专利名称：：用胚胎干细胞制备转基因禽类的方法用胚胎干细胞制备转基因禽类的方法
技术领域：
：本发明涉及禽类生物技术并特别涉及制备转基因鸟类的方法。本发明特别用于制备在卵中大量表达重组目的蛋白质的转基因鸟类。在过去的十五年中，治疗领域增长加速，已有超过400种生物分子用于临床发展，市值超过300亿美元。绝大多数重组蛋白质需进行特异性翻译后修饰以获得全部生物学活性并因此必须在大规模生物反应器中在哺乳细胞内生长而制备。与此生产系统相关的成本以及需要重要的定量是使整个生产过程的发展更加延迟的原因。在上下文中，转基因动物可代表经济上有吸引力的替代物，尤其是如果修饰可通过种系传递至子代时。家兔、山羊和牛引起人们极大的兴趣，长时间以来雌鸡被认为是在鸡卵中制备重组治疗性蛋白质的最吸引人的快速、成本经济的生物学制备系统。由于商业化雌鸡一年产卵约250枚，每枚卵含有近4克卵白蛋白，所以鸡的产卵能力的确是非常强的。如果每枚卵仅可产100mg重组蛋白质，那么一小群1000只雌鸡的鸡群每年可产25kg粗制重组蛋白质物质。此外，由于数十年来用鸡卵生产许多种人用疫苗，商业性产卵工业已高度自动化且管理机构与鸡卵衍生产品相适应。同样，家禽工业也对使用转基因的方法加快商业目的的遗传性状的选择产生兴趣(即"meta克隆技术")。这个想法将绕过经典选择方案[谱系—GGP—GP—PS]而以较短的时间得到目的鸡。家禽生产中最可能用到的转基因技术可能是在转基因植物中是常见技术的增加抗病性或改进食物的同化作用的技术。此外，转基因技术可能是保存禽类遗传资源的策略。迄今为止，将谱系动物(家禽工业最有价值的动物)分成不同地域是唯一的可在饲养场发生麻烦(例如病毒的传染)时，防止多年的选择项目丧失的方法。这种方法是昂贵的且不能保证可以抗衡国家卫生决定(强制对所有的本地家禽进行预防性消除以检査病毒感染)(如2003年在荷兰进行的)。改良动物的工程化首次意味着可将转基因稳定导入动物的基因组中。25年来研究DNA导入的不同技术有(i)DNA微量注射技术，(ii)病毒转导技术，(iii)精子介导的基因转移技术，(iv)核转移技术，(V)基于细胞的使用原始生殖细胞的转移技术，或(vi)基于细胞的使用胚胎干细胞的转移技术。已验证，在鸡中，仅有DNA微量注射技术(Love等人，1994Biotechnology12:60-63)和病毒转导技术(Bosselman等人，1990J.Reprod.Fertil.Suppl.41:183-195)可有效地进行转基因的种系传递。然而，这两种技术都有一些限制这两种技术繁琐、艰苦并且效率低，其部分原因是由于转基因的随机整合和沉默。病毒转导技术还使插入到病毒载体上的转基因的大小受到限制。现在这两种技术不能达到与商业发展相适应的蛋白质表达水平。将之前体外遗传工程化的原始生殖细胞(PGC)或胚胎干细胞(ES)注射到发育中的鸡胚中的技术是禽类转基因技术中有前途的技术之一，尤其是因为这些技术可使靶转基因整合入基因组内的可使转基因高表达的特异位点。然而，为使用该方法制备转基因鸡，必须满足重要的先决条件体外操作时细胞必须存活，而同时保持其插入到受体胚胎的能力，以定居于生殖细胞内并然后将修饰传递给子代。过去，为克服每个操作步骤的不同技术障碍进行了许多尝试，并且今天通过将源自未孵化胚胎的新鲜分离的胚层细胞注射到新鲜产下的胚胎的胚下腔内以获得体细胞的或生殖细胞的嵌合体。供体和受体细胞的贡献在下列中评价(i)黑色素细胞群，通过检测黑和白色色素沉着(芦花斑纹鸡(BarredRock)或褐色来亨鸡(BrownLeghorn)在基因座I具有隐性等位基因而白色来亨鸡(BrownLeghorn)在基因座I具有显性等位基因)；(ii)红细胞群，通过DNA指纹分析；(iii)性腺，分析具有供体来源的表现型的子代(Petitte等人，1990Development108:185-189;Carsience等人，1993Development117:669-675;Thoraval等人，1994PoultryScience73:1897-1905;Pain等人，1996Development122:2339-2348)。胚层细胞注射48小时后(Etches等人，1996Mol.Reprod.Dev.45:291-288)直到培养7天(Pain等人，1996)可观察到对体细胞组织和生殖细胞有贡献的嵌合体。Etches等人(1996)已证明注射了与小鼠成纤维细胞共培养的细胞后可观察到显著的更多的体细胞嵌合体。Pain等人(1996)将禽类胚层细胞接种在STO小鼠成纤维细胞上。培养中细胞的ES状态的保持依赖于ECMA-7和SSEA-1表位的表达和端粒酶活性(Pain等人，1996)。白血病抑制因子(LIF)和其他因子IL-ll、SCF、bFGF、IGF-1的出现可刺激缺少分化的胚层细胞的增殖，并且接触抗维甲酸的单克隆抗体可抑制其分化(Pain等人，1996)。已表明当受体胚胎在注射入供体细胞之前进行放射线照射，促进源自供体的细胞在胚胎中的定居(Carsience等人，1993)。然而，与注射新鲜制备的细胞后观察到的体细胞嵌合状态的频率和程度相比，维持培养的胚层细胞产生的嵌合体较少，所述嵌合体对体细胞组织表现出减少的贡献。然而，尽管如此证明可得到基于细胞的禽类转基因策略的每个成分部分；用ES细胞技术获得的非转基因动物未有描述。仍然需要制备转基因鸡的有效方法。这是本发明的目标。为了达到这个目标并与本发明的目的相符合，如本文具体体现和广泛描述的那样，本发明提供培养禽类胚胎干细胞(ES)的方法，该方法包含以下步骤a)使源自受精的优选未孵育的禽卵的胚层盘的ES细胞在添加下列成分的基础培养基中悬浮-胰岛素样生长因子l(IGF-1)和/或纤毛神经营养因子(CNTF);和-可选地，至少一种生长因子，选自白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素ll(IL-ll)、制瘤素或心营养素；和-动物血清；b)将步骤a)获得的ES细胞的悬浮液接种到词养细胞层并继续培养该ES至细胞至少传2至10代，优选2至20代；c)可选地，将至少一种选自SCF、FGF、IL-6、IL-6R、LIF、制瘤素、心营养素或IL-ll的生长因子从培养基中去除；d)将ES细胞在饲养细胞层上在步骤c)的培养基中继续培养。