新型犬流感病毒及用于它的疫苗的制作方法

专利名称：：新型犬流感病毒及用于它的疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新型流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)和A/Canine/Korea/03/07(H3N2)，还涉及包含至少一种所述病毒作为活性成分的疫苗组合物、用于预防或治疗由流感病毒感染引起的疾病的方法以及用于检测所述病毒的分析试剂盒。
背景技术：
：由正黏液病毒科(CW/wm丌oW^Wae)家族的流感病毒A引起的流感，是人、猪、马和家禽最具有经济学重要性的疾病。基于已知的红血球凝集素(H)和神经氨酸苷酶(N)这两种表面蛋白的特性，将流感病毒A进一步分类。将流感病毒A表示为H(红血球凝集素)亚型和一种类型N(神经氨酸苷酶)的组合(例如，H9N2)。有16种不同的H亚型和9种N亚型，导致流感病毒A的H和N亚型总计有144种不同的可能组合。流感是一种人畜共患病。在3种流感类型中，A型病毒是最恶性的人病原体，引发最严重的疾病。此外，它们非常易于变异并且易于从一个物种传播到另一物种，引发流行病。因此，流行性流感的爆发已成为亟待解决的重大问题。此外，有几个报道认为流感病毒正在感染迄今已知能抵抗病毒感染的新物种。犬流感指的是引起犬科动物流感的流感病毒A的新品种。因为之前没有暴露于这种病毒，所以犬类对这种病毒没有天然免疫力。因此，所有种类和各种年龄均易感染这种病毒。带有犬流感的犬类可能患有急性肺炎，表现出剧烈咳嗽、高烧和流鼻涕的症状。高度传染性流感病毒经发现是造成2004年Florida赛犬跑道上Greyhound赛犬因呼吸性疾病死亡的原因。当时，因为在美国的Texas、Alabama、Arkansas和其他州均报导了犬流感的爆发，所以犬流感被视为犬类的新流行病。流行病学的调査显示出从带有犬流感的犬分离出来的病毒几乎与马流感病毒H3N8相同，表明犬流感的产生是由马传播到犬的结果。有报道说马流感病毒H3N8引起赛犬出血性肺炎，并从犬类分离出人流感病毒H3N8。然而，必须找到犬流感的足够的血清学和病毒学证据。此外，已有犬科动物爆发禽流感的报导病例。据推测，流感由禽类传播到犬类的流行病学机理有两种途径一种途径是通过向犬类喂食未煮过的携带流感的禽类，如鸭、鸡等；流感病毒蔓延的另一种主要途径是以咳嗽和喷嚏的呼吸小滴从感染的犬类传播到正常犬类。另外，据推测，犬流感在感染的犬类暴露于新环境并与正常犬类接触后形成。重要的是预防犬流感，因为犬流感病毒可引起具有不同死亡率的继发性感染。这时没有可用于犬类的疫苗。
发明内容技术问题为实现本发明，本发明者在上述背景下对犬科动物流感病毒的产生进行了深入彻底的研究，结果发现来自韩国某些犬类的流感病毒是A血清型变体，与以前的流感病毒不同，并且，尽管属于禽群，但是通过病毒学、血清学、病理学和进化分析却显示出禽类和犬类之间的种间传播。此外，已经成功开发了抵抗这些病毒的高度稳定的疫苗。技术方案本发明的一个目的是，提供一种新型的H3N2血清型犬流感病毒。本发明的另一个目的是，提供一种编码流感病毒蛋白组分的核苷酸序列。本发明的另一个目的是，提供一种抵抗上述新型病毒的疫苗组合物。本发明的另一个目的是，提供一种用于检测H3N2血清型流感病毒的分析试剂盒，所述分析试剂盒包括本发明的病毒或其抗原决定簇。图1显示与流感病毒A/Dove/Korea/S11/03(H3N2)、A/Duck/Korea/S7/03(H3N2)和A/Chicken/Korea/S6/03(H3N2)的那些相比较，用流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)的NA基因编码的完全氨基酸序列。图2显示与流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Dove/Korea/S11/03(H3N2)、A/Duck/Korea/S7/03(H3N2)和A/Chicken/Korea/S6/03(H3N2)的另，些相比较，用流感病毒A/Equine/Jilin/1/1989(H3N8)的HA基因编码的完全氨基酸序列。图3显示与流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)、A/Canine/Korea/03/07(H3N2)、A/Dove/Korea/S11/03(H3N2)、A/Duck/Korea/S7/03(H3N2)和A/Chicken/Korea/S6/03(H3N2)的那些相比较，用流感病毒A/Equine/Jilin/1/1989(H3N8)的HA基因编码的部分氨基酸序列。