启动子控制下的报道基因。本发明的一个特定目的在于选择对于黑素瘤或皮肤癌具有活性的化合物的方法，所述方法包括在体外将测试化合物与BCSC-1基因或多肽接触，并确定所述测试化合物分别结合所述BCSC-1基因或多肽的能力。与所述基因或多肽的结合提供了所述化合物调节所述靶位活性的能力，并因此影响导致黑素瘤或皮肤癌的途径。优选地，所述BCSC-1多肽是长同种型。结合的确定可以通过各种技术进行，例如通过标记所述测试化合物、通过与标记的参考配体竞争等技术。本发明的另一目的在于选择对于黑素瘤或皮肤癌具有活性的化合物的方法，所述方法包括在体外将测试化合物与BCSC-1多肽接触，并确定所述测试化合物调节所述多肽活性的能力。优选地，BCSC-1多肽是长同种型。本发明的另一目的在于选择生物学活性化合物的方法，所述方法包括在体外将测试化合物与BCSC-1基因接触，并确定所述测试化合物调节所述基因的长同种型的表达的能力。在本发明筛选方法的一个特定实施方案中，所述调节是激活。上述筛选测定可以在任何合适的装置中进行，如平板、试管、培养皿、培养瓶等。典型地，所述测定是在多孔平板中进行。一些测试化合物可以被平行测定。另外，所述测试化合物可以是各种来源、性质和组成。其可以是分离的或者与其它物质混合的任何有机物或无机物，如脂质、肽、多肽、核酸、小分子等。所述化合物可以例如是产物的组合文库的全部或一部分。药物组合物，治疗方法
技术领域：
：本发明的另一目的是药物组合物，其包含(i)多肽的长同种型，或者编码其的核酸，或者载体或重组宿主细胞，如下文所述，及(ii)药物可接受的载体或运载体。本发明还涉及治疗对象的黑素瘤或皮肤癌的方法，所述方法包括给予所述对象上述的组合物。本发明还涉及治疗对象黑素瘤或皮肤癌的方法，所述方法包括基于所述对象有效量的BCSC-1多肽的长同种型。本发明还涉及BCSC-1蛋白或者编码BCSC-1蛋白的核酸在生产治疗黑素瘤或皮肤癌的药物中的应用。优选地，BCSC-1蛋白是长同种型。本发明还涉及长BCSC-1蛋白质同种型在生产治疗癌症的药物中的应用。本发明还涉及BCSC-1激动剂在生产治疗黑素瘤或皮肤癌的药物组合物中的应用。本发明进一步包括刺激BCSC-1基因表达的化合物在生产治疗黑素瘤或皮肤癌的药物组合物中的应用。在本发明中，术语"治疗"包括抑制肿瘤进展、抑制肿瘤增殖、縮小肿瘤大小、抑制肿瘤细胞的致肿瘤性、延缓疾病进展。所述皮肤癌可选自基底细胞癌、鳞状细胞癌、Merkel细胞癌、原发性皮肤淋巴瘤，以及皮肤或相关表面组织的任何其它细胞增殖性疾病。如在实验部分中所示出，为皮肤癌细胞提供BCSC-1长同种型能抑制肿瘤增殖。为对象提供这种功能可以通过基因或蛋白质治疗而实现，或者通过给予调节或模拟BCSC-1多肽活性的化合物(例如在上述筛选测定中鉴别的激动剂)而实现。特别地，可以使用例如病毒载体或质粒将BCSC-1基因导入需要其的对象细胞中。可以使用各种各样的基于病毒的载体，如腺病毒、AAV、疱疹病毒和逆转录病毒，包括慢病毒。例如，美国专利6,069,134和6,143,2卯描述了人腺病毒在转移和表达肿瘤抑制基因进入癌细胞中的应用。所述基因也可以作为裸DNA导入。提供所述基因以整合进受体宿主细胞的基因组中，或者保留在染色体外。整合可以随机或者在指定位点发生，如通过同源重组技术进行。其它技术包括基因枪、脂质体介导的转染、阳离子脂质介导的转染等。基因治疗可以通过直接基因注射或者通过给予离体制备的经遗传修饰的表达功能性BCSC-1蛋白多肽的细胞而实现。蛋白质治疗也可以根据本领域已知的技术实现。在BCSC-1是分泌的蛋白质时，这种蛋白质治疗特别适用。为了进行基因治疗，BCSC-1基因的典型剂量包含104-109个BCSC-1表达载体。为了进行蛋白质治疗，BCSC-1蛋白的典型剂量包含每剂lng-100mg。通常地，给予治疗有效量以实现降低或抑制患病细胞中细胞增殖。应了解所述剂量可以由技术人员基于病理学、治疗方案、患者等因素加以调整。BCSC-1蛋白和BCSC-1表达载体可以多种方式给予，包括但非限于口服、全身性给予、局部给予和肠道外给予(例如皮下、腹膜内、血管内注射等)。