在优选的具体实施方式中，本发明的培养禽类胚胎干(ES)细胞的方法包含下列歩骤a)使源自受精的优选未孵育的禽卵的胚层盘的ES细胞在添加下列成分的基础培养基中悬浮-胰岛素样生长因子1(IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和动物血清；b)将步骤a)获得的ES细胞的悬浮液接种到饲养细胞层并继续培养该ES至细胞至少传2至10代，优选2至20代；c)可选地，将至少一种选自SCF、FGF、IL-6,IL-6R的生长因子从培养基中去除，并优选将生长因子SCF、FGF、IL-6,IL-6R从培养基中去除；d)将ES细胞在饲养细胞层上在步骤c)的培养基中继续培养。在另一优选的具体实施方式，本发明的培养禽类胚胎干(ES)细胞的方法包含下列步骤a)使源自受精的优选未孵育的禽卵的胚层盘的ES细胞在添加下列成分的基础培养基中悬浮-胰岛素样生长因子1(IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和动物血清；b)将步骤a)获得的ES细胞的悬浮液接种到饲养细胞层并继续培养该ES至细胞至少传2至10代；c)可选地，将至少一种选自SCF或FGF的生长因子从培养基中去除；优选将这两种生长因子SCF和FGF都从培养基中去除d)将ES细胞在词养细胞层上在步骤c)的培养基中继续培养。当观察到ES细胞的死亡和/或分化标记出现在培养基中进行本发明的可选的步骤c)的方法。分化标记的例子是例如细胞的形态学改变成为特征性形态学类型，如例如表皮细胞类型或成纤维细胞类型。分化的另一个例子可是ES细胞标记物(如端粒酶、碱性磷酸酶、SSEA-1抗原这些ES细胞的标记物)表达的缺乏或下降。在更优选具体实施方式中，本发明的培养禽类胚胎干(ES)细胞的方法包含下列步骤a)使源自受精的优选未孵育的禽卵的胚层盘的ES细胞在至少添加胰岛素样生长因子l(IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)、白细胞12介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和动物血清的基础培养基中悬浮；b)将步骤a)获得的ES细胞的悬浮液接种到饲养细胞层并在步骤a)的培养基中继续培养该ES细胞。在另一个更优选的具体实施方式中，本发明的培养禽类胚胎干(ES)细胞的方法包含下列步骤a)使源自受精的未孵育的禽卵的胚层盘的ES细胞在至少添加胰岛素样生长因子l(IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)和动物血清的基础培养基中悬b)将步骤a)获得的ES细胞的悬浮液接种到饲养细胞层并在步骤a)的培养基中继续培养该ES细胞。在另一个更优选的具体实施方式中，本发明的培养禽类胚胎干(ES)细胞的方法包含下列步骤a)使源自受精的未孵育的禽卵的胚层盘的ES细胞在至少添加胰岛素样生长因子1(IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)和动物血清的基础培养基中悬浮；b)将步骤a)获得的ES细胞的悬浮液接种到词养细胞层并在步骤a)的培养基中继续培养该ES细胞。本文所用的术语"禽类"是指分类学的纲"禽纲"的生物体的任何种、亚种或种族如，但不限于鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉、鹦鹉、雀、鹰、鸦、鸵鸟、鸸鹋和鹤鸵。本文所用的术语"禽类"、"鸟类(bird)"、"鸟类(aves)"或"鸟类(ava)"具有相同的意思并将模糊地使用。在优选具体实施方式中，"鸟"是指分类学目的任何动物-"雁形目"(即鸭、鹅、天鹅和同类)。雁形目中含有三个科的约150种鸟类叫鸭科(即叫鸭)、雁鸭科(鹊鹅)和鸭科，包括超过140种水鸟，其中包括鸭、鹅、天鹅。该目中的所有物种是非常适合在水面上水栖生存。所有这些物种都有适合游泳的蹼足(虽然有些物种后来主要在陆地上生存)。这一术语包括各种品系的鸭，例如北京鸭和俄国鸭。13-"鸡形目"(即鸡、鹌鹑、火鸡、雉和同类)。鸡形目是含有鸡、火鸡、鹌鹑和雉的鸟类的目。全世界发现约256个物种。这一术语包括各种原鸡或鸡的品系，例如S86N、瓦洛(Valo)、白色来亨鸡(WhiteLeghorn)、褐色来亨鸡(BrownLeghom)、苏塞克斯鸡(Sussex)、新汉显鸡(NewHampshire)、罗德岛鸡(RhodeIsland)、澳洲黑鸡(Ausstmlorp)、米诺卡鸡(Minorca)、Amrox、力Q利福尼亚灰鸡(CaliforniaGray)、东兰辛鸡(EastLansing)、意大利花鹧鸪(Italian-Patridge-colored)、马朗鸡(Marans)、卢花斑纹鸡(BarredRock)、CouNuRouge(CNR)、GF30、ISA以及火鸡、雉、鹌鸫和其他普遍饲养的家禽品系。-"鸽形目"(即鸽和同类)。鸟目鸽形目包括非常广的鸽子和家鸽。在优选的具体实施方式中，本发明的鸟类细胞是鸡的细胞。鸡优选选自包含S86N、瓦洛、白色来亨鸡、褐色来亨鸡、苏塞克斯鸡、新汉显鸡、罗德岛鸡、澳洲黑鸡、米诺卡鸡、Amrox、加利福尼亚灰鸡、东兰辛鸡、意大利花鹧鸪、马朗鸡、卢花斑纹鸡、CouNuRouge、GF30、ISA的品系。在更优选的具体实施方式中，本发明的鸡ES细胞是芦花斑纹鸡。在另一个优选的具体实施方式中，本发明的禽ES细胞是鸭细胞。在更优选的具体实施方式中，本发明的鸭ES细胞是北京鸭或俄国鸭。步骤a)的细胞是鸟类胚胎干细胞。胚胎干细胞(ES细胞)是具有获自培养的部分或全部非常早期的胚胎(如囊胚期)特异性特征的干细胞。这些ES细胞体外表现出干细胞的所有特征，当无论以何种方式将其重新植入受体胚胎中时其具有在体内促进胚胎的形态发生和参与种系定居的独特能力。