用于改善繁殖效率的家畜管理的制作方法

专利名称：用于改善繁殖效率的家畜管理的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于控制家畜繁殖周期和断奶的方法，具体而言涉及酪蛋 白衍生肽用于发情期的诱导和同步化而使怀孕率增加并且用于缩短非发
情期的间隔的用途，使得早期断奶不会不利地影响家畜的健康(welfare )。
背景技术：
家畜群具体而言产肉家畜的繁殖力，极大地取决于群的繁殖效率，并 且其根据怀孕率、生产-能量摄入比(productivity-energy intake ratio )、分 娩前至分娩后身体状况评分(body condition score )动态以及后代的体重值 来测量。对于任何有效的发情周期方案的关^t性的需求是可预计的以及高 程度的发情和排卵反应。对于单独评估繁殖效率的最重要的参数是连续分 娩间的间隔。在经济方面，例如在母牛中，产犊和产犊之间的周期不应超 过一年的最佳周期，即每头母牛每年产犊一次。这种间隔的主要决定因素 是分娩-受孕间隔。对于高繁殖效率的主要限制是延长的产后非发情期。 产后间隔(PPI)定义为，分娩与下一次发情期之间的间隔。已显示当分娩 -发情期间隔从60天增至120天时，怀孕百分比线性下降。而且，当产 后间隔增加时，产犊家畜和它们的后代的体重明显下降。
在整年的产犊群中，据报道11 %至38 %的母牛在产犊后50或60天处 于非发情期。在季节性产犊奶牛群中，13%至48%的母牛在生殖期的初始 被诊断为处于不排卵的非发情期。当雌二醇对脑下垂体释放黄体生成素 (LH)的正反馈效应和代谢激素例如胰岛素和胰岛素样生长因子-I的循环 浓度被多种环境因素降低时，产犊后的排卵和发情期被延迟。主要因素是 有限的能量摄入、较低的身体储备、分配给产奶的能量增加、哺乳以及产犊期间的疾病(围产期疾病)。
从产犊至第一次产后排卵的间隔，其特征在于一段期间增加的LH脉 冲式释放，这与卵泡的生长和发育有关。为使这些卵泡能够成熟和排放，
促性腺的支持作用必须足以刺激雌二醇产生的增加，这能够诱导LH和促 卵泡激素(FSH)的排卵前的流。牛犊的出生与肉牛的第一次产后排卵的起 始时间延迟有关，而且通过由低频率的LH脉沖式分泌引起的低浓度的 LH，哺乳对于发情期的起始具有抑制性影响。这种抑制性作用独立于乳头 或乳房内的感觉神经途径，而且母-仔联系(maternal-offspring bonding) 被认为是家畜中哺乳诱导的延长PPI的主要因素。除去哺乳作用产生LH 脉冲频率的快速增加，其足以刺激第一次排卵，这是一种不依赖于产后营 养水平的反应。已鉴定为影响PPI持续时间的其他因素是产犊前和产犊后 的营养，以及季节和围产期疾病。产犊后第一个月期间发生的临床疾病例 如乳腺炎、子宫炎、阴道炎、重度跛(severe lameness )以及酮病，据报道 都是延迟PPI的重要危险因素。简要的说，当出现下述现象时观察到延长 的PPI:在低能量摄入和/或低身体储备情况下当LH释放和/或代谢信号的 增加被哺乳延迟时，当为了产奶而出现能量的增加分配时，或者当家畜的 健康由于源自疾病的应激增高由于断奶而产生乳腺/乳房压力，或者高的环 境温度而 一皮不利地影响时。
产犊后发情周期的早期恢复对于全年和季节性产犊群的高繁殖效率 具有重要性。对于基于牧草的繁殖系统，产犊的时间通常设定为，优化利 用春季和初夏的最大牧草生长速率。为维持季节中最佳的产犊分配，生殖
周期早期中的高的受孕率是重要的先决条件。为维持最大是365天的产犊 间隔，母牛需要在产犊后平均约80天受孕。排卵的起始以及发情期的表 现延迟，与降低的受孕和怀孕率以及产犊至受孕间间隔的增加有关。
对于PPI延长的母牛的治疗选择包括激素和管理的策略。激素治疗包 括一段时间的例如孕酮的补充，其使治疗动物的大多数表现出发情期，并 随后具有正常持续时间的黄体期，并且与未治疗对照相比其提高了怀孕 率。激素介入与管理变化(例如控制身体状况或产犊后饮食摄入)相比更 有助于具有可预期的结果，并且通常具有一些发情期同步化的作用，因此促进了人工授精的使用。例如美国专利第6,939,558号公开了含有孕酮的 阴道内装置，其能用作生物体内的发情期诱导剂，所述生物体例如牛、猪 和马以及类4以动物。
然而，对于任何激素治疗的反应是可变的并且取决于，卵泡波的阶段 以及在调节卵泡连续发展中发挥作用的控制机制的复杂性。对于发情期同 步化，使用激素可以产生降低的受精以及次级效应，因此不会达到增加繁 殖效率的目标。
农业动物的健康是过去十年在现代社会中增加的公众关注的问题 (Broom DM 1992 In: Phillips等，纟扁寿專.Farm Animals and the Environment CAB Wallingford UK第245-253页)。在集约化繁殖系统中关于农业动物的 圈养(housing)和管理实践的最近的发展，反映了对于动物健康的道德关 怀的增加(Fregonesi JA等.2001 Livestock Production Sci. 68:205-216; Fregonesi等.2002 Livestock Production Sci. 78:245-257 )。动物健康的改善 定义为痛苦的预防和积极情感出现的增加，通常称作舒适或愉快(Broom, 上述)。削弱的生物功能的测量，特别是与健康下降和生理应激反应增加 相关的那些功能，被用于评估农业动物的健康状况。
在牛业和乳业中，群中泌乳动物经历泌乳和怀孕的控制周期，像这种 促进产犊和产奶量明显增加的方案。乳畜群例如奶牛和山羊的当前管理 中，在泌乳期和怀孕期之间有明显重叠，其中通过停止产奶，"干乳期" 强加在分娩前的第50天至第70天之间。设置这种方案以平衡诱导退化 (involution)的需要( 一种用于下一个健康的泌乳期所必需的过程)与全 年高产奶量的需要。与控制繁殖效率的管理原则一致，牛业的牛犊在3至 5个月的年龄断奶。早期断奶的益处包括退化的诱导和繁殖力的增加，牛 犊饲养的控制以及母牛饲养所需食物数量和质量的降低。然而，早期断奶 《会母牛以及牛犊强加了强烈的应激，导致身体状况的整体下降，乳房压力 的增加，漏乳和剧痛，所有这些导致易感于疾病并且不利地影响母牛的下 一个生殖周期，以及导致牛犊体重严重下降。因此，现代农业中控制泌乳 动物早期断奶的当前实践，相当大地妨碍了动物的健康状况和繁殖性能。
酪蛋白肽酪蛋白(CN)是人类和非人类哺乳动物乳中主要的蛋白质。依照它们
的电泳迁移率，其先前被定义为主要包括3个部分，a、 P和y。现在，依 照aSl、aS2、(3和k亚型中每种的氨基酸序列来定义酪蛋白(Engel等.1984. 丄Dairy Sci. 67:1607-1608)。
酪蛋白的酶解作用释放促进幼仔健康和正常发育的肽，和充当乳腺功 能的局部调节剂的肽(Silanikove等.2000 Life Sci. 67:2201-2212; Shamay 等.2002 Life Sci. 70:2707-2719 )。美国专利第6,391,849号公开了酪蛋白衍 生的用7蛋白胨(充当钙螯合剂)和其用途，所述用途用以控制乳腺中的生 理变化，包括暂时和永久的产乳停止，以及预防、治疗和逆转感染。麻蛋 白胨(PP)也已知为酪蛋白磷酸肽(CPP)，是一群耐煮淬的肽，其构成乳 清蛋白的约三分之一，乳清蛋白是纤溶酶作用于(3-酪蛋白和asl-以及as2-酪蛋白后的主要产物(Andrews 1983 J. Dairy Res. 50:45-55)。
酪蛋白磷酸肽已显示拥有独一无二的特性，其能够结合大量元素例如 Ca、 Mg和Fe，连同微量元素例如Zn、 Ba、 Cr、 M、 Co和Se，这些元素 可溶解在小肠中而因此可以吸收获得。像这样，CPP被用作饮品和婴儿食 物以及牙药物(dental medicament)的添加剂(参阅例如,欧洲专利第EP 0090406号；美国专利第5,130,123; 5,227,154号)。