在一个实施方案中，所述化合物直接用于肿瘤部位或邻近(或者远离肿瘤的部位)，例如在外科手术进行时给予或者通过其它方式直接到达肿瘤部位(例如通过导管给予)。载体和重组细胞本发明另一方面在于用于诊断、治疗或筛选的新产品。更特别地，本发明的另一目的在于包含编码BCSC-1多肽、优选其长同种型的核酸的载体。所述载体可以是克隆载体，或者更优选是表达载体，即包含在感受态宿主细胞中引起BCSC-1多肽从所述载体中表达的调节序列的载体。这些载体可用于在体外、离体或在体内表达BCSC-1多肽，以产生转基因或"敲除"非人动物、扩增所述核酸、表达反义RNA等。本发明的载体典型包含与调节序列例如启动子、polyA等可操纵地连接的本发明的BCSC-1编码序列。术语"可操纵地连接"是指编码序列与调节序列功能性连接，由此所述调节序列引起所述编码序列表达(例如转录)。所述载体可进一步包含一或几个复制起点和/或可选择的标记。启动子区域可以与编码序列同源或异源，并且可以在任何适当宿主细胞中提供遍在的、组成型、调节的和/或组织特异性表达，包括在体内应用。启动子的例子包括细菌启动子(T7、pTAC、Trp启动子等)、病毒启动子(LTR、TK、CMV-IE等)、哺乳动物基因启动子(白蛋白、PGK等)等。所述载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体、BAC、YAC等。质粒载体可以从可商购的载体如pBluescript、pUC、pBR等中制备。病毒载体可以根据本领域己知的重组DNA技术从杆状病毒、逆转录病毒(例如慢病毒)、腺病毒、AAV等中产生。重组病毒优选是复制缺陷的，更优选选自El-和/或E4-缺陷的腺病毒、Gag-、pol-和/或env-缺陷的逆转录病毒及Rep-和/或Cap-缺陷的AAV。这种重组病毒可以通过本领域已知的技术产生，例如通过转染包装细胞或者通过用辅助质粒或病毒瞬时转染而产生。病毒包装细胞的典型例子包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞。产生这种复制缺陷的重组病毒的详细方案可以例如见于W095/14785、W096/22378、US5,882，877、US6,013，516、US4,861，719、US5，278,056和W094/19478所述。本发明的另一目的在于包含上述重组BCSC-1基因或载体的重组宿主细胞。合适的宿主细胞包括但非限于原核细胞(如细菌)和真核细胞(如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。特定的例子包括大肠杆菌、克鲁维酵母或糖酵母、哺乳动物细胞系(例如Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等)，以及原代或建立的哺乳动物细胞培养物(例如从成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等中产生)。本发明还涉及产生表达本发明的BCSC-1多肽的重组宿主细胞的方法，所述方法包括(i)体外或离体将上述重组核酸或载体导入感受态宿主细胞中，(ii)体外或离体地培养获得的重组宿主细胞，及(iii)任选地选择表达BCSC-1多肽的细胞。这种重组宿主细胞可用于产生BCSC-1多肽，以及筛选活性分子，如下文所述。这种细胞也可用作模型系统以研究皮肤癌。这些细胞可以维持在任何合适的培养装置(平板、培养瓶、培养皿、试管、袋子等)中的合适培养基中，如DMEM、RPMI、HAM等。本发明的其它方面和优势将在如下实验部分中揭示，应了解如下实施例只是例证了本发明，而无限制本发明范围之意。实验部分A-材料和方法1.RNA提取和cDNA合成从70名不同阶段黑素瘤患者的冷冻皮肤组织及从正常痣组织中分离总RNA。将1pg总RNA用于合成cDNA，使用随机六聚体和SupercriptII逆转录酶(Invitrogen)根据厂商指导进行合成。