图4显示HA基因的进化树，根自流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)。图5显示NA基因的进化树，根自流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)。图6是显示用流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)进行免疫的动物和没有用其进行免疫的动物一周内体温、抗体滴度和病毒后代产生的变化的图。图7显示用流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)进行免疫的动物(免疫组B、D和F)和没有用其进行免疫的动物(对照组，A和C)的器官和肺的组织病理损伤(A)侵袭性接种9天后对照组正常器官内的伪复层柱状上皮层(400倍放大)；(B)侵袭性接种9天后免疫组内的坏死器官(n)、鳞状上皮化(s)和结缔组织上的上皮增生和慢性炎症(c)(400倍放大);(C)侵袭性接种3天后对照组的正常肺泡(200倍放大)；(D)侵袭性接种3天后免疫组的支气管腔内严重扩散坏死性支气管炎和脓性细支气管炎(100倍放大)；(E)侵袭性接种6天后免疫组内严重坏死性细支气管炎(充满分离的坏死性细胞和嗜中性粒细胞，并在细支气管周围观察到轻度或中度慢性炎症)(200倍放大)；(F)侵袭性接种9天后免疫组内严重坏死性肺泡炎(H&E染色的肺泡管(ad)和肺泡(a)内的坏死性细胞浸润(200倍放大))。具体实施例方式根据本发明的一个方面，本发明是关于新型的H3N2血清型犬流感病毒o根据本发明的新型H3N2血清型犬流感病毒，它具有由SEQIDNO.9的氨基酸序列或与其共有95%以上同源性的氨基酸序列表示的红血球凝集素(HA)蛋白。当与以前已知的马流感病毒H3N8相比较时，根据对完全神经氨酸苷酶(NA)氨基酸序列(图l)和完全红血球凝集素(HA)氨基酸序列(图2)的分析，发现本发明的犬流感病毒的氨基酸序列具有极为特征性的变化。具体而言，A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)和A/Canine/Korea/03/07(H3N2)的HA氨基酸序列特征性地改变为在位置27具有N(天冬酰胺)、在位置127具有I(异亮氨酸)、在位置142具有T(苏氨酸)、在位置176具有T(苏氨酸)、在位置188具有N(天冬酰胺)、在位置209具有S(丝氨酸)、在位置212具有I(异亮氨酸)和在位置252具有I(异亮氨酸)(图3)。与SEQIDNO.9的氨基酸序列共有至少95%同源性的氨基酸序列在位置97、127、142、176、188、209、212和252中的至少一个位置含有与SEQIDNO.9的氨基酸序列相同的氨基酸残基。此外，根据本发明的新型H3N2血清型犬流感病毒，它具有由SEQIDNO.11的氨基酸序列或与其共有95%以上同源性的氨基酸序列表示的神经氨酸苷酶(NA)蛋白。此外，根据本发明的新型犬流感病毒，其还可包含选自以下的蛋白由SEQIDNO.3的核苷酸序列编码的非结构性蛋白(NS)、由SEQIDNO.4的核苷酸序列编码的基质蛋白(M)、由SEQIDNO.5的核苷酸序列编码的核蛋白(NP)、由SEQIDN0.6的核苷酸序列编码的聚合酶(PA)、由SEQIDNO.7的核苷酸序列编码的聚合酶蛋白2(PB2)、由SEQIDNO.8的核苷酸序列编码的聚合酶蛋白1(PBl)及其组合。对于本文的红血球凝集素或神经氨酸苷酶，术语"同源性"用于指与野生型氨基酸序列的相似性。在本发明的流感病毒中表达的红血球凝集素和神经氨酸苷酶分别与SEQIDNO.9和SEQIDNO.11的氨基酸序列共有卯％以上、优选95%以上、更优选98%以上和最优选99%以上的同源性。通常，蛋白同源物具有与其原型相同的活性位点。使用裸眼或使用软件可进行氨基酸序列之间的同源性比较。使用市售软件可计算两个或更多个氨基酸序列之间的同源性并表示成百分数。本发明的犬流感病毒包含A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)和A/Canine/Korea/03/07(H3N2)。流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)的蛋白显示出与禽流感病毒的蛋白95.5-98.9%的同源性。