先前已显示了得自纤溶酶作用于(3-酪蛋白(p-CN)的肽下调奶牛和山羊 的泌乳(美国专利第6,391,849号)。这种肽的活性与其阻断乳腺上皮顶膜 中钾通道的能力相关(Silanikove等，上述)。也显示了注射酪蛋白水解物 (CNH)到山羊或奶牛的乳房，可模拟退化的自然现象，诱导了局部炎症反 应以及丧失紧密连接(TJ)的完整性，随后迅速停止了乳腺分泌(Shamay等, 上述；Shamay等2003 J. Dairy Sci. 86:1250-1258 )。由CNH诱导的过程与 由自然停奶诱导相比更迅速更同步化。这些结果指示其可能明显地降低了 所需用于退化的时间。本发明的发明人和同事也显示了，其可能缩短或省 略千乳期而不会影响下一次泌乳的产奶量(国际专利申请公布第 WO2006/117784号)。
对于改善群的繁殖效率并且不会不利地影响家畜健康的方法和组合 物留有未满足的需要。发明概述
本发明涉及用于改善家畜群的繁殖效率或繁殖力，以及用于诱导早期 断奶而不会不利影响家畜健康的方法和组合物。具体而言，本发明公开了 用于在群中诱导发情期和同步化排卵的方法和组合物，其产生非发情期间 隔的缩短、受孕率的增加并且因此增加了繁殖率。本发明进一步提供用于
诱导早期和无应激断奶(stress-free weaning)的方法，其产生群繁殖力的 增力口。
本发明部分基于意外的发现应用酪蛋白衍生肽(麻蛋白胨)到泌乳 家畜动物中，产生所述动物发情期的诱导。
因此，依照一个方面，本发明提供了一种用于在泌乳家畜动物中诱导 发情期的方法，其包括施用给所述动物有效量的衍生自酪蛋白的至少一种 肽。
依照某些实施方式，从施用肽后约2天至约120天，优选地从施用肽 后约2天至约50天出现发情期。依照其他的实施方式，所述方法进一步 包括授精所述泌乳动物。依照一个当前优选的实施方式，受孕率是至少70 %,优选约75%，更优选约80%或更高。
依照某些实施方式，诱导发情期的方法包括从分娩前约70天至分娩 后约150天施用本发明的至少一种酪蛋白衍生肽。依照其他的实施方式， 所述肽从分娩后立即至分娩后约150天施用，优选从分娩后立即至分娩后 90天施用，更优选从分娩后立即至分娩后60天施用，最优选从分娩后立 即至分娩后30天施用。
本发明的方法在任何泌乳动物的发情期诱导中均是有效的。依照某些 当前优选的实施方式，本发明的方法涉及诱导产肉或产奶家畜动物的发情 期，所述家畜动物包括奶牛、山羊、绵羊、猪、骆驼和水牛。
依照本发明方法的发情期诱导可以应用于单头家畜动物，以及应用于 群中多头泌乳动物以同步化所有接受治疗动物的发情期。非常期望群中发 情期同步化，因为它使群的生活周期的随后步骤包括授精、产犊、断奶及 伺料程序等同步化，并且因而提高了管理效率。因此，依照某些实施方式，所述至少一种酪蛋白衍生肽应用于群中多 头泌乳家畜动物，因而同步化了群中所述泌乳动物的发情期。依照某些实 施方式，所述群是肉牛群。依照其他的实施方式，所述群是奶牛群。仍旧 依照另外的实施方式，所述群是猪群。
依照其他的实施方式，群中发情期同步化能使授精同步化。依照某些 实施方式，群中发情期同步化的方法进一步包括授精所述动物。依照一个
实施方式，授精后的受孕率是至少70%,优选75%,更优选80%。仍旧 依照另外的实施方式，群中发情期同步化形成群中分娩的同步化。
仍旧依照另一个方面，本发明提供一种用于诱导群中至少70%受孕率 的方法，其包括施用给群中多头泌乳动物有效量的衍生自酪蛋白的至少一 种肽。依照某些实施方式，受孕率是至少75%,优选80%或更高。
衍生自酪蛋白的肽能通过水解酪蛋白获得，或其能是合成的肽。依照 本发明所教授内容，能使用任何天然的或合成的酪蛋白衍生肽的联合。
依照某些实施方式，所述肽是酪蛋白衍生磷酸肽。依照一个实施方式， 所述磷酸肽衍生自酪蛋白，其包括如SEQ ID NO:l阐述的氨基酸序列，和 其类似物、衍生物或片段。依照另外的实施方式，磷酸肽选自由下述磷酸 肽组成的组衍生自P-酪蛋白的磷酸肽、衍生自aSl-酪蛋白的磷酸肽 和衍生自aS2-酪蛋白的磷酸肽。依照某些当前优选的实施方式，磷酸肽 衍生自卩-酪蛋白，其包括如SEQ ID NO:2阐述的氨基酸序列，和其类似 物、衍生物或片段。依照另外的当前优选的实施方式，磷酸肽衍生自aSl -酪蛋白，其包括如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列，和其类似物、衍生 物或片段。仍旧依照其他的当前优选的实施方式，磷酸肽衍生自aS2-酪 蛋白，其选自含有如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的肽，以及含有如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的肽，以及其类似物、衍生物或片段。
不希望受到任何特定理论或作用机制的限制，由酪蛋白衍生肽产生的 发情期同步化可以归因于内源激素系统向分泌诱导发情期的激素变化。
本发明所教授的内容具有超过先前已知的用于发情期同步化的激素 方法的益处，提供没有不利效应的应用简单的方法。而且，本发明的方法有益于动物的整体健康、改善身体状况以及减少应激因素，因而提供了舒 适度并且增强了动物的健康。
本发明的肽能以如本领域已知的任何适合的方法施用。依照某些实施 方式，施用方法选自由全身施用和直接施用到乳腺组成的组。依照某些当 前优选的实施方式，所述方法包括施用到泌乳动物乳腺的乳头管中。至少 一种肽能施用到一个或多个乳腺，包括同时施用到动物的全部乳腺。施用
到乳头能通过根管内注射(intracanal injection )，通过含有本发明肽的贴片 的施用，通过以含有至少一种肽及类似物的组合物浸泡乳头施用。
考虑了单次施用以及多次施用。本发明现在公开了至少一种酪蛋白衍 生肽的单次施用，其足以诱导发情期同步化。依照其他的实施方式，所述 肽以从约6小时至约24小时的间隔施用1至5次。
依照另 一个方面，本发明提供一种用于诱导哺乳幼仔无应激断奶的方 法，其包括在断奶前，施用给泌乳动物至少一天的有效量的衍生自酪蛋白 的至少一种肽。
本发明断奶的方法能使哺乳幼仔离开其母亲，并且因此显著地降低了 由断奶给母亲和哺乳幼仔强加的应激。年幼牛犊从飼育场被迁出后，其通 常的经验是喊叫其母亲并且在半惊恐和应激的状态下在饲育场周围不停 地行走。在这个应激的时间段，由于牛犊不熟悉周围环境以及其不愿意吃 传统的饲料，因而牛犊经常是体重没有增加。由于突然停止哺乳母亲也遭 受痛苦，显著地增加了行走和减少了躺下的时间。应激的状况以及动物消 耗食物量的减少，通常导致所述动物生病以及整体的身体状况评分下降。 通过使牛犊离开其母亲而解除应激，导致牛犊体重没有下降而且甚至会体 重增力口。
依照本发明所教授内容的断奶能在哺乳的任何阶段诱导，而不会不利 地影响母亲的健康。不希望受到任何特定模式或作用机制的限制，本发明 首次公开的这种现象可以归因于酪蛋白衍生肽对于泌乳动物向发情期的 激素平tf的作用。
依照某些实施方式，早期断奶从分娩后约2周至约15周、优选地从分4免后约4周至约8周开始。
依照其他的实施方式，在所预定的断奶以前约1天至约10天，优选
地在断奶前约3天，施用至少一种酪蛋白衍生肽。
能应用单次剂量以及重复剂量的至少 一种酪蛋白衍生肽至乳腺中的
施用。通常，为获得无应激断奶施用重复至少一次，优选1至10次之间、 更优选1至3次；以选自由约6小时、约8小时、约12小时、约16小时、 约20小时和约24小时组成的组的间隔；在1至10天、优选1至3天、 更优选1天期间施用。依照某些当前优选的实施方式，所述肽仅施用一次。 施用肽后幼仔可以与其母亲分离短暂时间，以促进断奶过程。不希望受到 特定作用机制或理论的限制，断奶过程由于乳成分的改变而加强，其形成 幼仔哺乳愿望的减少，所述乳成分的改变由酪蛋白衍生肽诱导。依照某些 实施方式，幼仔与其母亲分离的时间从约5小时至约3天，优选从约5小 时至约2天，更优选从约5小时至约24小时。