2.实时半定量RT-PCR使用不同的引物组合针对BCSC-1的不同外显子扩增cDNA。当可能时，设计扩增子超过外显子边界，通过BLAST排列人基因组序列，以保证其特异于测试的基因。使用的引物序列示于表1。每种设计的效率用系列稀释的cDNA检测。寡核苷酸PCR反应(IOul体积)含有稀释的cDNA、2XSYBRGreenMasterMix(AppliedBiosystems)、300nM正向和反向引物。在SDS7900HT装置(AppliedBiosystems)上利用如下参数进行PCR:50。C2分钟，95。C10分钟，及40次95。C15秒和6(TC1分钟循环。每个反应均在384孔平板上一式六份进行。RawCt值用SDS2.2(AppliedBiosystems)获得。使用四个不同的管家基因以用于用GenNorm软件进行标准化。相关表达以在肿瘤中的表达与在正常组织(良性痣)中的平均表达的比率计算。如下是BCSC-1研究中使用的寡核苷酸。引物核苷酸序列SEQIDNO:外显子1-lbS5，-AAATTATGACTGCAGCTGTTTTCACT-3,1外显子1-lbAS5'-GTAGAACAGGCTGGGCTTCCT-3'2外显子6-7S5，-CTGATTTACTACAATGAGGTGCATACC-3，3外显子6-7AS5'-CATCAAATGACCTGGCTTCATG-3'4外显子9-10S5，-AGAAACACAGGTAGGAAGAAAATGTGA-3'外显子9-10AS5，-TCATGTAGCACTAGAGTCTGTGTGTCA-3'6外显子13—14S5,-AGCCTGATGTCAACCTCACCAT-3，外显子3一14AS5'-CATGTCCTTGGTCTGGAGCAA-3，8外显子15一16S5'-AGCACAGTCCAGGCTTTGGA-3'9外显子15一16AS5，-CAGGAACCATTTGCATTTTGG-3'10外显子17一18S5，-AATGGGAGCTTCTGGAAAGGA-3'U外显子17一18AS5'-GCA丁GGTGGAGCCTGCAT-3'123.编码BCSC-1的慢病毒载体的构建和产生将用HA-蛋白质序列标记的BCSC-1的同种型F的完整编码序列插入两个不同的慢病毒载体尸GK/ms7Veo和尸『/AGF尸质粒中(得自D,Trono,EPFL,Epalinges,Switzerland,并根据(Naldinietal"1996;Salmonetal"2000)进行修饰)。将293T和HeLa细胞系在补加了10%FCS的Dulbecco，s修饰的Eagle's培养基中培养。重组慢病毒根据标准方案通过瞬时转染293T细胞而产生。简而言之，将亚铺满(subconfluent)的293T细胞通过磷酸钙沉淀方法用20jig质粒载体(PGKBCSCIresNeo/PWIRBCSCGFP)、15的pCMV-ddtaR8.91和5的pMD2G-VSVG共转染。16小时后更换培养基，24小时后收获重组慢病毒载体。所有测试FACS、Western印迹和细胞转导方法均与先前所述相似(Arrighietal.，2004)。B-实施例实施例1:鉴别BCSC-1表达在皮肤癌中改变23基因谱技术DATAS(选择性剪接的转录体的差异分析)(Schwdghofferetal.，2000)可以分离在两种条件下差异表达的选择性剪接的序列文库，该文库随后可用于建立阵列或分离耙基因。DATAS通过从2个不同群体(良性痣与转移性黑素瘤)中提取总RNA，随后通过信使RNA分离(使用DynabeadsoligodT-Dynal)而实现。使用生物素酰化的寡核苷酸dT对mRNA进行逆转录，以产生第一链cDNA。一个群体的mRNA与另一群体的cDNA之间的交叉杂交产生异源双链体，使用链霉亲和素包被的珠将其分离。使用RNAseH处理以释放与异源双链体中的cDNA不杂交的mRNA的环。这些mRNA环编码选择性剪接的序列，用5个简并引物对其进行RT-PCR，随后在AT克隆载体(TOPO，Invitrogen)中克隆PCR产物。