例如，本发明的流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)与A/Dove/Korea/S11/03(H3N2)对于HA(红血球凝集素)和NA(神经氨酸苷酶)基因以及与A/Chicken/Nanchang/7-010/2000(H3N6)对于NS(非结构性)基因共有最高的同源性。关于PB1(聚合酶碱性蛋白1)、PB2、PA(聚合酶)、NP(核蛋白)和M(基质)的基因，它们显示出与香港、日本和中国发现的禽流感病毒较高的同源性。流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)于2007年9月19日保藏在位于Eoeun-dong，YusungGu,DaejeonCity,SouthKorea的KoreanResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(韩国生物禾斗学与生物技术研究所)，保藏编号为KCTC11205BP。流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)具有包含SEQIDNO.1的核苷酸序列的红血球凝集素(HA)基因和包含SEQIDNO.2的核苷酸序列的神经氨酸苷酶(NA)基因。SEQIDNO.9中给出了HA的完全核苷酸序列和其完全氨基酸序列，而SEQIDNO.11中给出了NA的完全核苷酸序列和其完全氨基酸序列。此外，NS基因含有SEQIDNO.3的核苷酸序列、M基因含有SEQIDN0.4的核苷酸序列、NP基因含有SEQIDNO.5的核苷酸序列、PA基因含有SEQIDN0.6的核苷酸序列、PB2基因含有SEQIDNO.7的核苷酸序列以及PB1基因含有SEQIDNO.8的核苷酸序列。本发明的流感病毒A/Canine/Korea/02/07(H3N2)具有包含SEQIDNO.13的核苷酸序列的HA基因和包含SEQIDNO.14的核苷酸序列的NA基因。发现这种病毒与流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)基本相同，因为两种病毒之间的HA和NA核苷酸序列以及氨基酸序列经分析共有98%的同源性。流感病毒A/Canine/Korea/02/07(H3N2)于2007年9月19日保藏在位于Eoeun-dong,YusungGu,DaejeonCity,SouthKorea的KoreanCollectionforTypeCultures(KCTC)ofKoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型菌种保藏中心)，保藏编号为KCTCU206BP。流感病毒A/Canine/Korea/03/07(H3N2)具有包含SEQIDNO.1的核苷酸序列的HA基因和包含SEQIDNO.16的核苷酸序列的NA基因。这种病毒经鉴定与流感病毒A/Canine/Korea/02/07(H3N2)和流感病毒A/Canine/Korea/03/07(H3N2)基本相同，因为流感病毒A/Canine/Korea/03/07(H3N2)和流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)之间的HA和NA核苷酸序列和氨基酸序列经分析共有99%的同源性，并之间的HA和NA核苷酸序列和氨基酸序列经分析共有98%的同源性。流感病毒A/Canine/Korea/03/07(H3N2)于2007年9月19日保藏在位于Eoeun-dong,YusungGu,DaejeonCity,SouthKorea的KoreanCollectionforTypeCultures(KCTC)ofKoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型菌种保藏中心)，保藏编号为KCTCU207BP。从韩国犬类鼻腔分离出来的根据本发明的犬流感病毒具有图4和图5中的进化图表显示的进化关系。基于流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)，构建HA基因和NA基因的图4和图5的进化树。如在HA和NA基因的这些进化树中所看到的，本发明的流感病毒和禽流感病毒形成了与从马类和犬类分离出来的H3N8病毒所属群不同的群。当用于感染犬类时，根据本发明的犬流感病毒显示出致病性，引起发烧和肺炎，因此是韩国犬类的流行性病毒。当给予抵抗本发明的犬流感病毒的疫苗时，发现犬类在极大程度上对病毒具有免疫性并由此抑制病毒的传播和产生。根据本发明的另一个方面，本发明是关于一种基因，所述基因编码具有SEQIDNO.9的氨基酸序列或与其共有95%以上同源性的氨基酸序列的红血球凝集素(HA)蛋白。