仍旧依照另 一个方面，本发明的用于发情期同步化和早期断奶的方 法，可以以用于饲养家畜群而且更具体指牛群的新颖方法使用，其中存在 起因于繁殖率(即每年出生的牛犊数量)增加的、群的繁殖力增加以及产 肉的数量和/或质量增加，而不会不利地影响、甚至会改善家畜的健康。依 照本发明所教授内容的家畜管理也可以产生在群的饲养过程中所包括的 整体花费的减少，其通过减少施用激素补充剂以获得发情期同步化的实 践，以及通过减少分娩后所需的特殊饲料(以保持牛分娩和生育后身体状 况平衡)的花费来实现。即，本发明的这个方面将如本文公开的发情期同 步化和早期断奶的用途结合在新颖的家畜管理计划范围内。这种新颖的家 畜管理也能够确定季节性产犊计划，以及家畜-农业领域计划 (livestock-agriculture field planning )，净争另ll在干旱和半干旱;l也区。
本发明的其他目标、特征和优点可从下述描述中清楚了解。 发明详述
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应理解本发明不受限于其所应用到的详细内容，所述详细内容在下述描述中提出或通过实施例的 例证阐述。本发明能有其他实施方式，或者以不同方式实施或进行。同样， 应该理解本文使用的措辞和术语是为了描述的目的，而不应认为具有限制 作用。
定义
如本文使用的术语"酪蛋白"指非人类哺乳动物和人类乳中主要的蛋
白质，包括aSl、 aS2、 (3和K亚型。
如本文使用的术语aSl 、 aS2和|3 -酪蛋白指哺乳动物的aSl 、 aS2和 卩-酪蛋白，所述哺乳动物包括但不限于家畜哺乳动物(例如奶牛、绵羊、 山羊、猪、母马、 一格駝、鹿和水牛)、人类以及海洋哺乳动物。
贯穿本说明书使用的术语"肽"指定为， 一个与另一个通过肽键连接 的线性系列的氨基酸残基。依照本发明原理的肽与完整的蛋白不同。
如本文使用的术语"磷酸肽"指定为结合肽形式的磷酸化的肽，其中 非肽部分是磷酸残基。具体而言，"酪蛋白磷酸肽"或"CPP"或"麻蛋 白胨，，的表述指定为含有酪蛋白片段的磷酸肽。
用于本发明方法的肽优选地具有从约1,000至约10,000道尔顿的平均 分子量，优选地从约1,000至约5,000道尔顿。具体而言本发明考虑共具 有10-50之间的氨基酸残基的肽。本发明也考虑了蛋白质，其中其核心基 序(core motif sequence )例如SEQ ID NO:l阐述的氨基酸序列，被人工植 入到多肽序列中，所述多肽例如通过重组DNA技术或通过化学合成生产 的肽。通过水解酪蛋白产生肽的混合物能获得肽。依照本发明教授的内容 能使用肽的混合物，或者所述混合物通过本领域已知的任何蛋白纯化方法 能进一步纯化，以获得分离的肽。可选择地或另外地，本发明的肽能^皮例 如化学剂裂解，例如CNBr或本领域已知的其他裂解剂(cleaving agent)， 以产生肽的混合物，其能被进一步纯化而获得分离的肽。
用于本发明方法的肽也能使用本领域公知的方法，包括化学合成和重 组DNA技术来合成。合成能在溶液中进行或通过如Merrifield描述的固相 肽合成法进行(参阅J. Am. Chem. Soc., 85:2149, 1964 )。通常，肽合成方法包括连续加入一个或多个氨基酸或适当保护的或衍 生的氨基酸到增长狀链上。通常，第一个氨基酸的氣基或羧基被适当的保 护基保护。然后能将被保护的或衍生的氨基酸连接到惰性固体支持物或者 在溶液中利用，其是通过在适合形成酰胺键的条件下，在含有适当保护的 互补(氨基或羧基)基团的序列中加入下一个氨基酸。然后从这个新加入 的氨基酸残基中除去保护基，并且随后加入下一个氨基酸(适当保护的)，
等等；传统上这种方法也通过洗涤步骤完成。所有想要的氨基酸以正确的 顺序连接后，连续地或同时地除去任何残留的保护基(以及任何固体支持 物)，以提供最终的肽。通过对这种一般程序的简单修改，可能在增长链 上一次添加多于一个氨基酸，例如通过偶联(在不外消旋手性中心的情况 下)被保护的三肽与适当的被保护的二肽，在去保护后形成五肽，等等。
如本文使用的术语"发情期'，指除人以外大多数雌性哺乳动物性冲动 的周期状态，其刚好在排卵前并且在此期间雌性最接受交配。发情周期由 下丘脑-垂体-卵巢-子宫轴管理的激素相互作用调节。
发情周期能分为三个时期1)卵泡或黄体退化期(发情前期)；2) 排卵前期(发情期和发情后期)；以及3)黄体期(发情间期)。发情周期 的第0天是发情日，即发情期能被看出的那天。然而，从生理学观点看， 发情周期以黄体(corpus luteus)的破坏起始，并且以下一个周期黄体的破 坏结束。发情前期通常持续3天，以前一个周期的黄体退化起始，并以发 情期的表现结束。当黄体^^皮坏时，出现孕酮水平的下降，并且稍后丧失 黄体组织；在这个过程中，子宫来源的前列腺素F2a (PGF2a)是家畜和大 多数啮齿动物中主要的黄体裂解剂。作为孕酮水平下降的结果，在下丘脑 水平这种激素的负反馈也下降，并且促性腺激素(FSH和LH)的搏动频率开 始增加，刺激卵泡生长形成大的卵泡并且增加雌二醇水平。当雌激素到达 某一水平时，对雄性的接受性被刺激并且起始了发情周期。
发情期和发情后期起始于对雄性的接受性，并且包括实现排卵和黄体 形成初始的所有变化。在持续约16小时至约24小时的发情期期间，母牛 通常显示不安和焦虑，频繁地吼叫以及丧失胃口。在奶牛情况下产奶量会 受影响。母牛出现阴道粘液性排除物，其味道对于公牛具有吸引力和兴奋作用(存在信息激素)，以及通过直肠指检容易检测的阴门水肿和子宫的 子宫肌层紧张性升高。
在这个期间，高浓度的雌激素达到下丘脑周期中心(hypothalamic cyclic center)的刺激阈，刺激下丘脑神经元产生促性腺激素释放激素 (GnRH)的峰并且因此产生LH峰。关于FSH，它的分泌下降是雌激素和抑 制素负反馈的结果，除了当LH排卵前的峰出现时能出现FSH峰的那个时 刻外。随后，在LH波后4至12小时，基础浓度和FSH脉沖宽度增加， 并且这个过程涉及卵泡生长的首波。
发情期开始后12至24小时，母牛的神经系统变得抗拒雌二醇，并且 发情期的精神表现(psychic manifestation)趋于停止。
紧随发情期结束的时期称为发情后期(6天)。在这个时期，母牛发生 排卵(不像其他的物种在发情期排卵)，产生细胞组织并且形成黄体。发 情期开始后28至32小时发生排卵而且通过LH排卵前的峰释放。排卵后 产生深度流血而且卵泡充满了血而成为血性体(hemorrhagic body)。
当黄体形成时(黄体化)，发生一系列形态学和生物化学改变，允许 卵泡细胞转化成黄体细胞。这些改变在第7天以功能性黄体的形成结束。
发情间期的特征在于黄体的优势。黄体的维持以及孕酮的合成涉及孕 酮营养的(progesterotrophic )和促黄体的LH激素。
参与孕酮合成的其他激素是FSH和前列腺素2 (PG2)。 FSH激素明显
加入位于黄体内的受体中并且引起孕酮分泌的增加。关于PG2，除了刺激
黄体细胞产生孕酮外，其可以增加在卵巢水平的血流量，对于孕酮的合成 和分泌具有积极作用。
如果卵子没有受精，黄体保持功能性直至第15-20天，之后其开始 退化以准备新的发情周期。
如本文使用的术语"非发情期"指循环生殖的雌性哺乳动物中，两个 发情期之间的性活动的间隔。
如本文使用的术语"产后间隔(PPI)"指分娩至发情期开始(发情前 期)之间的时间。本文使用的可互换的术语"产犊至首次产后排卵"和"分娩-受孕间 隔"指，分娩至发情期后期(发情后期)之间的时间。
如本文使用的术语"产后期"指恰在刚分娩后的时期，即从分娩持续
至恢复正常子宫大小的约6周的时期。
如本文使用的术语"哺乳"指非常年幼哺乳动物的喂养行为，而且是 从乳腺的乳头吸乳到年幼哺乳动物的口中。依照当前使用的实践，能随时 哺乳，或限制到每天的特定次数或整天限制。
如本文使用的术语"千乳期"或"奶牛干奶期"指分娩前停止产奶的 时期。依照当前使用的实践，为完成退化过程应用干乳期是必需的，在此 之后泌乳能力恢复到接近分娩时的水平。