精子或卵母细胞(两性结合后发育)的祖先细胞，原始生殖细胞(PGC)，是多能性ES细胞并构成ES细胞的亚型。优选地，本发明的禽类胚胎干细胞分离自处于Eyal-Giladi&Kochav分类的VI期和XII期之间的发育阶段的受精禽卵的胚层盘，更优选的是约Eyal-Giladi&Kochav分类的X期(参见EYAL-GILADI分类EYAL-GILADI禾口KOCHAV,1976,"to;Wm"/veWwacA》削油'ow.'aco呼/纖ewto^ywo環a/awt/anew/00A:Wf/ze，M■stagesAecfeve/opwe/^//zec//cA:"."GeneralMorphology"Dev.Biol.1449:321-337)的胚胎干细胞。在优选的具体实施方式中，步骤a)的细胞分离自新鲜产下的受精卵即处于名为产卵期(oviposition)的发育期的受精卵。根据Sellier等人(2006,J.Appl.Poult.Res"15:219-228)，产卵期相当于根据Eyal-Giladi&Kochav分类的下列发育期-俄国鸭VII期-几内亚家禽vn期-vm期-火鸡vn-vin期-北京鸭VIII期-鸡X期-日本鹌鹑XI期-鹅XI期优选地，步骤a)的北京鸭的胚胎干细胞(ES)通过分离处于约Eyal-Giladi分类的VIII期(产卵期)的胚胎。优选地，步骤a)的俄国鸭胚胎干细胞(ES)通过分离处于约Eyal-Giladi分类的VII期(产卵期)的胚胎。优选地，步骤a)的鸡胚胎干细胞(ES)通过分离处于约Eyal-Giladi分类的X期(产卵期)的胚胎。更优选地，卵从未孵育过(即"未孵育")。自胚层盘分离的细胞包含禽类胚胎细胞，更尤其包含禽类胚胎干(ES)细胞；这些禽类胚胎细胞是全能或多能细胞。胚层细胞以集落生长并紧紧地连接在一起；它们在形态学上呈现出圆形的形态，具有大的核和小的胞浆(见图2)。胚层细胞的形态学在培养过程(本发明的方法的歩骤图2b和c)中从紧密连接的细胞发展成连接松散的更加分散的细胞。自步骤c)获得的禽类ES细胞优选显示出松散的连接。根据另一具体实施方式，步骤a)的细胞是富含原始生殖细胞(PGC)的胚胎干细胞群。更优选地，步骤a)的禽类ES细胞是纯化的PGC细胞。在禽类物种中，原始生殖细胞起源于胚层的中心区(Ginsburg禾QEyal-Giladi，1987Development101(2):209-19;Karagenc等人，1996DevGenet19(4):290-301;Petitte等人，1997PoultSci.76(8):1084-92)。然后它们移至前端的胚外位点，生殖新月区直到被处于胚胎发育的2.5至5天之间的脉管系统收集到达生殖嵴。这些细胞定居于生殖嵴并最终分化成为卵母细胞或精母细胞(Nieuwkoop和Sutasurya,1979.772eMfgraf/cwo/Ae戸'/woWa/ger附ce〃s.7V/附oW(3f/ge環ce〃C7wrafotes1.Zo"^w:Ca附6"'(iget/w/vera/(yiV咖/^"-727)。从供体禽类胚胎分离PGC细胞的方法已见于文献并能被本领域技术人员容易地进行(见如公布日为1993年9月7日，公布号为05-227947的JP924997;Chang等人，1992,CellBiol.Int.19(2):143-149;Naito等人，1994Mol.Reprod.Dev.39:153-161;Yasuda等人，1992.J.Reprod.Fert.96:521-528;Chang等人，1992CellBiol.Int.Reporter16(9):853-857)。根据具体实施方式，从处于Hamburger&Hamilton分类(Hamburger&Hamilton1951Aseriesofnormalstagesinthedevelopmentofchickembryo.J.Morphol.88:49-92)的12-14期的鸡胚的背侧主动脉收集的胚胎血液收集PGC细胞。在另一优选具体实施方式中，PGC从生殖新月区通过机械分割鸡胚而收集或从生殖腺收集。然而，正如上文讨论，其他分离PGC的方法是已知的并选择性使用。术语"完全培养基"是指基础培养基，优选基础合成培养基，补充至少一种生长因子和动物血清。WO03/07660KWO05/007840、EP787180、US6,114,168、US5,340,740、US6,656,479、US5,830,510和Pain等人的文章(1996,Development122:2339-2348)描述了这种完全培养基。根据本发明，"基础培养基"是指含有经典培养基成分的培养基，其本身至少使细胞存活和(甚至更好)使细胞生长。基础培养基的例子有BME(基础Eagle培养基)、MEM(最简Eagle培养基)、Ml99、DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)、GMEM(Glasgow改良Eagle培养基)、DMEM-HamF12、Ham-F12禾BHam-FlO、Iscove改良Dulbecco培养基、MacCoy5A培养基、RPMI1640。基础培养基包含无机盐(例如CaCl2、KC1、NaCl、NaHC03、NaH2P04、MgS04等)、氨基酸、维生素(硫胺素、核黄素、叶酸、D-泛酸钙等)和其他成分如葡萄糖、(3-巯基-乙醇、丙酮酸钠。优选的基础培养基是合成培养基。本发明的绝大多数优选的基础培养基是添加2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1%非必需氨基酸、0.16mM(3-巯基-乙醇的DMEM-HamF12培养基。另外，完全培养基是条件培养基，优选BRL条件培养基。说到例子，BRL条件培养基根据本领域公认技术制备，如Smith和Hooper的文章中所描述的技术(1987,Dev.Biol.121:1-9)。BRL细胞可从ATCC保藏号CRL-1442的细胞得到。条件培养基可补充下述外源性生长因子。本文所用的术语"生长因子"是指添加到培养基中对于培养的禽类细胞的存活和生长必要的外源性生长因子。