优选地，所述基因具有SEQIDN0.9的核苷酸序列。此外，本发明是关于一种基因，所述基因编码具有SEQIDNO.11的氨基酸序列或与其共有95%以上同源性的氨基酸序列的神经氨酸苷酶(NA)蛋白。优选地，所述基因具有SEQIDNO.IO的核苷酸序列。根据本发明的另一个方面，本发明关于一种疫苗组合物，其可提供对犬流感病毒的免疫力。优选地，本发明的疫苗组合物包含犬流感病毒或其抗原作为活性成分。用于疫苗组合物的犬流感病毒选自A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)、A/Canine/Korea/03/07(H3N2)及其组合。用于本发明的抗原指的是病毒组分的抗原部分，它引起免疫应答，并可包含具有与SEQIDNO.9的氨基酸序列或其片段共有90%以上同源性、优选95。/。以上同源性的氨基酸序列的红血球凝集素(HA)蛋白。与SEQIDNO.9的氨基酸序列共有至少95%同源性的氨基酸序列在位置97、127、142、176、188、209、212和252中的至少一个位置含有与SEQIDNO.9的氨基酸序列相同的氨基酸残基。可选择地，抗原可包含具有与SEQIDNO.11的氨基酸序列或其片段共有95n/。以上同源性的氨基酸序列的神经氨酸苷酶(NA)蛋白。根据本发明的疫苗可包括减毒活疫苗或灭活疫苗、亚单位疫苗、合成疫苗和基因工程疫苗，优选活疫苗，因为其能诱发有效的免疫应答。本文所用的术语"活疫苗"指的是从已经减毒但仍可复制宿主生物体的细胞的病毒制备的疫苗。本文所用的术语"减毒"用于指以使基因丧失致病性、但保持抗原性的方式对涉及病原体基本代谢的基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或体外连续11高阶继代培养实现减毒。外显的基因改变，如使已知序列中的特定核苷酸缺失以提供毒性或将核苷酸插入病毒基因组中，也可能导致减毒。本文所用的术语"灭活疫苗"，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用福尔马林处理病毒可获得全病毒疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。术语"亚单位疫苗"指的是包含通过提取从病毒性生物体分离出来的纯化的抗原决定簇的疫苗。它比全病毒疫苗引起副反应的可能性小。例如，从犬流感病毒提取的HA蛋白和/或NA蛋白可用于制备亚单位疫苗。术语"合成疫苗"指的是主要由化学合成抗原或基因工程抗原、抗原决定簇或肽组成的疫苗。例如，犬流感病毒的HA蛋白和/或NA蛋白可被合成用作疫苗。基因工程疫苗可没有造成致病性的特定基因或可含有修饰的基因。此外，本发明的流感疫苗可与其他失活生物体或抗原组合使用以制备抵抗包括流感的各种疾病的混合疫苗或复合疫苗。本文所用的术语"混合疫苗"用于指从本发明的犬流感病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。术语"复合疫苗"指的是从病毒和细菌制备的疫苗。例如，本发明的犬流感病毒可与犬仙台病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒和/或支气管炎博德特菌(50^/￡^//06rawc/z/w/^ca)混合或组合。根据本发明的犬流感病毒疫苗可使用以下方法制备，该方法包括(a)将本发明的犬流感病毒注射到胚胎卵中并使病毒在其中增殖；(b)用福尔马林、BPL(P-丙内酉旨)或BEI(二乙烯亚胺)处理来自胚胎卵的尿囊液；以及收集来自化学处理的尿囊液的失活病毒。在步骤(a)中，将犬流感病毒注射到9-11天大的胚胎卵中并在30~40°C下孵育24~72小时。在步骤(b)中，使用常规方法从孵育的卵获得尿囊液，用0.005~0.2(v/w)。/。的福尔马林、BEI或BPL处理并在低温下孵育以使病毒失活。在步骤(c)中，通过离心或过滤收集来自用福尔马林、BEI或BPL处理的尿囊液的失活病母。然后，病母被吸附到氧氧化铅/紐胶上。这种方法可包括众所周知的技术或可改变为更易于实施的形式。此外，本发明的疫苗组合物还可包含介质、佐剂和/或赋形剂。生理盐水或蒸馏水可用作介质。用于疫苗组合物的佐剂的例子包括Freund的不完全佐剂或完全佐剂、氢氧化铝凝胶、植物油或矿物油等。赋形剂的例子包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾，但不限于此。在实践中，本领域技术人员已知的用于疫苗制备的所有物质均可适用于本发明的疫苗组合物。