本文使用的可互换的术语"断奶"和"牛犊迁出"，指当母亲处于泌 乳期时将哺乳幼仔与其母亲分开。
如本文使用的术语"早期断奶"指自然停乳过程之前的断奶而且发生
退化。具体地，术语"早期断奶"指从分娩后约2周至约15周断奶。从 分娩后约2周至少于约8周的断奶也称为"超早期断奶"。如本文使用的 术语"家畜-农业领域计划"指农用地的管理，其包括改变生长农作物与 作为牧场用地之间的土地用途。
如本文使用的术语"身体状况评分"指代表在某一时间点家畜动物(具 体是母牛)身体储备的分数。身体状况评分由目视观察母牛的臀部区域来 评分-主要是由髋骨分隔的区域(髋骨结节)、臀角(坐骨结节)和尾根。 背部脊推上"覆盖物，，的量也用来评分。通常母牛的评分等级是1至5。 极瘦的母牛评1分以及极肥的母牛评5分。
如本文使用的术语"家畜"指动物，例如肉牛、奶牛、绵羊、山羊、 马、猪、水牛和骆驼，其被饲养来用作食物或者用以产生家庭所用的食物 或者用于大规^莫生产和或用于获利，尤其对于农场而言。
如本文使用的术语"家畜健康"或"农场动物的健康"或"家畜舒适 度"指预防痛苦并且增加积极情感的出现，其通常称为舒适或愉快，其尤 其是下述因素的结果休息时间、躺下时间和反刍时间的增加，以及代谢需要、乳房压力、乳头漏乳、乳房炎发生率和其他疾病和高产奶量导致的 ^皮4亍影响的减少。
本发明的方法可以应用于雌性即将进入发情周期的任何哺乳家畜动 物。作为一个例子，并且预期不受限地，本发明指的是牛群。依照某些当 前优选的实施方式，本发明指的是肉牛群。
牛群的管理能针对产肉和/或产奶。生殖母牛的繁殖周期能划分为4个
时期奶牛干奶期；分娩准备期；分娩期；和泌乳期。这些时期的每个时 期都有特定的营养需求和激素特征。动物怀孕涉及大量花费，因为怀孕最 后一个月的需求高于应用到未怀孕动物的需求。群中分娩时间同步化是非 常有益的。如果产犊被定为日历年的第0天，群中第O天越同步，越容易 应用有益的管理方案。伺料供应能调整达到群的营养需求，而且其结果是， 改善了牛的生理状态并且同时解决了经济问题。分娩同步化直接取决于发 情期同步化。
然而，在奶牛产犊后通过控制营养和通过激素治疗，试图控制PPI、 发情期和卵泡的连续发展和排卵反应，^L证明是不可靠的。施用酪蛋白衍 生肽后奶牛的加速退化，在千乳期和紧随千乳期后其导致较少的乳房胂胀 和乳房内感染的危险，在产犊和产后期间产生较好的动物舒适度和身体状 况。在不受限于特定作用^^式时惊奇地发现，施用酪蛋白衍生肽控制了奶 牛的PPI,最主要是通过缩短PPI，并且紧随其迅速开始的排卵和发情期表 达。
因此，依照一个方面，本发明提供一种用于在泌乳动物中诱导发情期 的方法，其包括施用给所述动物有效量的衍生自酪蛋白的至少 一种肽。
依照某些实施方式，至少一种酪蛋白衍生肽应用于群中多头泌乳家畜 动物，因此同步化多头泌乳动物的发情期。
如本文使用的用语"衍生自酪蛋白的肽"或"酪蛋白衍生肽"指下述 肽其是酪蛋白的裂解产物(本文指的是衍生自天然酪蛋白的肽)，相应 于酪蛋白单位的氨基酸序列化学合成的合成肽(本文指的是衍生自酪蛋白 的合成肽)，以及与酪蛋白相似的(同源的)肽，例如特征在于以下的肽含有一个或多个氨基酸的置换、插入或删除，例如但不限于保留置换，条
件是只要其保留至少70%、优选至少80%、更优选至少90%的相似性，
以及其功能同系物。如本文使用的术语"同系物"和"功能同系物"指肽， 所述肽含有任何插入、删除和置换但其不会影响如本文描述的肽的生物活性。
依照本发明教授的内容能使用酪蛋白衍生肽的任何组合。术语"组合" 被定义为任何上文提及的天然的或合成的酪蛋白衍生肽，与 一 种或多种添 加剂及非相同肽结合于混合物中。如本文使用的术语"混合物，，被定义为 肽的非共价组合，所述肽以彼此间各种比例存在。
依照某些实施方式，衍生自酪蛋白的肽是磷酸肽，其包括活性基序
Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu Glu (SEQ ID NO: 1)，及其类似物、衍生物或片段。 应该理解任何含有这种基序的肽，无论是衍生自酪蛋白，衍生自酪蛋白以 外的蛋白，还是合成性合成或通过重组技术产生，只要其保持了如本文描 述肽的生物活性，那么其也包括在本发明的范围内。本发明的磷酸肽通过 含有如SEQ ID No. 2-5中任一项所阐述的氨基酸序列的肽举例说明，列表 如下
SEQ ID NO序 歹'J来 源残基号
SEQIDNO:2RELEELNVPGEIVES(P)LS(P)S(P)S(P)EESITRp-酪蛋白1—25
SEQ ID NO :3QMEAESIS(P)S(P)S(P)EEIWDSVEQKaSl -酪蛋白59—79
SEQ ID N04KNTMEHVS(P)S(P)S(P)EESIISNETYKaS2 -酪蛋白1一21
SEQIDNO:5NANEEEYSIGS(P)S(P)S(P)EESAEVATEEVKaS2 -酪蛋白46—70
术语"类似物"包括，含有本发明肽通过氨基酸置换、添加、删除或 者化学修饰而改变的序列，并且保有所述肽的生物活性的任何肽。"氨基 酸置换"是指用功能等同的氨基酸残基置换序列内的残基而产生沉默突变
(silent change )。例如，序列内 一个或多个氨基酸残基能^皮相似极性的另 一个M酸置换，其充当功能等同物而产生沉默突变。用于置换序列内氨基酸的氨基酸可以选自所述序列内氨基酸所属类的其他成员。例如，非极 性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯 丙氨酸、色氨酸和曱硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨 酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电(碱性)氨基酸包 括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨 酸。这种置换已知为保守置换。另外地，能在氨基酸中使用对肽的生物活 性没有影响的非保守置换。应理解本发明包括了肽类似物，其中至少一个 氨基酸-故另一个氛基酸置换，与本文列举的肽相比、其产生了具有稳定性 增强或较长半衰期的本发明肽的活性类似物。
当SEQ ID NO:l至5阐述的肽序列的氨基酸残基都是"L"异构形式 时，只要肽类似物保持其活性，"D"异构形式的残基能置换任何L氩基酸 残基。产生逆反D氨基酸肽类似物的方法是本领域公知的，其中所述肽用 所公开的同样的氨基酸制成，但至少一个或多个氨基酸(包括全部氨基酸) 是D氨基酸。当肽类似物中所有的氨基酸是D氨基酸，并且肽类似物的 N-和C-末端被反转时，产生与L氨基酸形式的肽在相同位置具有相同结构 基团的类似物。然而，肽类似物对于蛋白水解的降解作用更稳定，而因此 在本文叙述的许多应用中都有用。
术语"衍生物"指含有氨基酸序列的肽，其包括本发明肽的氨基酸序 列，其中一个或多个氨基酸残基通过侧链或官能团的反应遭受了化学衍生 作用，其中这种衍生作用没有破坏肽衍生物的活性。氨基酸残基的化学衍 生作用包括但不限于，糖基化、氧化、还原、十四烷基化、硫酸化、酰化、 乙酰化、ADP核糖基化、酰胺化、环化、二硫键形成、羟基化、碘化和甲 基化。
依照本发明原理的肽衍生物也包括键的修饰，包括但不限于CH2-NH、 CH2-S、 CH2-S=0、 OC-NH、 CH2-0、 CH2-CH2、 S=C-NH、 CH-CH和CF=CH， 以及骨架修饰。肽内的肽键(-CO-NH-)可以被置换，例如由N-曱基化的键 (-N(CH3)-C0-);酯键(-C(R)H誦C-O-O-C(R)-N);亚甲基酮(ketomethylene) 键(-C0-CH2-); a-氮杂(a-aza)键(-NH-N(R)-CO-)，其中R是任何烷基例 如甲基；碳酰(carba)键(-CH2-NH-);羟乙基键(-CH(0H)-CH2-);硫代酰胺键(-C二S-NH-);烯烃双键(-CI^CH-);以及肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)来 置换，其中"R"是天然出现在碳原子上的"正常"侧链。这些修饰能够 沿肽链发生在任何4建上，并且甚至在几处(2-3)同时发生。