使用T7引物通过PCR扩增所有克隆中的cDNA插入体。最终的结果是选择性剪接的mRNA序列文库对于指定条件是唯一的。在测序后，对DATAS克隆进行生物信息学分析，以鉴别其源基因。这样可以高精确性地分析某些类型的剪接事件(如外显子遗漏、内含子保留、新外显子的存在、选择性剪接位点的使用)。对得自一群具有良性痣的健康对象和一群患有转移性黑素瘤的患者的组织进行DATAS谱分析。使用来自良性痣组的11名对象和来自转移性黑素瘤组的10名患者的组织建立DATAS文库。从每群可获得80pg总RNA，从中提取1.6吗mRNA:800ng用于cDNA分析，800ng保留为mRNA。使用Agilent生物分析仪确定所有RNA组织样品的性质和数量。仅将具有良好性质的总RNA样品用于DATAS分析。从对组织RNA进行的DATAS分析中获得了共755个克隆。大约25%的克隆得自条件mRNA转移性黑素瘤/cDNA良性痣，而剩余的75%的克隆得自条件mRNA良性痣/cDNA转移性黑素瘤。插入体的平均大小为300-500bp。在测序后，对各个克隆如上所述进行加工并分析。通过对755个克隆进行测序，217个片段是非冗余的，且含有未知的基因序列。从DATAS分析中获得的217个克隆中，选择大约具有潜在感兴趣性质的IO个克隆，对从黑素细胞皮损的活检组织中提取的RNA进行实时半定量RT-PCR。通过这种二次筛选，鉴别了BCSC-1是潜在的感兴趣的候选物。实施例2:BCSC-1表达在黑素瘤患者中被下调使用从共70名患者的活检组织(包括良性痣的活检组织(阴性对照)和不同阶段的色素性皮损的活检组织)中提取的RNA，通过实时半定量RT-PCR确定BCSC-1的基因表达。结果表明与良性痣样品中BCSC的平均表达水平相比，所有转移性黑素瘤患者均具有显著较低的表达水平(图2)。在一些转移性活检组织中，BCSC的表达达到与良性痣中平均表达水平相比低20倍。非典型性痣活检组织示出比良性痣更高水平的BCSC表达，原发黑素瘤和淋巴结的活检组织均示出与良性痣相似的BCSC表达水平。实施例3:BCSC-1的长同种型在黑素瘤中被选择性下调对于BCSC-1基因已经描述了7个不同的同种型(见图3A)。我们使用不同的引物组合进行了更具特异性的BCSC-1表达分析，以确定哪个同种型是被下调的。结果表明较长的同种型c和f(其编码相同的蛋白质)在黑素瘤患者中被选择性下调(图3B)。实施例4:BCSC-1表达在黑素瘤患者和黑素瘤细胞系中被下调为了证实先前的结果，在来自皮损的较大一批活检组织中进行新的实时PCR实验。与先前的结果一致，与健康供体的平均表达水平相比，所有具有转移性皮损的患者的BCSC-1表达水平均较低(图4A)。此外，检测了黑素细胞的一些细胞系的BCSC-1表达情况(图4B)。结果表明与健康供体相比所有黑素细胞系均具有显著较低的表达水平。在一些细胞系如SK-Mel23(Ll)中，BCSC-1的表达不可检测，仅两个被检测的原代黑素瘤细胞系示出BCSC-1表达与良性痣相似。实施例5:BCSC-1的异位表达降低黑素瘤细胞增殖使用PGK万CSC/,wiVeo或BGSCGF户载体转导SK-Mel23和Hela细胞，诱导BCSC-1表达。此外，用相应的空载体转导的细胞用作阴性对照。结果表明黑素瘤细胞系SK-Mel23中BCSC-1的异位表达显著降低了细胞增殖(图5)。BCSC-1的表达通过Western印迹和实时PCR(图6)使用抗-HA抗体加以证实。BCSC-1的异位表达的作用在其它非黑素细胞系如Hela中未观测到。实施例6:BCSC-1的异位表达阻断黑素瘤细胞增殖用慢病毒载体转导黑素瘤细胞系，以诱导BCSC-1基因的长同种型(IsoF)的异位表达。示于图7的结果表明与用阴性对照及用空载体或BCSC-1的短同种型(IsoA)转导的细胞相比，转导的转移性黑素瘤细胞Mewo和SK23(图7A)及原代黑素瘤细胞Me257(图7B)阻断或显著降低增殖。这个作用在用空载体或BCSC-1的短同种型转导的细胞中未观测到。