优选地，本发明的疫苗组合物可包含25HAU(血凝(反应)单位)量的犬流感病毒。当犬流感病毒以少于2SHAU的量使用时，疫苗不能有效诱发抗体产生。另一方面，超过2SHAU的量可能是不经济的。可将根据本发明的疫苗组合物制备成口服剂型或非口服剂型。优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。根据本发明的疫苗组合物适用于易感染A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)或A/Canine/Korea/03/07(H3N2)并作为宿主的所有受试者，包括人类、宠物、家禽和禽类，如狗、猪、鸡、鸭、火鸡等。根据本发明的另一个方面，本发明是关于一种用于预防和治疗流感病毒相关疾病的方法，所述方法包括将疫苗组合物给予有危险的个体。本文所用的术语"流感病毒相关疾病"用于指由流感病毒感染引起的疾病。它的例子包括鼻窦炎、痉挛性孝喘、中耳炎、囊肿性纤维化、支气管炎、肺炎、痢疾等(PitkarantaandHayden,1998.Ann.Med.)，但不限于此。本文所用的术语"个体"用于指已经感染或可能感染流感病毒的所有脊椎动物(包括人类)。通过给予本发明的疫苗组合物，可有效地预防和治疗疾病。例如，可用本发明的疫苗组合物来治疗感染各种亚型或变型流感病毒的人。此外，为了预防流感，可用疫苗组合物使鸡或猪免疫。可将本发明的疫苗组合物与流感病毒相关疾病的常规治疗组合给予。本文所用的术语"预防"指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制流感病毒感染或推迟流感发作的所有行为。术语"治疗"指通过给予根据本发明的疫苗组合物使流感病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。以药物有效量给予根据本发明的疫苗组合物。本文所用的术语"药物有效量"用于指以药物治疗的益处对危险的合理比率来用于治疗流感病毒相关疾病的量。本发明化合物的剂量取决于疾病的种类和严重性、药物活性、药物敏感性、给予次数和时间间隔、给予途径、排泄率和本领域熟知的因素(包括例如同时使用的药物等)。本发明的疫苗组合物可用作单一药物或与其他药物同时或顺序组合使用，可以单剂量或多剂量给予。考虑到上面提到的因素，重要的是确定能引起最大治疗作用而没有不需要的副作用的剂量，这对本领域技术人员来说很容易。根据本发明的另一个方面，本发明是关于一种用于检测H3N2血清型流感病毒的分析试剂盒，所述分析试剂盒包括本发明的流感病毒或其抗原决定簇。通过抗原-抗体复合反应，本发明的流感病毒或其抗原决定簇用于流感病毒的特定检测，同时消灭被感染的细胞内的流感病毒。这种分析试剂盒包括通常用于免疫学领域的工具/试剂和本发明的流感病毒。工具/试剂的例子包括适合的载体、产生可检测信号的标记物、增溶剂、洗涤剂、缓冲剂、稳定剂等，但不限于此。当标记物是酶时，所述试剂盒还可包括用于分析酶活和反应终止物的底物。适合的载体例子包括但不限于可溶性的载体，如本领域熟知的生理上可接受的缓冲液(例如，PBS),不溶性的载体，如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联葡聚糖、多糖等，磁性微粒，如金属被覆乳胶、纸、玻璃、金属、琼脂糖，以及它们的组合。关于抗原-抗体复合物形成的分析，其例子包括免疫组织化学染色、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western免疫印迹、免疫沉淀分析、免疫扩散分析、补体结合分析、FACS和蛋白芯片，但不限于此。定性或定量分析抗原-抗体复合物的标记物的例子是酶、荧光剂、配体、发光剂、微粒、氧化还原分子和放射性同位素，但不受此限制。用作可检测的标记物的酶的例子包括P-葡萄糖苷酸酶、(3-D-葡萄糖苷酶、卩-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDP酶的组合、核糖核酸酶、葡萄糖氧化酶和荧光素酶的组合、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天门冬氨酸氨基转移酶、磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶和(3-内酰胺酶，但不限于此。用于本发明的荧光剂的示例性的、非限制性的例子包括荧光素、异硫氰酸盐、若丹明、phycoerytherin、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。