本发明也包括那些肽，所述肽中的自由氨基被衍生而形成胺盐，其包 括但不限于盐酸化物、对甲苯磺基、千氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或 曱酰基。自由羧基可被衍生形成例如，盐、甲酯和乙酯或其他类型酯或酰 肼。自由羟基能被衍生形成例如，O-酰化或O-烷化衍生物。组氨酸的咪唑 氮能一皮衍生形成N-内-千基组氨酸(N-im-benzylhistidine )。
也包括作为化学衍生物的那些肽，其包括一个或多个天然存在的具有 20个标准氨基酸残基的氨基酸衍生物。例如4-鞋脯氨酸能置换脯氨酸； 5-羟赖氨酸能置换赖氨酸；3-曱基组氨酸能置换组氨酸；高丝氨酸能置换 丝氨酸；以及鸟氨酸能置换赖氨酸。肽也能含有非天然氨基酸。非天然氨 基酸的非限制性例子是正亮氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、二氨基丁酸、高丝氨 酸、高半胱氨酸、异丙基Lys、 3-(2'-萘基)-Ala、烟酰Lys、氨基异丁酸和 3-(3'-吡咬基-Ala)。肽也可以含有非蛋白质侧链。除了上述内容之外，本发 明的肽也能包括一个或多个非氨基酸单体或寡聚体(例如脂肪酸、复合糖 及类似物)。也包括任何含有一个或多个添加的氨基酸残基的肽，所添加 的氨基酸残基涉及在上文中列举的肽的序列，只要必要的活性而且优选分 子量纟皮保持。氨基酸残基能加入到氨基端和/或羧基端和/或沿肽序列加入。
依照本发明的肽衍生物也能是环肽。例如通过形成酰胺键能获得环 化，例如通过在链中不同位置(-CO-NH或-NH-CO键)掺入Glu、 Asp、 Lys、 Orn、 二氨基丁(Dab)酸和二氨基丙(Dap)酸进行。通过合并式 H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-COOH或H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-NH2的修 饰的氨基酸，也能获得骨架与骨架的环化，其中11=1-4,并且进一步，其 中的R是任何天然或非天然的氨基酸侧链。也可考虑骨架与侧链以及侧链 与侧链的环化。
通过掺入2个Cys残基形成S-S键也可能形成环化。经由式 -(-CH2-)n-S-CH2-C-(其中n = 1或2 )的相互作用键(interaction bond )的
形成，能获得另外的侧链与侧链的环化，这是可能的，例如通过掺入Cys或同型Cys,以及将其自由的SH基与例如溴乙酰化的Lys、 Orn、 Dab或 Dap反应。
如本文使用的术语"片段"指相对于本文列举的肽序列含有一个或多 个氨基酸残基删除的肽，只要其保持必要的活性。氣基酸残基可从氨基端 和/或羧基端和/或沿肽序列删除。
通过化学合成、重组DNA技术，或者通过将本文列举的肽经受至少 一种裂解剂处理能产生肽片段。裂解剂能是化学裂解剂例如溴化氰，或者 酶例如外蛋白酶或内蛋白酶。能用于裂解本发明肽的内蛋白酶包括胰蛋白 酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶或者产生蛋白水解片段的本领 域已知的任何其他的酶。
如在上文中所描述，本发明的肽能通过水解酪蛋白获得，或者所述肽 能合成地获得。
酪蛋白的水解能以本领域技术人员已知的任何方法进行。用于水解酪 蛋白的酶包括衍生自动物的酶例如，胰酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、 中性蛋白酶(neutrase )、碱性蛋白酶(alcalase )、胃蛋白酶、羧肽酶、组 织蛋白酶及类似物；衍生自植物的酶例如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶及类似 物；衍生自微生物例如乳酸杆菌、酵母、真菌、枯草杆菌、放线菌、曲霉、 溶酪微球菌及类似微生物的酶。通常，用胰蛋白酶消化进行酪蛋白的水解。 然后从含肽溶液中分离未消化的酪蛋白，通过本领域已知的适当方法将其 从其他杂质中进一步纯化。
如本领域技术人员已知，有计划的繁殖管理计划具有许多优点和益 处，并且通常能描述为包括下列方面其允许计划产犊的时间和日期-在 早年授精的母牛与晚年产犊的那些相比，在季节早期具有较长的产犊有效 期(lifetime);能使家畜-农业领域计划用于本领域的适当用途并且改善 轮流放牧，确保饲料的有效分配以满足群中个体的生理饲养需要，其中母 牛达到产犊时具有的良好身体状况(2.75-3.50的身体状况评分)，显示较 好的发情期诱导并且变为在限定的生殖季节怀孕；能设计产犊和授精，最 佳化人的工作和受孕率；降低每个群中公牛数量，允许投资具有优秀遗传 基因和特性的公牛；改善牛犊有关的工作，允许其在同族群中分散；增加发情期系统的耐受能力，因此避免对自然周期的依赖；促进对于接种疫苗 程序的依/人性并且改善其效力。
应用依照本发明诱导发情期的方法，允许在产后期的末尾立即出现发 情期，并且因此缩短了产后间隔(PPI)。缩短PPI是非常期望的。已显示当
分娩-发情期间隔从60天增至120天时，怀孕百分比线性下降。此外， 当这个间隔延长时，这种分娩-首次发情期关系显示相当大千克的牛犊体重 的下降。发情期诱导和同步化的结果是，更多的母牛在下一年的早期产犊 并且在下一年的同步化与管理效率一致。
自然地，管理决策和程序对于分娩-受孕间隔有一些影响，但是后者 主要由下列因素决定产犊后排卵周期的重建；在周期的适当时间出现的 发情期；配种后的怀孕率。当发情期受精增加时，怀孕率几乎呈线性增加。 斜率取决于分娩-发情期间隔并且当这个间隔缩短时其会增大。
不希望受到任何理论或作用^^莫式的限制，通过施用依照本发明方法的 衍生自酪蛋白的至少一种肽而获得的发情期诱导，可以归因于激素分泌的 类型和时间的变化。在产犊后期间，泌乳的雌性在开始正常的排卵周期之
前经受其能量平衡中的重要变化。这种负能量平衡主要由泌乳产生的能量 损失引起，并且其大于在食物中重获得的能量。这种负平衡与激素血浆分 布有关，其决定了卵泡动态的较低活性并且产生缺乏发情期和排卵的结 果。机体状况评分低于2.5的母牛具有降低的LH脉冲频率、降低的卵巢 活动并延迟返回分4免后发情期。产犊后LH脉冲式分泌的重建，产生正常 卵泡动态的重新开始。发情周期的早期开始成为早期受孕的决定因素。首 次排卵的时间决定和限制了发情周期的数量，首次排卵很可能在首次授精 前出现，在产犊后60天期间以前发情次数越多，首次授精受孕的机会越 高(例如在产犊后60天期间以前，对于0次发情期和4次发情期的母牛， 每次受孕分别要进行2.60和1.75次授精尝试)。生产者的目标应该是使母 牛在第一次或第二次授精时受精；另外，开放母牛天数增加以及产犊-受 孕期延长，导致受精率的下降以及形成繁殖的减少。酪蛋白衍生肽提供了 一种诱导所需发情期，并且控制产后间隔以及改善上文描述的负能量平衡 的方法。群的繁殖不仅取决于幼仔的数量，而且取决于屠宰前增加的体重。决 定牛犊体重的一个参数是如在上文中描述的产后间隔(PPT);另一个重要的
参数是断奶期强加给牛犊的应激。自然地，牛断奶发生在产犊后约6至7 个月。肉牛群的现代管理实践采用在4至8周断奶。早期断奶有不多的益 处，包括下列方面
-其帮助控制繁殖周期。
-牛犊能根据其遗传潜力生长而不用顾及其母亲的产奶量。
-在干旱期间或食物短缺的其他时期，对于更有效的饲养利用可能是 关键的。
-其降低了饲料消耗，与母牛养育其牛犊相比，早期断奶牛犊和其母 亲飼养只需15至20%的较少的能量，并且早期断奶牛犊具有较佳的伺料 转化率。