实施例7:BCSC-1阻断在细胞周期的G2-M期的黑素瘤细胞我们研究了BCSC-1的抗增殖性作用是否是由于干扰了转导细胞的细胞周期所致。使用BrdU和7-AAD染色，我们可以确定细胞周期的G0/G1(R3)、S(R4)、G2-M(R5)时期中的细胞百分比及凋亡细胞(R6)。FACS谱在图8A中示出，百分比值在图8B中示出。结果表明用BCSC-1的长同种型(isoF)转导的细胞在G2-M期存在阻断。这个作用在未转导的细胞及用空载体或BCSC-1的短同种型(isoA)转导的细胞中未观测到，其中细胞主要分布于细胞周期的G0/G1和S期。实施例8:编码BCSC-1的Hela细胞被停滞在细胞周期的G2和M期用DAPI和微管蛋白抗体进行免疫荧光染色，以确定在G2-M期的哪个步骤产生BCSC-1异位表达诱导的细胞周期阻断。在未转导的细胞或者用空载体或BCSC-1的短同种型转导的细胞中，我们观测到存在高百分比的具有染色质浓缩或者处在有丝分裂的不同时期的细胞(图9A)。然而，当用BCSC-1的长同种型转导细胞时，未观测到处在有丝分裂中的细胞(图9B)。可以推断BCSC-1的异位表达诱导了在细胞周期G2与M期之间的阻断，避免了细胞有丝分裂。实施例9:BCSC-1降低转移性黑素瘤的小鼠模型中肺转移的数目为了研究BCSC-1在体内的作用，经静脉内注射用空载体或者用长同种型BCSC-1载体转导的B16黑素瘤细胞(大约500ng病毒颗粒/104-107个细胞)。15天后，这些细胞产生肺转移，可以对转移瘤进行计数(图IOA)。注射空载体转导的B16的小鼠(n-10)或者长BCSC-1载体的小鼠(『6)的肺转移数目示于图IOB。观测到注射BCSC-1转导的细胞的小鼠与注射空载体转导的细胞的小鼠相比肺转移数目降低。BCSC-1的蛋白质序列(SEOIDNO:13)说明书第25/28页PAIFAFBCSC-1的cDNA序列(雨014622)一SEQIDNO:14GGTTCTTTCCGGAAATTATGACTGCAGCTGTTTTCACTCCGCTGTGACT50CAGAGCGCTCCGGGCTGCAGGAGAGGAAy:AATCTTGCATCACCATGGTG100CACTTCTGTGGCCTACTCACCCTCCACCGGGAGCCAGTGCCGCTGAAGAG150TATCTCTGTGAGCGTGAACATTTACGAGTTTGTGGCTGGTGTGTCTGCAA200CTTTGAACTACGAGAATGAGGAGAAAGTTCCTTTGGAGGCCTTCTTTGTG250TTCCCCATGGATGAAGACTCTGCTGTTTACAGCTTTGAGGCCTTGGTGGA300TGGGAAGAAAATTGTAGCAGAATTACAAGACAAGATGAASGCCCGCACCA350ACTATGAGAAAGCCATCTCCCAGGGCCACCAGGCCTTCTTATTGGAGGGG權GACAGCAGCTCCAGGGATGTCTTCTCTTGCAATGTGGGTAACCTCCAACC450TGGGTCGAAGGCGGCAGTCACCCTGAAGTATGTGCAGGAGCTGCCTCTGG500AAGCAGATGGGGCTCTGCGCTTTGTGCTCCCAGCTGTCCTGAATCCTAGA550TACCAGTTCTCTGGGTCGTCTAAGGACAGTTATAGTCCCTGTGGAGGACCTGCCCTACACTAGATTCCCAGCATGGCATTGAGAAGGTCCCCTACCGAGTACCTAGGAGAGGACAAGACTTGCTGGACACAAGTTTGATCGGGACGTGGAAGGTGCATACCCCCAGCGTGGTTTTGGAGACCA(SGTCATTTGATGGGAGATCCATCTGCATATCCCAGAAGATCAACCATCAAATACCTGTGGACCGCTCGGGAAGTATGCAGAGCCCCACAGCTGCGAATACAGGCAGCCAAC5GAAACATTTACCTATAGGCTGTTATTTCAACATCTAAGGCATGCTTTCCGGAGAGTGTGAAGTACAGCTCTGGGGAGAGTGAAGCTTATGCAGGCCCTTGGCACCACTCCAGAACATTTACAGGGGCCCTACAGGTTTTTGTCTTTACAGATGGAGGTAATTAAAGAAGTTAGGATCAACAGACAGTGGTATTGGAGAAGGCACCTCCACCAGCCTCATCAGGGGGCACCTCAGAATTTATCACAGAAG;GCTCTCAGGACTCTGAAACGCTCTCTGCTCTCTGAGCTGGCATTTGCCTCCTGGTCTCAGAACAGACTGTCATCTTTAGGGGTCAGACTGACCGGGAGGATGCCAGCAGCAGAGACAATATACACTCCAGGGCAAGACTTTTGAGGAAACCCAAGCCTGATGTCAK:CTCACCATTCTTGCTCCAGACCAAGGACATGGGCCTCAGGAAAAGATGCATTGAACCTTAGCCTTGAGTCCAGCTTTCATTGCTATCAATAAGGAGCTCACTGGCTCATAGGGACGTCCCAAGGCCAATTATTGAAGATAAAATGCCAATCAGGTTTTCGTGCCTTAATGTGAAGACTCC600ACTCAGCATGGTCGCCACCA650AATCCAACTGCCCCTTGAGT700TCTGCTCAGC5TTTCCCTGGC750ACTCCTGATTTACTACAATG800TGGGGATGCCTAACATGAAG850ATGGTGAGTTTCTATCCAAA900TGGAGAGTTTATCTTTCTCA950TGAGTAGCCAGGATACATCT1000CTGATTTTGCTGCTGAAGAG1050TGGATTTGGCTCTTCCTATG1100CTCAGCAAACAATGGAGGAG1150GACCTAGGGGGCACTGAAAT1200ACCCTCCATCCCAGGCCACC1250AAGTTACAGACACGTTTAGT1300AAACACAGGTGTTTCTCATT1350AATAAAAGGTATTGCCCGGG1400GCAAAGACAGGATGCAGTCC1450CAGCCTGTGGTAGAGGATGT1500GTCTGCTAAAATGCTTTCCC1550GATTAATCAGCTATGCCCAG1600ACAGGAGAAGTATGCCTCAA1650TAAGGTGACATTTCCTCTAC1700ACCGCCTTGCTGCCAAGTCC1750GAGACTCCAGCAAGTGATAA1800TGGTGTCATAAGCTCCTTCA1850ACAAGCCGGTTCAGGGGCCT1900CTGTTGGGTGCTTCTGCCCC1950AAAGGCCTTACACTCTGACC200029GTCCTCCTTCTGCATCTCAGCCCAGAGGGGAACTTATGTGTTATAAGGCC2050AAGACATTCCAGATGGACGATTACAGTCTCTGTGGGTTGATAAGTCACAA2100GGACCAGCACAGTCCAGGCTTTGGAGAGAATCACCTTGTGCAGCTGATTT2150ACCACCAAAATGCAAATGGTTCCTGGGATCTGAATGAAGATCTAGCCAAG2200ATCCTAGGTATGAGTTTGGAAGAAATAATGGCTGCACAGCCTGCCGAGCT2250TGTGGATTCCTCAGGCTGGGCCACCATCCTGGCCGTGATCTGGCTGCACA2300GCAATGGTAAGGACTTGAAGTGTGAATGGGAGCTTCTGGAAAGGAAGGCC2350GTGGCCTGGATGCGTGCCCATGCAGGCTCCACCATGCCTTCGGTTGTGAA2400AGCTGCTATTACTTTCCTGAAGTCATCTGTGGATCCTGCTATCTTTGCCT2450TTTGAAGATACCATCCAGAAAAAGAAGTGCCTTTAATTTGCTACTGTCAT2500TTCCTCTAGTATCACTTTTGCTGTGATGATGTGTTCTTGTGTATTATAAC2550TCTTTATTTTTTGCCATAAAAGTAAAGGATGCTTACTCCACTTCGCTTCT2600CTGCTCCAGGTTCACTTTGGATATGATCTTTCTTTTCCCAACATATGCCC2650TCAGAAAAGTGACAGTGGTCCCAGAACCTATTCCCTTTCTTGAGGGAGTT2700CAAAACATTCATAGGCAGTAATGTTCCTCCCAGGGTTTCCAGGGAAACAA2750CATGAAAAACAGGTGACATGAACTACAGACTAAAGATTGCAGCATTTATG2800TTAGAGAATGCTTGAATTAGAGAATTTTCTGCATTATCTTTGTCTGTTCA2850CT丁TCTATCTTATATACTTATCAGGGCCATACTGGTAAGCTTGCGTAGGA2900GGAGTTAGAGGGAAGTTGAAAGCCAACATCTGGATCAATGTAATGTCAAG2950ATCACAAAGACAGAGACTGCAGGGGTCCACTGTGAGAGGTGACACTGTTG3000GGGACCTTCCTGATTCATTCTTCTTGGGCTTTGCTAGCCTGTACAACCT7V3050CATGTCTTTTCTTCCACTGCCTGAAAGACTTGGGTTGAACTATAACTGTT3100GGAGAGAGA'rGTTCCTCTTTAATCATGAAACACCTTAAGAAGTCTATAAT3150GCAATCCTTAGTCCTACCCTGAACCTATGTGTCCTCTAAGTCAGGCCCTG3200ATCTAGTGCAGTAAAGGGAAGGGTGGGCTTAATGGGAGCTTTGCCTGGGA3250CCTGAACCTGGAGCACTTACCGCATTAGGAAGAAAGGAGCTCCCCGTAAT3300CGTTCCTGACCCTTGTGTCTCATATACCCTATCCTGGTGGAAATGACCCT3350ATTTGATMGCTGTCCCTTAAAATAACTTGTATCAATATTAAAATGACTA3400TTTCTACCCTTTGATGAGaaaaaaaaaaaaaaaaaaa参考文献Arrighi，J.F.,Pion，M.,Wiznerowicz，M.,Geijtenbeek，T.B.，Garcia,E.，Abraham,S.,Leuba，F.,Dutoit,V.,Ducrey-Rundquist,O.，VanKooyk,Y.，WaZ.(2004).Lentivirus-MediatedRNAInterferenceofDC-SIGNExpressionInhibitsHumanImmunodeficiencyVirusTransmissionfromDendriticCellstoTCells.JVirol7S,10848-10855.Naldini,L.,Blomer,U.，Gallay,P.，Ory，D.，Mulligan,R.,Gage,F.H.,Verma，I.M.，andTrono,D.(1996).Invivogenedeliveryandstabletransductionofnondividingcellsbyalentiviralvector.Science272，263-267.Salmon,P.，Kindler，V.,Ducrey,O.,Chapuis,B.,Zubler,R.H.，andTrono，D.(2000).High-leveltransgeneexpressioninhumanhematopoieticprogenitorsanddifferentiatedbloodlineagesaftertransductionwithimprovedlentiviralvectors.Blood96,3392-3398.Schweighoffer,F.,Ait-Ikhlef,A.