生物素衍生物可用作配体，但不限制本发明范围。吖啶酯、虫荧光素和荧光素酶用作发光剂，但所列举的这些不用于限制本发明范围。示例性的、非限制性的微粒包括胶体金、被覆的乳胶等。作为用于本发明的氧化还原分子，有二茂铁、钌复合物、紫精、醌、钛离子、铯离子、二酰亚胺、1,4-苯醌、氢醌、K4W(CN)8、[Os(bpy)3]2+、)3]2+和[MO(CN)8]4—，给出这些只用于示例性目的，但不用于限制本发明范围。用于本发明的放射性同位素的例子包括311、14C、32P、35S、36C1、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131，186Re，但不限于此。实施例通过以下实施例可更好地理解本发明，所举的实施例用于说明、而不用于限制本发明。实施例l:样本采集和病毒分离从在位于Kyeonggi-Do,Korea的兽医院治疗的犬类采集样本一只是遭受3天流鼻涕和2天打喷嚏然后从流感恢复的5岁小型髯狗(MiniatureSchnauzer);—只是遭受发烧、咳嗽、流鼻涕和食欲不振并最终死亡的3岁英国可卡犬(CockerSpaniel);遭受严重咳嗽、发烧和流鼻涕并住院治疗2天后死亡的一只约克郡犬(Yorkshireterrier)和两只金刀犬(Jindo)。根据利用购自Anigen的快速试剂盒和RT-PCR的分析，所有这些动物被鉴定为均感染了A型流感病毒。未对这些犬类检测其他病原体。将来自动物的样本(鼻分泌物)接种到ll天大的卵中，之后从其采集尿囊液。发现尿囊液使鸡红血球聚集。从动物分离出来的病毒经血清鉴定为H3N2型血清。这些病毒被命名为A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)和A/Canine/Korea/03/07(H3N2)，并于2007年9月19日保藏在位于Eoeun-dong,YusungGu,DaejeonCity,SouthKorea的KoreanCollectionforTypeCultures(KCTC)ofKoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型菌种保藏中心)，保藏编号分别为KCTCU205BP、KCTC11206BP和KCTCU207BP。实施例2:分离的病毒的遗传特性通过基因分析来确定在实施例1中分离的病毒的遗传特性。将使用TrizolLS从尿囊液分离的流感病毒总RNA用作使用随机六聚体引物的RT-PCR的模板，接下来使用表1所示的引物进行PCR。使用改进的Primer3程序(WhiteheadInstitute/MTCenterforGenomeResearch)来设计用于扩增H3、N2、PB1、PB2、PA、NP、M和NS基因的引物序列。将cDNA(2^1)与试剂混合物{2.5^11，10xTaqDNA聚合酶缓冲液、MgCl21.5mM、dNTPs(2.5mM/pl)2.0^il、每种引物(10pmol)1^1、TaqDNA聚合酶(Promega,USA)lnl"混合，并用蒸馏水将终体积调节到25|il以制备PCR混合物。在94°C下变性lOmin开始PCR，进行在96°C下变性30sec、在53。C下退火30sec和在72。C下延伸2min的32个循环，接下来在72°C下延伸10min。在4°C下终止PCR。通过在含有溴化乙啶的1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳分析所得的PCR产物。用Bioedit软件分析所得的序列数据。表1PCR引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>将来自A/Canine/Korea/01/07(H3N2)的8个基因片段进行碱基排序并与基因库的基因(SEQIDNO.1~12)相比较。发现根据本发明的病毒与以前已知的禽流感病毒具有95.598.9%同源性(表2)。具体而言，根据本发明的病毒对于HA和NA基因与韩国分离的Sll共有最高的同源性，而对于NS基因与从中国鸡类分离的菌株共有最高的同源性。关于PB1、PB2、PA、NP和M基因，在本发明的病毒与香港、日本和中国分离的禽流感病毒之间检测出较高的同源性。在本发明的病毒A/Canine/Korea/01/07、A/Canine/Korea/02/07和A/Canine/Korea/03/07中，发现HA和NA基因具有98%~99%的同源性，这表明它们基本相同。