-其适合于秋季产犊，其中大量的冬季飼养则另有要求。
-早期断奶允许对更多的母牛进行限制性飼料供给。
然而，早期断奶给牛犊和其母亲强加了严重的应激，形成繁殖力和利 益的减少。为避免严重体重损失，应使用高质量和高价的牛犊营养品；应 激降低了母亲的身体状况评分并且不利地影响下一个生殖周期。而且，预 期增加的高产奶量由于早期断奶可能会损失，由于处于应激的母亲产生下 降的产奶量，以及由于母亲和幼仔身体状况普遍下降。
本发明现在公开了 一种用于诱导哺乳幼仔无应激早期断奶的方法，其 包括施用给泌乳动物有效量的衍生自酪蛋白的至少一种肽。
本发明方法的益处在于其能决定断奶所需的时间，从产犊后几天至几 个月，而且幼仔有选择留在其母亲身边，这样对于幼仔和其母亲的断奶过 程变得无应激，并且观察到体重和普遍状况没有下降。
此外，本发明现在公开了，施用酪蛋白衍生肽到泌乳动物(具体而言 母牛)的乳腺，以减少乳房压力，已知乳房压力是对于母亲引起严重应激、 缺乏舒适度，易感于疾病和健康下降的另一个因素。突然停止产奶的过程和之后的乳房退化，引起泌乳动物的痛苦并且导 致其行为改变。后者由增加了行走和减少了躺下时间而显示。用酪蛋白衍 生肽治疗后的快速退化，其在约6小时至4天内降低了乳的合成而预防这 种不适。这通过增加的躺下行为和反刍时间来显示。不希望受到任何特定 模式或作用机制的限制，这种现象可以归因于酪蛋白衍生肽对于乳房压力 的作用，施用本发明肽后乳房压力极大地减小。
因此，由于后代体重的增加而且通过避免摄食过度，本发明的方法提 供了增加的收益率。
依照本发明的方法酪蛋白衍生肽能以本领域技术人员已知的任何适 当的药物组合物和制剂施用。
如本文4吏用的"药物组合物"指如本文描述的酪蛋白衍生肽，与其他 化学组分(例如生理学上适合的载体和赋形剂)的制剂。药物组合物的目 的是促进化合物到生物体的施用。如本文使用的术语"活性成分"指负责 生物效应的化合物。可以交换使用的术语"生理学上可接受的载体"和"药 学上可接受的载体"指载体或稀释剂，其对于生物体不会引起明显的刺激， 并且不会破坏所施用肽的生物活性和特性。术语"赋形剂"指添加到药物 组合物中以进一步促进化合物的施用的惰性物质。赋形剂不受限的例子包 括各种糖和类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
关于配制和施用药物的#支术可以在"Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa.,最新版中发现，其内容通过引 用并入本文。
依照本发明方法使用的药物组合物可以以传统的方式配制，使用一种 或多种含有赋形剂和辅剂的生理学上可接受的载体，其促进活性成分加工
成能在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的施用途径。
对于注射，本发明的肽可以在含水溶液中配制，优选地在生理学上相 容的緩沖液例如Hank's液、Ringer's液或生理盐水緩沖液中配制。
以本发明方法使用的肽的制剂，可为肠胃外的(乳房内)施用而配制， 例如通过快速注射或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂量形式存在，例如以含有可选择地添加防腐剂的安瓿或多剂量容器形式。组合物可 以是油性或水性媒介中的混悬液、溶液或乳剂，并且可以含有配制剂例如 助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
以本发明的方法适合使用的药物组合物包括，其中包含有效量活性成 分而获得预期目的的组合物。更具体地，有效量指有效诱导发情期同步化 和早期断奶的量。
实施例
实施例l:肉牛中发情期的诱导和同歩化
目的
本研究的主要目的是诱导和同步化产犊后肉用母牛返回发情期，其通 过根管内施用酪蛋白衍生肽到每个乳头区域。第二个目的是施用肽后在不 超过60天内获得成功的受精，以及在母牛中有效地达到高的身体和性能 评分。
治疗的成功的结果被认为是，施用狀后至少80%的母牛被诱导的发情 阶段达到20天，以及达到第三脉沖的被治疗母牛至少有70%受孕。
研究设计
临床试验设计为两个方案(分组(arm))的案例-对照研究。"分组 30"指产日后30天断奶的牛犊。"分组60"指产后60天断奶的牛犊。
"案例"和"对照"是预产期前至少14天登记的肉用母牛。对于依 照所计划的分组(产后30或60天)的这两个组按计划地断奶。案例接受 酪蛋白衍生肽的乳房内施用，而对照不接受任何乳房内施用。案例和对照 母牛生活在相同的群，处于产犊后(相同的出生日土60天)相同的时期(± 180天)，并且泌乳相同时间(± 90天)，并且至少平行14天。对于每个方 案，总共登记30头母牛，15头案例和15头对照。
酪蛋白衍生肽的治疗是在一天期间每天施用1-2次。
参加这项研究的母牛的选入标准是:预产期前2周的晚妊娠阶段母牛；有健全四肢(four functional quarters )的母牛；怀孕母牛-首次或多次怀孕； 有或没有确认的乳房内感染的母牛，其接受或未接受先前的治疗；没有明 显外部乳头损伤的母牛；在过去8周内没有全身治疗；在过去8周内没有 以抗生素添加剂飼养；缺乏并存病，其被认为对于研究者判断治疗结果具 有潜在影响。
参加这项研究的母牛的淘汰标准是研究开始的8周内有先前的免疫 治疗；在研究开始前8周内，有全身性或通过喂养的，先前的抗生素、激 素、抗炎症和合成代谢的治疗；共存交替治疗；有研究者能判断的活性结 核或其他感染性疾病的母牛；全身性或通过喂养而并发地使用了促同化激 素(anabolic steroid);全身性或通过喂养而并发地使用了激素。
临床试验的总持续时间是120天(17周)左右，包括对现场(群)的 二十二 (22)次探视，如下述
第一个阶段基线/篩选探视过程包括从产犊前15天至产犊后30天， 对于所有参加研究母牛进行至少6次探视。对于研究场所的探视是在产犊 前第15和第7天进行，在产犊日探视和在治疗前探视3次。
第二个阶段取样，从分组30开始，授精和跟踪观察分组30，包括 至少7次探视-从产犊后第30天直到第52天在第30天探视一次以取 样和断奶，断奶后连续3天探视(第31 、 33和34天)，以及3次探视(第 38天、第45天-授精日和第52天)直到分组60开始。
第三个阶段分组60开始并且跟踪观察分组30,包括至少4次探视 -从产犊后60天直到第64天(在第60天探视一次以取样和断奶分组60, 断奶后连续3天探视(第61 、 63和64天))。
第四个阶段分组30跟踪观察的结束以及分组60的授精，包括至少 2次探视(第68天，及第75天-授精日)。从产犊日第75天，结束对于 分组30的案例和对照的跟踪观察。授精登记在分组60的母牛。
第五个阶段分组60跟踪观察的结束以及临床试验的结束，包括3 次探视(第82、 91和105天)。
在研究期间对案例和对照进行临床检查，包括乳房检查、具体的临床系统、体重和怀孕状况。采乳样化验脂肪百分比、蛋白百分比、乳糖百分
比、体细胞计数以及细菌学检查。采血样主要化验雌激素、孕酮、LH、 FSH 和前列腺素。
安全性量度包括生命征象、体格;险查、偶发疾病、评估不良事件和细 菌检验。
在本研究的末尾，测量了下述终点乳腺分泌；通过脉沖的受孕率； 受精率；产犊和/或断奶后受精用时；断奶后母牛体重；感染性疾病的出现。
施用酪蛋白衍生肽后停止泌乳的效率如下衡量非常成功1-4天内 停止；5-8天、成功；9-15天、小成功；停止泌乳需要16或更多天、 不成功。
从酪蛋白衍生肽的施用日直到排卵日来测量PPI长度。PPI少于12至 20天被认为非常成功；21至24天、成功；25-29天、小成功；30或更 多天的PPI长度、不成功。
成功的受孕率按下述内容衡量80%或更高、非常成功；70%至79 %、成功；50%至69%、小成功；49%或更低、不成功。