可将生长因子简要分为两个生长因子家族细胞因子和营养因子。细胞因子家族主要是那些其功能是通过与gpl30蛋白偶联的受体发挥的生长因子。因此，白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素ll、白细胞介素6、白细胞介素6受体、纤毛神经营养因子(CNTF)、制瘤素和心营养素具有与其特异性链受体水平上的募集，并且特异性链以单体形式或有时是异源二聚体的形式与gpl30蛋白结合相似的作用模式。营养性因子主要是干细胞因子(SCF)、胰岛素生长因子l(IGF-l)和成纤维细胞生长因子(FGF)，优选碱性FGF(bFGF)或人FGF(hFGF)。本发明的方法的步骤a)中所用的完全培养基包含基础培养基，优选基础合成培养基，和至少一种其作用是通过gpl30蛋白偶联受体的细胞因子和/或至少一种营养因子。优选地，根据本发明所述的完全培养基包含基础培养基和至少一种选自白血病抑制因子(LIF)、制瘤素、心营养素、胰岛素生长因子l(IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞生长因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白细胞介素11(IL-11)的生长因子。根据第一优选具体实施方式，完全培养基是补充了动物血清和至少补充了IGF-1和CNTF的基础培养基。根据第二优选具体实施方式，完全培养基是补充了动物血清和至少补充了IGF-1、CNTF、IL-6和IL-6R的基础培养基。根据第三优选具体实施方式，完全培养基是补充了动物血清和至少补充了IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、FGF的基础培养基。根据另一具体实施方式，完全培养基是包含生长因子(即例如BRL细胞表达的生长因子)和任选补充至少一种选自白血病抑制因子(LIF)、胰岛素生长因子(IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)或白细胞介素ll(IL-ll)的外源性生长因子的条件培养基。基础培养基或条件培养基中包含的生长因子IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、FGF、IL-ll的浓度是约0.01至10ng/ml，优选0.1至5ng/ml，并且更优选约1ng/ml。本发明的禽类胚胎干细胞在词养细胞层中培养。饲养细胞可以是为获得ES细胞的目的培养的细胞或细胞系。另外，饲养细胞可用细胞外基质加所附生长因子替代。饲养基质因此是指词养细胞或细胞外基质。本文所用的饲养基质根据本领域已知方法构建。如上所述，优选饲养基质是预先准备好的。术语"预先准备好的"是指在起源于受精禽卵的胚层盘的细胞沉积下来与饲养基质接触之前将饲养基质在培养基培养一段时间，如足以启动和建立例如生长因子或其他因子通过饲养基质产生的时间；通常，在起源于受精禽卵胚层盘细胞沉积下来与饲养基质接触之前一至两天通过培养饲养基质本身饲养基质来预先准备好。饲养细胞优选包含小鼠成纤维细胞。优选STO成纤维细胞，但原代成纤维细胞也是适合的。而且本发明就小鼠细胞饲养基质的使用已作过描述，应注意包含来自其他鼠科物种(如大鼠)的细胞的饲养基质；其他哺乳动物物种(如有蹄动物、牛、猪类)；或禽类物种(如鸡形目、鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉)也可使用。在另一实施例中，本发明的伺养细胞可转染表达载体使得例如生长因子如禽类SCF在STO细胞中呈组成性表达。因此，"伺养层"产生可溶性细胞因子和/或附在细胞膜上形式的细胞因子。因此，本发明的培养过程可选地包含建立单层饲养细胞层。饲养细胞用标准方法使其不能进行有丝分裂。例如，使饲养细胞暴露于X或Y射线中(如4000雷得的Y射线)或用丝裂霉素c(如用10pg/ml处理2至3小时)处理。使细胞不能进行有丝分裂的操作还见于美国典型微生物保藏中心(ATCC，10801UniversityBoulevard,Manassas，Va.20110-2209)附送的典型的信息中(如STO饲养细胞可从ATCC保藏号1503获得)。单细胞层可选地培养至约80%汇合，优选达到约90%汇合，更优选达到约100%汇合。虽然单层饲养细胞的形态是培养物的优选形态，任何合适的形态应视为包含在本发明的范围之内。因此，例如，多层、单层、丛生、聚集或其他联结或成簇的词养细胞均应视为包含在本发明的范围之内并尤其应视为包含在术语"基质"的含义之内。本发明的培养基添加动物血清。使用的动物血清优选是胎儿动物血清。优选胎牛血清。同样虽然本发明就胎牛血清的使用己作过描述，应视为也能使用包含来自其他动物物种(如鸡、马、猪、有蹄动物等)血清的动物血清。动物血清在培养基中的终浓度是包含约1至25%、优选5%至20%，更优选8%至12%。在优选具体实施方式中，培养基中动物血清的终浓度是约10%。根据优选的具体实施方式，培养基包含约10%胎牛血清。本发明的培养基可另外包含抗生素，如例如青霉素和链霉素以预防细菌感染。根据另一具体实施方式，本发明提供对禽类胚胎干细胞进行遗传修饰的方法，该方法包含以下步骤a)用载体转染根据上述方法获得和培养的ES细胞；b)选择转染了的ES细胞，优选通过在培养基中添加选择性试剂如抗生素、氨基酸、激素进行选择；C)筛选和扩增遗传修饰的抗性ES克隆；d)在以前描述过的培养基中在饲养细胞层上培养所述步骤c)的遗传修饰的ES细胞。根据第一具体实施方式，所述步骤d)的培养基包含动物血清和至少一种选自IGF1、CNTF、IL-6、IL-6R、IL-ll、LIF、FGF、SCF、制瘤素或心营养素的生长因子。根据优选具体实施方式，所述步骤d)的培养基包含动物血清和IGF1和CNTF。根据另一个优选具体实施方式，所述步骤d)的培养基包含动物血清和IGF1和CNTF和可选的至少一个选自IL-6、IL-6R、IL-ll、LIF、FGF、SCF、制瘤素或心营养素的生长因子。