，Resink，A.L.，Brinkm叫B.，Melle-Milovanovic，D.，Laurent-Puig,P.，Kearsey，J.，andBracco，L.(2000).Qualitativegeneprofiling:anoveltoolingenomicsandinpharmacogenomicsthatdeciphersmessengerRNAisoformsdiversity.Pharmacogenomics/,187-197.权利要求1.一种检测对象中黑素瘤或皮肤癌的存在、阶段或类型的方法，所述方法包括在体外或离体检测对象样品中改变的BCSC-1基因表达的存在，这种改变的基因表达的存在是所述对象中黑素瘤或皮肤癌的存在、阶段或类型的指示。2.权利要求1的方法，其中所述样品中BCSC-1基因表达的降低是所述对象中黑素瘤或皮肤癌的存在、阶段或类型的指示。3.权利要求1或2的方法，其中所述样品中BCSC-1基因的长同种型的表达降低是所述对象中黑素瘤或皮肤癌的存在、阶段或类型的指示。4.权利要求3的方法，其中所述长同种型包含外显子13、14、15、16、17或18。5.—种评价对象中黑素瘤或皮肤癌的治疗功效的方法，所述方法包括对比在所述治疗之前和之后样品中的BCSC-1基因表达，表达水平增加是对于治疗的阳性应答的指示。6.权利要求1-5任一项的方法，其中BCSC-1基因表达通过测序、选择性杂交、选择性扩增和/或特异性配体结合而检测。7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述癌症选自基底细胞癌、鳞状细胞癌、Merckd癌和黑素瘤。8.—种核酸引物，其允许扩增BCSC-1的长同种型。9.一种核酸探针，其特异性杂交BCSC-1的长同种型。10.—种抗体，其特异性结合BCSC-1蛋白的长同种型。11.一种试剂盒，其分别包含权利要求8-10之一的引物、探针或抗体。12.BCSC-1蛋白或者编码BCSC-1蛋白的核酸在生产治疗黑素瘤或皮肤癌的药物中的应用。13.BCSC-1激动剂在生产治疗黑素瘤或皮肤癌的药物组合物中的应用。14.刺激BCSC-1基因表达的化合物在生产治疗黑素瘤或皮肤癌的药物组合物中的应用。15.—种选择对于黑素瘤或皮肤癌具有生物学活性的化合物的方法，所述方法包括选择模拟或刺激BCSC-1表达或活性的化合物的步骤。16.—种选择对于黑素瘤或皮肤癌具有生物学活性的化合物的方法，所述方法包含将测试化合物与包含报道构建体的重组宿主细胞接触，所述报道构建体包含在BCSC-1基因启动子控制下的报道基因，并选择刺激报道基因表达的测试化合物。17.—种检测对象中癌症的存在、阶段或类型的方法，所述方法包括在体外或离体检测对象样品中BCSC-1基因或蛋白的长同种型的(相对)量，所述量是所述对象中癌症的存在、阶段或类型的指不o18.—种检测对象中癌症的存在、阶段或类型的方法，所述方法包括在体外或离体检测衍生自该对象的流体样品中BCSC-1蛋白的(相对)量，所述量是所述对象中癌症的存在、阶段或类型的指示。全文摘要本发明涉及检测和治疗黑素瘤及皮肤癌的方法和组合物。更特别地，本发明揭示了在黑素瘤和皮肤癌细胞中BCSC-1表达被改变，使得可以设计这种病变的有效检测方法和试剂盒。本发明还示出恢复或增加黑素瘤和皮肤癌细胞中的BCSC-1表达会抑制致肿瘤性，并代表治疗黑素瘤和皮肤癌的一种新的且有效的方法。本发明可用于检测黑素瘤和皮肤癌的存在、阶段或类型，以及任何患所述疾病的倾向。本发明可用于任何哺乳动物对象，特别是人对象。文档编号C12Q1/68GK101548020SQ200780013681公开日2009年9月30日申请日期2007年3月15日优先权日2006年3月16日发明者L·布拉科,R·科雷亚罗沙,V·皮盖申请人:埃克森特医疗有限公司;日内瓦医科大学;日内瓦大学