表2犬流感病毒的基因同源性比较<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例3:分离病毒的进化使用群对齐算法和MEGALIGN软件(DNASTAR,Madison,WI)确定A/Canine/Korea/01/07在进化树中的位置。从HA和NA基因的观点来看，本发明的病毒经鉴定属于与以前从马类和犬类分离出来的H3N8病毒群不同的群，并且显示出与韩国分离的H3N2病毒非常近的遗传关系(图4和图5)。实施例4:分离的病毒的致病性分析为了检验其致病性，将A/Canine/Korea/01/07(H3N2)接种到犬类体内。将10只10周龄的比格犬(beagle)分成7只的试验组和3只的对照组。将HA滴度为1:64(1()69EID5o/0.1ml)的分离病毒(2ml)鼻内和口服给予试验组的7只比格犬，而将没有病原体的PBS(磷酸盐缓冲盐水，2ml)鼻内和口服给予对照组的3只比格犬，接下来监控临床症状7天。从接种当天起，使用RT-PCR对通过排泄和流鼻涕进行的病毒排出监控10天。使用以重组NP(核蛋白)为抗原的竞争型ELISA(AnimalGeneticsInc.Korea)进行血清研究。按照OIE的建议，为了检测重组NP的抗体，对血清样品也进行分析。为了观察病理损伤，在接种3、6和9天后各用lml甲苯噻嗪使试验组的两只比格犬和对照组的1只比格犬经受安乐死并验尸。在接种后的27天，观察比格犬遭受包括打喷嚏和流鼻涕的临床症状。整个实验过程中对照组比格犬的直肠温度保持在39°C，但接种24小时后，试验组比格犬平均上升到40.14°C(图6)。接种前所有实验犬中病毒的血清试验均为阴性，试验组的比格犬在实验中仍保持阴性。ELISA显示接种6天后试验组比对照组的抑制百分数远远高出，表明产生了抗体。有趣的是，接种8天后，发现接种的比格犬HI滴度为1:80。在接种后6天内于接种的比格犬的鼻分泌物中均发现病毒，但在排泄物中没有检测到。通常，感染1天后，犬流感病毒开始从犬体内排出并且在感染4天后达到滴度为10"EID5o/0.1ml的峰值。发现组织病理损伤限于肺部。大组织学上，在上呼吸道(支气管)和下呼吸道(细支气管和肺泡)发现严重的坏死损伤。尽管在程度上略有不同，但是在所有接种的比格犬中均发生细支气管炎和支气管炎(图7)。因此，分离的病毒经鉴定在犬体内为致病性的，引起体温升高和肺炎。此外，发现病毒在6天内排出。实施例5:疫苗制备将新分离的犬流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)接种到10天的胚胎卵的尿囊膜中。3天后，采集尿囊液作为病毒堆。向该病毒堆加入0.2%福尔马林，接下来在室温下孵育24小时使其失活。将病毒堆重新接种到胚胎卵中后，当没有检测到病毒后代时，确定病毒堆失活。将失活的病毒堆浓縮到25HAU以上。通过在10，000rpm下搅拌10min，使该病毒堆与氢氧化铝凝胶以7:3的比率混合。病毒阴性试验之后，将混合物用作疫苗。实施例6:预防接种后的侵袭性接种以0.5ml的剂量将制备的疫苗皮下注射到10周龄的10只比格犬体内，3周后以相同方式另外注射。第二次注射两周后，以2ml的剂量通过口服或鼻内途径将HA滴度为h64(10"EID5o/0.1ml)的分离的病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)侵袭性接种到比格犬体内。作为对照，在侵袭性接种前，将PBS接种到3只比格犬体内。在实验中对实验动物进行体温、病毒产生、临床症状和抗体滴度的监控。即使在接种后，预防接种的比格犬仍没有表现出体温变化、没有排出病毒后代并且没有显示出临床症状。相反，对照组在接种一周内体温升高(表3)。PCR显示病毒后代从对照组的全部3只比格犬体内排出，但没有从接种6天后的任何一只体内排出(表4)。此外，观察到对照组遭受包括流鼻涕和咳嗽(如犬窝咳(ke皿elcough)或湿排痰性咳(wetproductivecough))的临床症状。关于抗体滴度，在以对预防接种的比格犬进行侵袭性接种7天后为开始的实验期间，对于核蛋白的ELISA抗体和红血球凝集素的HI抗体，抗体滴度开始增加(表5)。然而，对照组从侵袭性接种7天后开始，则是核蛋白和红血球凝集素的抗体的滴度开始增加。因此，发现预防接种的比格犬能抵制侵袭性接种，表明本发明的疫苗组合物可用作抵抗流感病毒的疫苗。