出现下迷情况任一项时停止临床试验完成研究；筛选失败；被群的 主人拒绝；母牛遭受无法忍受的不良事件；牛犊遭受无法忍受的不良事件； 违反选入/淘汰标准；研究者认为需要停止本研究的任何因素或情况。
实施例2:牛犊断奶
乳房压力的增加与突然停止哺乳有关，其形成漏乳以及对于泌乳动物 的剧痛。因此母亲和幼仔的应激与牛犊断奶有关，这种应激导致体重下降 并且易感于疾病。
目的
不分离牛犊和母牛的早期断奶的本研究的主要目的是，测定肉用母牛 和其牛犊间接触的、断奶后连续不哺乳的程度，以降低终止喂奶对于母牛 和牛犊行为和生长的不利影响。第二个目的是在断奶后通过行走和躺下时间以及通过其体重变化测
量(直到断奶后15天)母牛和牛犊的不良应激行为(behavioral distress )。 研究设计
试验_没计为二个方案(分组)的案例-对照研究。"分组30"指产后 30天断奶的牛犊。"分组60"指产后60天断奶的牛犊。
"案例"和"对照"是预产期前至少14天登记的肉用怀孕母牛，并 且设法早期断奶(在产后30天或60天)。取样的案例接受酪蛋白衍生肽 的乳房内施用。对照不接受任何乳房内施用。
对于母牛以及研究条件的选入和淘汰标准如上文中实施例l所描述。 酪蛋白衍生肽的治疗是在一天期间每天施用l-2次。
参加这项研究的牛犊的选入标准是晚妊娠阶段出生的牛犊-至少 230天；能立即行走的牛犊；无明显外部损伤的牛犊；体重至少50Kg的 牛犊；用抗寄生虫药治疗和抗呼吸道疫苗治疗的牛犊；缺乏并存病，其对 于研究者判断治疗结果具有潜在影响。
参加这项研究的牛犊的淘汰标准是在研究期间发生阉割；有共存交 替治疗的牛犊；有研究者能判断的活性结核或其他感染性疾病的牛犊。
临床试验的总持续时间是120天(17周)左右，包括对现场(群)的 二十(20)次探视，如下述
基线/篩选探视过程包括从产犊至产犊后30天，对于本研究中所有参 与者进行至少4次探视。对于研究场所的一次探视是在产犊日进行并且在 治疗前进行3次探视。跟踪观察探视(如上文中实施例1所描述)直到第 五个阶段的结束。
在产后15天，母牛随机地以奇偶数和年龄被分批到2个断奶日组(在 产犊后30或60天)中的一个，并且接受(案例)或不接受(对照)酪蛋 白衍生肽的乳房内施用。称重母牛和牛犊，并且在产犊后和断奶前立即评 估其身体状况评分。身体状况评分采用0-5的等级评估，其中0代表严 重消瘦而5 ^表肥胖。在产后的断奶日(30和60天)，母牛-牛犊对^L移到大的围栏场地。 位于围栏的案例母牛-牛犊对，在每个围栏中不超过8对。对照母牛-牛 犊对一皮移到单独的远的围栏。
母牛以提供给每头母牛每天90-100 MJ可代谢能量的能量饮食祠养 (这接近于对于460-kg肉用母牛产生约7-8 Kg奶并且没有体重变化的、 推荐水平的100 % )。这种饮食包括60 %的草青贮飼料和40 %的浓缩物(大 麦、大豆、矿物质和维生素；16%的粗蛋白)。在断奶和治疗日前，根据 产犊日在组中圈养的母牛不超过8头。在断奶后第一天之后，牛犊用蛋白 质、维生素和矿物质飼养以满足标准需要，并且在生长阶段以几乎恒定的 量饲养。在断奶后第一天期间牛犊仅接受水。
案例和对照的行为通过腿部安装的遥测系统测量。这个系统能监视和 记录行走、躺下次数和躺下时间的累计的记录。这个感应器具有数据存储 和传输能力，并且含有集成的能源足以使用至少一个月。在跟踪观察期间 收集的数据从感应器每周下载一次。
安全性量度包括生命征象、体格检查、偶发疾病、以及评估不良事件。
在本研究的末尾，测量了下述终点
施用酪蛋白衍生肽后停止泌乳的效率如下衡量1 - 4天内停止；5-8 天、成功；9-15天、小成功；停止泌乳需要16或更多天、不成功。
从断奶至断奶后30天，母牛身体状况评分进行如下非常成功-体 重没有变化或者增加；0至0.5分的较低的评分-成功；0.5至1分的较低 的评分，小成功；l.O或更高分的较低的评分，不成功。
从断奶至断奶后30天，母牛的体重情况评估如下非常成功，没有 变化或者增加；体重下降达到5%，成功；体重下降5%至10%之间，小 成功；体重下降10%或更多，不成功。
从断奶至断奶后30天，牛犊的体重情况评估如下非常成功-增加 IO或更高百分比；增加5至9个百分比，成功；没有变化至增加4个百分 比，小成功；以及体重降低，不成功。
母牛和牛犊的行为通过行走以标准值评估如下非常成功-减少io或更多百分比；成功-减少5至9个百分比；小成功-没有变化或者增加 /减少至4个百分比；不成功-增加5或更多百分比。
母牛和牛犊的行为通过躺下时间以标准值评估如下非常成功-增加 10%或更多；成功，增力。5%至9%;小成功-没有变化或者增加/减少至 4%;不成功-减少5%或更多。
出现下述情况任一项时停止临床试验
完成研究；筛选失败；被群的主人拒绝；母牛遭受无法忍受的不良事 件；牛犊遭受无法忍受的不良事件；违反选入/淘汰标准；研究者认为需要 停止本研究的任何因素或情况。
实施例3:奶牛的发情期诱导和同步化
目的
本研究的主要目的是诱导和同步化产犊后奶牛返回发情期，在干乳期 之前通过根管内施用酪蛋白衍生肽到每个乳头区域。第二个目的是在施用 日后不超过105天达到成功的受精。
治疗的成功的结果被认为是，施用后至少80%的母牛纟皮诱导的发情阶 段达到20天，以及达到第三脉冲的被治疗母牛至少有70%受孕。
研究设计
临床试验设计为案例-对照研究。
"案例"和"对照"是预期的干乳期前至少14天登记的奶牛。取样 的案例接受酪蛋白衍生肽或酪蛋白水解产物(CNH)的乳房内施用，而取样 的对照不接受任何乳房内施用。
案例和对照母牛生活在相同的群，处于产犊后(相同的出生日士60天) 相同的时期(± 180天)，并且在相同时间泌乳(± 90天)，并且至少平行 14天。
酪蛋白衍生肽(或CNH)的治疗是在一天期间每天施用1-2次。对 于参加本项研究的奶牛的选入和淘汰标准如上文中实施例1中定义的标准。
临床试验的总持续时间是120天(17周)左右，包括对现场(群)的 十三(13 )次探视，如下述
第一个阶段基线/篩选探视过程，其包括从千乳期前15天至治疗曰， 对于本项研究的所有参与者进行至少2次探视。对于研究场所的探视是在 治疗前第15和第7天进行，以及在干乳期的开始时进行。
第二个阶段取样日和治疗日，包括盲选案例和对照，以及乳房内治疗。
第三个阶段在干乳期期间，从治疗日的第1天至第60天或产犊日， 进行至少4次探视。
第四个阶段产犊和授精，直到跟踪观察的结束包括至少6次探视。 在第四个阶段期间，在产犊日进行一次探视，而且在接下来的三周期间对 于授精和跟踪观察进行至少3次探视。
在研究期间对案例和对照进行临床检查，包括乳房检查、具体的临床 系统，体重和怀孕状况。采乳样化验脂肪百分比、蛋白百分比、乳糖百分 比、体细胞计数以及细菌学检查。采血样主要化验雌激素、孕酮、LH、 FSH 和前列腺素。
安全性量度包括生命征象、体格检查、偶发疾病、评估不良事件和细 菌检验。
在本研究的末尾，测量了下述终点产犊前乳腺分泌，通过脉冲的受 孕率；受精率；产犊和/或断奶后的受精；产犊和/或断奶后母牛体重；母 牛的感染性疾病。
施用酪蛋白衍生肽后停止泌乳的效率如下衡量非常成功l-4天内 停止；成功，5-8天；小成功，9-15天；不成功，停止泌乳需要16或 更多天。
从产犊和/或断奶日直到排卵日来测量PPI长度。成功的结果被评估如 下非常成功-少于12至20天；成功-21至24天；小成功-25至29天；不成功-30或更多天。
授精率评估如下非常成功-80或更高百分比；成功-65至79个百 分比；小成功-50至64个百分比；不成功-49或更低百分比。
出现下述情况任一项时停止临床试验完成研究；筛选失败；被群的 主人拒绝；母牛遭受无法忍受的不良事件；牛犊遭受无法忍受的不良事件； 违反选入/淘汰标准；研究者认为需要停止本研究的任何因素或情况。
上文描述的具体实施方式
充分地显示了本发明的一般性质，以致于其 他人可以通过应用当前知识容易地修改和/或适应于各种应用，这种具体的 实施方式无过多的实验并且没有脱离通用概念，因此这种适应和修改应该 并预期包括所公开实施方式等同的意义和范围。应理解，本文使用的措辞 和术语是为了描述的目的，而不是为了限制。在不脱离本发明的前提下， 执行各种所公开功能的方法，材料和步骤可以采取许多种可选择的形式。