根据第三优选具体实施方式，所述步骤d)的培养基包含动物血清和IGF1、CNTF、IL-6和IL-6R。根据第四优选具体实施方式，所述步骤d)的培养基包含动物血清和IGF1、CNTF、IL-6禾口IL-6R、SCF禾口FGF。步骤c)的ES细胞进行了遗传修饰。通过将载体瞬时或稳定转染进入ES细胞而对ES细胞进行遗传修饰。根据优选的具体实施方式，可根据本领域技术人员熟知的技术将载体稳定转染进入ES细胞。根据19第一具体实施方式，载体随机插入ES细胞的基因组中。根据优选的具体实施方式，载体通过同源重组插入到ES细胞的基因组中。WO03/043414描述了通过同源重组对ES细胞进行遗传修饰的流程和表达载体。步骤a)的ES细胞在被导入受体胚胎之前可在体外维持和培养很长一段时间。可在这段长的时间内对所述细胞进行遗传修饰。根据优选具体实施方式，细胞在体外培养至少5天、至少10天、至少14天、至少25天、至少50天、至少75天、至少100天。本文所使用的术语"载体"是指能转染进入细胞并独立复制或在宿主细胞基因组中内复制的天然或合成的单链或双链的质粒或病毒核酸分子。环形双链质粒能通过用基于质粒载体核苷酸序列的合适的限制性酶处理而变成线性分子。核酸能通过用限制性酶切断载体并将片段连接在一起而插入载体中。核酸分子可以是RNA或DNA。本文所使用的术语"质粒"是指小的环状的能在细菌或酵母宿主细胞中独立复制的DNA载体。核酸载体进一步包括至少一个可操作地连接在编码"目的多肽"的核酸序列上的调节序列。调节序列为本领域所熟识，本领域技术人员无需过量实验即可被选择以确保连接的核酸序列的良好表达。如本文所使用，术语"调节序列"包括启动子、增强子和可控制表达的其他元件。可参考标准分子生物学手册(如Sambrook等人，eds"MolecularCloning:ALaboratoryManual"2nded.ColdSpringHarborPress(1989)禾口Lodish等人，eds.,"MolecularCellBiology,"Freeman(2000))设计合适的表达载体、启动子和其他表达控制元件。然而，应认识到选择合适的表达载体取决于包括选择进行转化的宿主细胞和/或要表达的蛋白的类型在内的多种因素。而且用于多种用途的启动子是组织选择性(即组织特异性)启动子，即与一种或多种其他类型的组织相比，优先在特定类型的组织细胞中表达的启动子。示例性的组织特异性启动子是与包括卵白蛋白、溶菌酶、卵类粘蛋白、伴清蛋白和卵粘蛋白等禽类卵蛋白天然联结的鸡输卵管特异性启动子。可用的启动子还包括外源可诱导启动子。这是那些能因外源供给剂或刺激剂(通常不是内源性的代谢物或细胞因子)的作用而"打开"。例子包括抗生素诱导的启动子(如四环素诱导的启动子)、热诱导的启动子、光诱导的启动子、激光诱导的启动子(如Hallomn等人，2000,Development127(9):1953-1960;Gemer等人，2000，Int.J.Hyperthermia16(2):171-81;Rang和Will,2000，NucleicAcidsRes.28(5):11205;Hagihara等人，1999，CellTransplant.8(4):4314;Huang等人，1999，Mol.Med.5(2):129-37;Forster,等人，1999，NucleicAcidsRes.27(2):708-10;和Liu等人，1998,Biotechniques24(4):624-8,630-2(1998))。本文所用术语"目的多肽"或"目的蛋白"是指三个或三个以上氨基酸连续排列的通过肽键连接的氨基酸多聚体。术语"多肽"包括蛋白质、蛋白质片段、蛋白质类似物、寡肽、肽等。术语"多肽"应视为如上文定义的多肽，这些多肽是核酸编码的通过重组技术产生的自合适的来源分离的多肽或合成多肽。多肽的非限制性的例子是生长因子、细胞因子、白细胞介素、干扰素、酶、免疫球蛋白或其片段。本文所用术语"转染"或"转染的"是指核酸插入到宿主细胞(即禽类ES细胞)的过程。促进核酸转染进入原核或真核有机体的许多技术为本领域技术人员所熟知。这些方法包括许多技术，这些技术包括但不限于用高浓度盐(如钙盐或镁盐)处理细胞，电学领域的技术(即电穿孔)、去污剂或脂质体介导的转染(即脂质转染法等)，以使宿主细胞能够摄入核酸分子。本发明还提供获得嵌合体雏鸟的方法，该方法包含下列步骤a)将根据本发明的方法获得和培养的禽类ES细胞导入受体禽胚的胚下腔；和b)孵育步骤a)获得的胚胎直到孵出雏鸟；c)选择所述包含已定居在所述雏鸟中的异源细胞的嵌合体雏鸟。本文所用的术语"雏鸟"是指幼鸟，包括幼鸡。术语"胚下腔"是指胚盘和卵黄之间的空间。这个空间是当胚盘细胞从白蛋白吸收液体并将其分泌到胚盘与卵黄之间而形成。本发明还提供获得遗传修饰的嵌合体雏鸟的方法，该方法包含下列步骤a)将根据本发明的方法获得和培养的遗传修饰的ES细胞导入受体禽胚的胚下腔；和b)孵育步骤a)获得的胚胎直到孵出雏鸟；21C)选择所述包含己定居在所述雏鸟中的遗传修饰的异源细胞的嵌合体雏鸟。对所述嵌合雏鸟的选择可通过表现型或基因型分析进行。根据优选的具体实施方式，嵌合雏鸟通过羽毛表现型分析进行。根据另一具体实施方式，获得本发明的嵌合体雏鸟的方法可包含额外的在将ES细胞导入之前鉴定受体胚胎性别的步骤。根据另一具体实施方式，受体胚胎源自新鲜产的未孵育的卵并包含约5,000至约70,000个细胞。优选地，所述受体胚胎是处于Eyal-Giladi&Kochav分类的VI和XII期之间的阶段，优选-当胚胎是鸡时，约Eyal-Giladi&Kochav分类的X期；-当胚胎是俄国鸭时，约Eyal-Giladi&Kochav分类的VII期；-当胚胎是北京鸭时，约Eyal-Giladi&Kochav分类的VIII期；-当胚胎是日本鹌鹑或鹅时，约Eyal-Giladi&Kochav分类的XI期；-当胚胎是几内亚鸡或火鸡时，约Eyal-Giladi&Kochav分类的vn-vin期；优选地，至少1000个ES细胞、至少10,000个ES细胞、至少15,000个ES细胞，至少30,000个ES细胞、至少45,000个ES细胞、至少65,000个ES细胞、至少85,000个ES细胞或至少100,000个ES细胞导入受体禽胚的胚下腔内。