表3侵袭性接种后预防接种和未预防接种的动物的体温(在第21天进行加强接种，在第35天进行侵袭性接种)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*PCR阳性数/PCR试验数表4侵袭性接种后病毒从预防接种和未预防接种的动物的排出(在第21天进行加强接种，在第35天进行侵袭性接种)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*1值为正表5侵袭性接种后预防接种和未预防接种的动物的抗体滴度(在第21天进行加强接种，在第35天进行侵袭性接种)200780029971.7<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>工业实用性如本文所述，本发明提供新型的犬流感病毒和抵抗它们的疫苗。因为能诱发对犬流感病毒的有效免疫，因此所述疫苗用于预防和治疗犬类和由犬类继发性感染的个体的流感病毒相关疾病。尽管为了说明已经公开了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员将会理解在没有偏离所附权利要求公开的本发明范围和精神的条件下，可作出各种修改、添加和替代。权利要求1.一种H3N2血清型流感病毒，它具有由SEQIDNO.9的氨基酸序列或与其共有95％以上同源性的氨基酸序列表示的红血球凝集素(HA)蛋白。2.根据权利要求1所述的H3N2血清型流感病毒，其中与SEQIDNO.9的氨基酸序列共有至少95%同源性的氨基酸序列在位置97、127、142、176、188、209、212和252中的至少一个位置含有与SEQIDNO.9的氨基酸序列相同的氨基酸残基。3.根据权利要求1所述的H3N2血清型流感病毒，它具有由SEQIDNO.11的氨基酸序列或与其共有95%以上同源性的氨基酸序列表示的神经氨酸苷酶(NA)蛋白。4.根据权利要求3所述的H3N2血清型流感病毒，其还包含选自以下的蛋白由SEQIDNO.3的核苷酸序列编码的非结构性蛋白(NS)、由SEQIDNO.4的核苷酸序列编码的基质蛋白(M)、由SEQIDNO.5的核苷酸序列编码的核蛋白(NP)、由SEQIDNO.6的核苷酸序列编码的聚合酶(PA)、由SEQIDNO.7的核苷酸序列编码的聚合酶碱性蛋白2(PB2)、由SEQIDNO.8的核苷酸序列编码的聚合酶碱性蛋白1(PBl)及其组合。5.根据权利要求1所述的H3N2血清型流感病毒，其保藏编号为KCTC11205BP。6.根据权利要求1所述的H3N2血清型流感病毒，其保藏编号为KCTC11206BP。7.根据权利要求1所述的H3N2血清型流感病毒，其保藏编号为KCTC11207BP。8.—种核苷酸序列，其编码权利要求1所述的红血球凝集素(HA)的氨基酸序列。9.根据权利要求8所述的核苷酸序列，其由SEQIDNO.9的核苷酸序列表示。10.—种核苷酸序列，其编码权利要求3所述的神经氨酸苷酶(NA)的氨基酸序列。11.根据权利要求IO所述的核苷酸序列，其由SEQIDNO.11的核苷酸序列表示。12.—种流感病毒疫苗组合物，其包含权利要求1~7中任一项所述的病毒或其抗原决定簇作为活性成分。13.根据权利要求12所述的流感病毒疫苗组合物，其适用于犬类。14.根据权利要求12所述的流感病毒疫苗组合物，其还包含氢氧化铝凝胶或油作为佐剂。15.根据权利要求12所述的流感病毒疫苗组合物，其还包含不同于所述活性成分的至少一种病原体。16.根据权利要求12所述的流感病毒疫苗组合物，其中所述疫苗组合物是一种减毒活疫苗。17.根据权利要求12所述的流感病毒疫苗组合物，其包含25HAU以上量的所述流感病毒。18.根据权利要求12所述的流感病毒疫苗组合物，其中所述抗原决定簇为权利要求1或2所述的红血球凝集素(HA)或其抗原片段，并且含量为卯％以上。19.根据权利要求12所述的流感病毒疫苗组合物，其中所述抗原决定簇为权利要求3所述的神经氨酸苷酶(NA)或其抗原片段，并且含量为90%以上。20.—种用于预防或治疗由流感病毒感染引起的疾病的方法，所述方法包括将权利要求12所述的流感病毒疫苗组合物给予感染流感病毒的个体。21.—种用于检测H3N2血清型流感病毒的分析试剂盒，所述分析试剂盒包括权利要求1~7中任一项所述的病毒或其抗原决定簇。全文摘要本文公开了新型流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)和A/Canine/Korea/03/07(H3N2)。还公开了一种包含至少一种所述病毒的疫苗组合物、一种通过给予所述疫苗组合物来预防或治疗由流感病毒感染引起的疾病的方法以及一种用于检测所述病毒的分析试剂盒。文档编号C12N15/33GK101605898SQ200780029971公开日2009年12月16日申请日期2007年11月16日优先权日2007年10月30日发明者吴镇植,姜东奭,姜普圭,宋錞燮,李澈承,河健雨,赵荣植申请人:韩国安捷公司