权利要求
1.一种用于在泌乳家畜动物中诱导发情期的方法，其包括施用给所述动物有效量的衍生自酪蛋白的至少一种肽。
2. 根据权利要求1所述的方法:后约2天至约120天。
3. 根据权利要求2所述的方法:后约2天至约50天。
4. 根据权利要求1所述的方法， 天至分娩后约150天施用。
5. 根据权利要求4所述的方法， 至分娩后约90天施用。
6. 根据权利要求4所述的方法， 至分娩后约60天施用。
7. 根据权利要求4所述的方法， 至分娩后约30天施用。
8. 根据权利要求1所述的方法， 羊、绵羊、猪、骆驼和水牛组成的组(
9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述发情期出现在施用所述肽其中所述发情期出现在施用所述肽其中所述至少一种肽在分娩前约70其中所述至少 一种肽在分娩后立即其中所述至少 一种肽在分娩后立即其中所述至少 一种肽在分娩后立即其中所述家畜动物选自由奶牛、山一种酪蛋白书于生肽被应用于群中多头泌乳家畜动物，因而同步化了所述群中泌乳动物的发情期,
10. 根据权利要求9所述的方法， 和猪群组成的组。
11. 根据权利要求9所述的方法， 畜动物。
12. 根据权利要求11所述的方法,
13. 根据权利要求11所述的方法:
14. 一种用于在群中诱导至少70 其中所述群选自由肉牛群、奶牛群其进一步包括授精所述群中多头家其中授精后的受孕率是至少70%。 其中授精后的受孕率是至少75%。 ,受孕率的方法，其包括为所述群的多头家畜动物施用有效量的衍生自酪蛋白的至少一种肽。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述受孕率是至少70%。
16. 根据权利要求1或14所述的方法，其中所述至少一种肽是磷酸肽。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自酪蛋白亚 型，所述酪蛋白亚型选自由aSl-酪蛋白、aS2-酪蛋白和p-酪蛋白组成 的组。
18. 根据权利要求16所述的方法，其中所述磷酸肽包括如SEQ ID NO:l阐述的氨基酸序列，其片段、类似物或衍生物。
19. 根据权利要求17所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自aSl _酪蛋 白，其包括如SEQIDNO:3阐述的氨基酸序列，其片段、类似物或衍生物。
20. 根据权利要求17所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自aS2 -酪蛋 白，其选自下述组含有如SEQIDNO:4阐述的氨基酸序列的肽，含有如 SEQIDNO:5阐述的氨基酸序列的肽，以及其类似物、衍生物或片段。
21. 根据权利要求17所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自(3 -酪蛋白， 其包括如SEQIDNO:2阐述的氨基酸序列，其类似物、衍生物或片段。
22. 根据权利要求1或14所述的方法，其中所述衍生自酪蛋白的至 少一种肽是通过水解酪蛋白获得的。
23. 根据权利要求1或14所述的方法，其中所述衍生自酪蛋白的至 少一种肽是合成的肽。
24. 根据权利要求1或14所述的方法，其中所述至少一种肽施用到 泌乳动物的至少一个乳腺中。
25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种肽同时施用到 所述泌乳动物的全部乳腺中。
26. 根据权利要求24所述的方法，其中所述施用通过选自下述组的 方法进行才艮管内注射，经由附着到所述家畜乳房的贴片应用以及经由浸 泡所述家畜乳房应用。
27. 根据权利要求1或14所述的方法，其中所述至少一种肽施用至 少一次。
28. 根据权利要求1或14所述的方法，其中所述至少一种肽以约6 小时至约24小时的间隔施用1至5次。
29. —种用于诱导哺乳幼仔的无应激断奶的方法，其包括在断奶前施 用给泌乳动物至少一天的有效量的衍生自酪蛋白的至少一种肽。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述泌乳动物选自由奶牛、 山羊、绵羊、猪、 -膝駝和水牛组成的组。
31. 根据权利要求29所述的方法，其中断奶在分娩后约2周至约15 周开始。
32. 根据权利要求31所述的方法，其中断奶在分娩后约4周至约8 周开始。
33. 根据权利要求29所述的方法，其中所述幼仔和所述泌乳动物断 奶后基本上没有体重下降。
34. 根据权利要求29所述的方法，其中所述泌乳动物和所述幼仔断 奶后的身体状况评分与断奶前基本一样d
35. 根据权利要求29所述的方法，其中所述至少一种肽是磷酸肽。
36. 根据权利要求35所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自酪蛋白亚 型，所述酪蛋白亚型选自由aSl-酪蛋白、aS2-酪蛋白和卩-酪蛋白组成 的组。
37. 根据权利要求35所迷的方法，其中所述磷酸肽包括如SEQ ID NO:l阐述的氨基酸序列，其片段、类似物或衍生物。
38. 根据权利要求36所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自aSl-酪蛋 白，其包括如SEQIDNO:3阐述的氨基酸序列，其片段、类似物或衍生物。
39. 根据权利要求36所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自aS2-酪蛋 白，其选自下述组含有如SEQIDNO:4阐述的氨基酸序列的肽，含有如 SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的肽，以及其类似物、衍生物或片段。
40. 根据权利要求36所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自卩-酪蛋白， 其包括如SEQ ID NO:2阐述的氨基酸序列，其类似物、衍生物或片段。
41. 根据权利要求29所述的方法，其中所述衍生自酪蛋白的至少一 种肽是通过水解酪蛋白获得的。
42. 根据权利要求29所述的方法，其中所述衍生自酪蛋白的至少一 种肽是合成的肽。
43. 根据权利要求29所述的方法，其中所述至少一种肽施用到所述 泌乳动物的至少 一个乳腺中。
44. 根据权利要求43所述的方法，其中所述至少一种肽同时施用到 所述泌乳动物的全部乳腺中。
45. 根据权利要求43所述的方法，其中所述施用通过选自下述组的 方法进行根管内注射，经由附着到所述家畜乳房的贴片应用以及经由浸 泡所述家畜乳房应用。
46. 根据权利要求29所述的方法，其中所述至少一种肽在断奶前约1 天至约10天施用。
47. 根据权利要求46所述的方法，其中所述至少一种肽在断奶前约3 天施用。
48. 根据权利要求29所述的方法，其中所述至少一种肽以约6小时 至约24小时的间隔施用1至10次。
49. 根据权利要求29所述的方法，其中所诱导的断奶没有不利地影 响所述泌乳动物和所述幼仔的舒适度。
全文摘要
本发明涉及用于控制家畜繁殖周期和断奶的方法，具体而言涉及酪蛋白衍生肽用于诱导发情期并且缩短非发情期的间隔的用途，使得早期断奶不会不利地影响家畜的健康。本发明进一步涉及家畜群的发情期同步化以及家畜管理计划。
文档编号A23J3/00GK101553127SQ200780021666
公开日2009年10月7日 申请日期2007年4月11日 优先权日2006年4月11日
发明者乔斯·马里奥·伊斯柯维奇 申请人:米勒尤迪斯公司;以色列农业及乡村发展部农业研究组织