根据优选具体实施方式，至少30,000个ES细胞导入受体禽胚的胚下腔内。导入受体禽胚的胚下腔内的ES细胞可是雌性和雄性ES细胞的混合群。根据另一具体实施方式，受体胚胎和供体ES细胞在导入之前已预先区别性别。根据优选的具体实施方式，将雌性ES细胞导入雌性受体禽胚的胚下腔内。根据另一优选的具体实施方式，将雄性ES细胞导入雄性受体禽胚的胚下腔内。获得本发明的嵌合体雏鸟的方法包含在将ES细胞导入所述受体胚胎胚下腔之前用X或Y射线轻微照射受体胚胎的可选的歩骤。根据优选的具体实施方式，鸡受体胚胎用3至6戈的X射线照射，优选用约4戈的X射线照射。根据优选的具体实施方式，约15,000个鸡ES细胞导入受体鸡胚的胚下腔，之前用约4戈的X射线照射。根据另一优选的具体实施方式，至少30,000个鸡ES细胞导入未经照射的受体鸡胚的胚下腔。根据第一具体实施方式，受体鸡胚是白色来亨鸡品系鸡胚，供体鸡ES细胞来源于选自芦花斑纹鸡、马朗鸡或S86N鸡的品系。根据第二具体实施方式，受体鸡胚是戶花斑纹鸡、马朗鸡或S86N鸡品系的鸡胚，供体鸡ES细胞来源于白色来亨鸡品系。本发明的包含异源细胞的嵌合体雏鸟的选择包含下列步骤a)获得来自所述嵌合体雏鸟的遗传物质样品；b)分析整合到禽类基因组的禽类白血病病毒序列多态性的出现，其中通过使用选自正向引物5'-GGTGTAAATATCAAAATTATC-3'(SEQIDn°l)和反向引物5'-CGGTTAAAATACGAATAGAGA-S'(SEQIDN°2)的组或正向引物5'-CTATGAGCAGTTACGAGGGTC-S'(SEQIDN。3)和反向引物5'陽CGGACCAACAGGCTAGTCTC-3'(SEQIDN。4)的引物组来扩增该序列以鉴定多态性。根据优选具体实施方式，所述鸡ES细胞源自芦花斑纹鸡，所述受体胚胎是白色来亨鸡胚胎。所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)或逆转录PCR进行，其中所述分析包含PCR扩增DNA用限制性酶Hindi消化的步骤。鉴定多态性存在或缺失的方法选自限制性片段长度多态性(RFLP)分析、杂交分析、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)、温度梯度凝胶电泳法(TGGE)、等位基因特异性寡核苷酸分析(ASO)或双脱氧指纹印迹法(ddF)。分析所述多态性存在的步骤包含下列a)用限制性酶Hindi消化所述遗传物质；b)从所述消化步骤中分离产生的片段；C)检验所述片段产生的限制性图谱；和d)可选将所述图谱与用Hindi限制性酶消化白色来亨鸡、马朗鸡、芦花斑纹鸡、S86N鸡的遗传物质而获得至少一种限制性片段的图谱比较，其中步骤c)和d)检测到的限制性图谱的区别指示包含异源细胞的嵌合体雏鸟的多态性。本发明还包括获得嵌合体雏鸟子代的方法，其中所述方法包含下列歩骤a)使根据本发明的方法获得的选定的嵌合体雏鸟发育成熟成为成23鸟；b)喂养具有异源细胞的所述成鸟，以产生子代鸟；和c)在子代鸟中选择带有异源细胞的鸟。所述鸟的选择可通过羽毛表现型分析进行或有可能分析基因型时通过分析整合到鸟类基因组中的禽类白血病病毒序列的Hindi多态性的存在而进行。该方法可包含表达遗传修饰的异源细胞中包含的载体编码的异源多肽的额外的步骤。优选地，异源多肽递送到鸟类的生物学液体，如血液、精液、尿液或遗传修饰的雌鸟产生的发育中的禽卵中的蛋白。本发明还涉及用于培养遗传修饰的和非遗传修饰的禽类胚胎干(ES)细胞，优选鸡或鸭ES细胞的培养基，该培养基添加了动物血清且包含至少一种选自下列的生长因子胰岛素样生长因子1(IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、白细胞介素11(IL-ll)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素或心营养素，其中所述培养基足以维持所述鸡胚干细胞的培养至少10天，至少30天，优选至少100天，更优选无限期。根据优选具体实施方式，本发明还涉及用于培养遗传修饰或非遗传修饰的禽类胚胎干(ES)细胞，优选鸡和鸭ES细胞的基础培养基，其添加动物血清和添加胰岛素样生长因子(IGF-1)和纤毛神经营养因子(CNTF)。根据第二优选具体实施方式，本发明涉及用于培养遗传修饰或非遗传修饰的禽类胚胎干(ES)细胞，优选鸡和鸭ES细胞的基础培养基，其添加动物血清和添加胰岛素样生长因子(IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素6受体(IL-6R)。根据第三优选具体实施方式，本发明涉及用于培养遗传修饰或非遗传修饰的禽类胚胎干(ES)细胞，优选鸡和鸭ES细胞的基础培养基，其添加动物血清和添加胰岛素样生长因子(IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)和成纤维细胞生长因子(FGF)。所述培养基足以维持所述禽类胚胎干(ES)细胞的培养，优选鸡或鸭ES细胞的培养至少7天、至少14天、至少30天、至少50天，优选至少100天。本发明的培养基可进一步可选地包含至少一种选自白细胞介素11、心营养素、制瘤素和/或LIF的化合物。本发明的培养基可进一步包含饲养细胞层(即细胞苔)。本发明还提供区别白色来亨鸡品系与鸡的另一种品系的基因多态性分析方法，其中所述方法包含下列步骤a)获得所述白色来亨鸡品系和鸡的另一种品系的鸡的遗传物质的样品；b)分析整合到鸡基因组中的禽类白血病病毒序列中出现的多态性，其中通过使用选自正向引物5'-GGTGTAAATATCAAAATTATC-3'(SEQIDn°l)和反向引物5'-CGGTTAAAATACGAATAGAGA-S'(SEQIDN°2)的一组引物或正向引物5'-CTATGAGCAGTTACGAGGGTC隱S'(SEQIDN。3)和反向引物5'-CGGACCAACAGGCTAGTCTC-3'(SEQIDN。4)的一组引物来扩增该序列以鉴定多态性。根据本发明的基因多态性的分析方法中，优选使用聚合酶链式反应(PCR)或逆转录PCR进行。分析出现的所述多态性的步骤包含下列歩骤a)用Hindi限制性酶消化PCR扩增的DNA;b)分离经所述消化获得的片段；c)检测所述片段产生的限制性图谱；并d)将用Hindi限制性酶消化白色来亨鸡的遗传物质而获得的图谱与消化所述其他品系鸡的遗传物质而获得的图谱进行比较，其中Hindi限制性位点的存在指示是白色来亨鸡品系，而Hindi限制性位点的缺失则指示不是白色来亨鸡品系。鉴定多态性存在或缺失的方法选自限制性片段长度多态性(RFLP)分析、杂交分析、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)、温度梯度凝胶电泳法(TGGE)、等位基因特异性寡核苷酸分析(ASO)或双脱氧指纹印迹法(ddF)。下列实施例将更加详细解释本发明。给出下列制备方法和实施例以使本领域技术人员能够更清楚地理解和实践本发明。然而，本发明并不限于示例性具体实施方式的范围，这些示例性实施例旨在仅从单方面详细解释本发明，与这些方法功能上等价的方法在本发明的范围内。事实上，本发明的除了本文所描述的内容之外的各种修改对本领域技术人员可根据上述说明书和所附图显而易见地得知。这种修改应视为包含在所附的权利要求范围之内。作为说明书的其余部分，可参考下列。图l:禽类ES细胞的细胞培养动力学将鸡ES细胞在添加10%胎牛血清和IGF1、CNTF、IL6、IL6R、SCF、FGF的培养基中小鼠饲养层上培养。每次传代时确定细胞数。将每次传代获得的细胞数加起来以确定累积增殖系数。图2:鸡ES细胞形态学胚层细胞的形态学(A)BR22p2和(B)BR22p3:大的胞核和小的胞浆的圆形细胞(C)BR29pl2:松散联结的分散的胚层细胞。图3:细胞特异性标记物SSEA-1的表达在体外培养不同时期的胚层细胞上检测ES细胞特异性标记物SSEA-1的表达。左图A:对照状态。右图B:抗体染色。图4:ES细胞的碱性磷酸酶活性胚层细胞的内源性碱性磷酸酶活性。培养不同时期的细胞进行碱性磷酸酶活性染色。图5:细胞维持培养时，分化标记物VASA、THY1、BRACHYURY表达的演化标记物和培养物。1:骨髓；2:胚胎(头部)；3:雄性性腺；4:胚胎(X期)；5:词养层(STO);6:词养层(SN);7:BR4-5;8:BR4-6;9:BR5-2;10:BR8-7;11:BR8-8;12:BR8-9;13:BR8-12;14:V9-19;15:BR15-0;16:BR15-1;17:BR15-2;18:BR15-3;19:BR15-5;20:BR15-6;21:BR15-7;22:BR15-8;23:BR15-8;24:BR15-9;25:BR15-10;26:BR15-11;27:BR18-2;28:BR18-3;29:BR18-4;30:BR18-5;31:BR19-1;32:BR19-2;33:BR19-3;34:BR19-4;35:BR20陽2;36:BR20-3;37:Slp20;38:卢花斑纹鸡gDNA;39:水；40:水。不同培养时期Vasa、Thy-l和Brachuyry(T)标记物的表达。GAPDH为对照标记物。细胞维持培养数周。每次传代时冻存部分细胞沉淀。将不同时期冻存的细胞沉淀同时提取RNA，进行RT-PCR。图6:供体和受体鸡品系以及嵌合体的PCRRFLP图谱分析供体和受体鸡品系以及嵌合体的PCRRFLP图谱分析。将供体和受体鸡品系的7只含胚的新鲜产的卵孵育5天。提取所有胚胎的DNA。体细胞嵌合体将注射了供体细胞的胚胎孵育18天。从血液、心脏、肝脏、脾脏和性腺中提取DNA。图7:嵌合体鸟将供体鸡细胞注入到受体鸡胚内。孵育受体胚直至孵化。喂养嵌合体鸟直至其成年。图8:Fl禾口F2子代8A:具有典型声花斑纹羽毛颜色的F1鸟8B:来自5664-5665雌鸟的F2鸟。雌鸟芦花斑纹雄鸡的精液使雌鸟受精。将卵孵育直至孵化。图9:鸭ES细胞的形态学鸭ES细胞培养在添加10。/。胎牛血清和IGF1、CNTF、IL6、IL6R、SCF、FGF的DMEM培养基中小鼠饲养层上。实施例实施例l:材料和方法胚层细胞从新鲜产下的未孵育的卵收集胚胎。无菌滤纸环放在胚层位于剪切区中央的胚胎的上方。沿盘的外缘剪开卵黄膜。轻按胚盘并使之翻转，并于室温转移至皮氏培养皿中的PBS中。仔细洗掉多余的卵黄。用巴斯德移液管将完整胚层轻轻吸出并放入PBS中。平均200只胚胎聚集在一起。于300g离心细胞两次。将细胞沉淀从细胞培养基中机械分离。将完整培养基中的细胞接种在失活的STO饲养层上。将胚层细胞维持培养于39'C7.5。/。C02条件下。将细胞于39。C用灰色链丝菌蛋白酶(5至2。/。w/v)通过温育进行分离。将分离的细胞接种在完全培养基中新的饲养细胞上。3代至5代之间的细胞接种在最简培养基STO饲养层上。培养基完全培养基由DMEM-F12基质补充10。/。胎牛血清(JRH)、0.16mM(3-巯基乙醇(SIGMA)、1%非必需氨基酸(Biowhittaker)、1mM丙酮酸钠(Biowhittaker)、2mML-谷氨酰胺(Biowhittaker)、1ng/mlIGF1(Tebu)、1ng/mlCNTF(Eurobio)、1ng/mlIL-6(Eurobio)、1ng/mlIL隱6R(Tebu)、lng/mlSCF(Tebu)、1ng/mlbFGF(Peprotech)、1%青链霉素(Biowhittaker)构成。或者，完全培养基由DMEM-F12基质补充10%胎牛血清(JRH)、0.16mMJ3-巯基乙醇(SIGMA)、1%非必需氮基酸(Biowhittaker)、1mM丙酮酸钠(Biowhittaker)、2mML-谷氨酰胺(Biowhittaker)、1ng/mlIGF1(Tebu)、1ng/mlCNTF(Eurobio)、1ng/mlIL-6(Eurobio)、1ng/mlIL-6R(Tebu)、1%青链霉素(Biowhittaker)构成。或者，完全培养基也可由DMEM-F12基质补充10%胎牛血清(JRH)、0.16mM卩-巯基乙醇(SIGMA)、1%非必需氨基酸(Biowhittaker)、1mM丙酮酸钠(Biowhittaker)、2mML-谷氨酰胺(Biowhittaker)、1ng/mlIGF1(Tebu)、1ng/mlCNTF(Eurobio)、1%青链霉素(Biowhittaker)构成。饲养细胞的制备将小鼠成纤维细胞STO细胞系(ATCC)在37.5"C，7.5%(:02条件下在添加4%胎牛血清(JRH)禾n1%谷氨酰胺(Biowhittaker)的DMEM(Cambrex)培养基中维持培养。将STO细胞于亚汇合时用IX灰色链丝菌蛋白酶(Roche)分离，用PBS洗涤并用45戈的Y放射源照射。将饲养细胞以1.5xl()S至2xl0l勺密度接种在100-mm培养皿内新鲜培养基中。转染STO细胞系pGPARa和pMEHCS由BertrandPain博士惠赠。pCINeo购自Promega公司。质粒DNA用碱裂解法和PEG纯化制备。转染时，细胞于上午以每100mm培养皿0.5xl0e个细胞的密度接种。这些细胞于晚上用FuGENE6(Roche)lipofectant脂质体转染3.0吗28环状pCINeo、15(igpGPARa或pMEHCS。次日，洗涤细胞并更换培养基。用新霉素进行选择，从D1，0.3mg/ml开始，连用8天。扩增抗性细胞并于液氮中冻存。碱性磷酸酶反应细胞用PBS洗涤两遍并用1.5%甲醛、0.5%戊二醛、0.1%lgepal于4'C固定10至20分钟。洗涤后，将细胞于37。C在碱性磷酸酶染色溶液中(由100mMNaCI、100mMTrispH9.5、50mMMgCl2、1mg/mlNBT、0.1mg/mlBCIP组成)温育。加入lx的PBS或H20使反应终止。免疫荧光染色分析SSEA-1抗体贝勾自theDevelopmentalStudiesHybridomaBankoftheUniversityofIOWA。细胞于《C用1.5%甲醛、0.5%戊二醛或用0.2%戊二醛、0.01%IGEPAL固定20分钟或于室温用4%的多聚甲醛或甲醇固定10分钟。将细胞在O.ly。的PBS-BSA中温育2至4小时。加入第一稀释抗体过夜。洗涤后，加入FITC-标记的抗IgG第二抗体于4。C作用1小时。移除抗体使反应终止并用PBS洗涤细胞。用荧光显微镜观察细胞。PCRRFLP孵育18天的胚胎组织的DNA根据QIAampDNAmini-kit试剂盒的说明进行纯化。整合入基因组中的禽类白血病病毒片段用下列引物对进行PCR扩增。正向引物5'國GGTGTAAATATCAAAATTATC(SEQIDN。1)反向引物5'-CGGTTAAAATACGAATAGAGA(SEQIDN。2)鎌激正向引物5'隱CTATGAGCAGTTACGAGGGTC(SEQIDN。3)反向引物5'隱CGGACCAACAGGCTAGTCTC(SEQIDN。4)扩增子分别是3106和1004bp。引物157对于声花斑纹鸡DNA的特异性高于对于白色来亨鸡DNA的特异性。所得扩增子用HincII酶消化。RTPCR分析RNA根据PromegaSVtotal脂Aisolationkit试剂盒的说明纯化。头部RNA从孵育5天的胚胎中提取，骨髓RNA从孵育15天的胚胎的大腿骨中提取，睾丸RNA从成年鸡中提取。BR15细胞的RNA根据QiagenRNeasykit试齐[J盒的说明提取。根据PromegaRandomprimersandAMVReversetranscriptasekits试齐U盒的说明将RNA进行逆转录。用下列引物进行PCR扩增。,樣:^麽vasfl,Vasa正向引物TTTGGTACTAGATGAAGCAGACC(SEQIDN。5)Vasa反向引物GTTCCCTATCTCCATGAATGC(SEQIDN°6),凝^"麽^簡/2V"ry..Brachyury正向引物CACAAAGACATGATGGAGGAAG(SEQIDN。7)正向引物2:TGAAGTCCTCTCCAAAACCATT(SEQIDN°8)Brachyury反向引物CATAAGTTCGGGTACTGACTGG(SEQIDN。9)反向引物2:CACAAAATCATTCTGCGGTAAA(SEQIDN。10)GAPDH正向弓I物AGGTGCTGAGTATGTTGTGGAGTC(SEQIDN。ll)GAPDH反向引物AGAACTGAGCGGTGGTGAAGA(SEQIDN。12)正向引物AGGACAACAGGAAGCACATCAT(SEQIDN。13)反向引物GTTCTGGATCAAGAGGCTGAAG(SEQIDN°14)将细胞注射入受体胚胎内当照射时，受体胚胎通过使新鲜产下的未孵育的卵暴露于加速器中发出的X射线(4戈)而制备。胚胎通过沿卵的长轴打开的窗口进入。研磨去除卵壳。壳膜通过滴加PBS保持湿润。注射细胞之前剪开壳膜暴露胚胎。将3(!1的细胞(在培养基中)用微量移液管注射入受体胚胎的胚下腔内。将之前浸入白蛋白的两片壳膜对齐以闭合窗口。壳膜干燥后，用30外科带子紧紧封闭窗口。将卵在37.5i:和50%相对湿度的常规培养箱中孵育，并且每小时旋转90。，共孵育18天。然后将卵转移至37。C和相对湿度85%的常规孵化箱中直至孵化。孵育18天后评价胚胎中表现型和体细胞嵌合体的。通过使注射了的鸟与戸花斑纹鸡交配而评价供体细胞的种系贡献。实施例2:鸡ES细胞的分离和纯化鸡胚胎干细胞从新鲜产下的卵中分离。将平均200个胚胎聚集在一起并将其接种在照射过的小鼠成纤维细胞的词养细胞层上。事实上，Etches等人(1996MoI.Reprod.Dev.45:291-288)已证明，注射了与小鼠成纤维细胞共培养的鸡胚层细胞后，可观察到明显多的体细胞嵌合体。从开始接种到传至3代至5代，胚层细胞生长在完全培养基中(由DMEM-F12基质补充10%胎牛血清(JRH)、0.16mM(3-巯基乙醇(SIGMA)、1%非必需氨基酸(Biowhittaker)、1mM丙酮酸钠(Biowhittaker)、2mML-谷氨酰胺(Biowhittaker)、1ng/mlIGF1(Tebu)、1ng/mlCNTF(Eurobio)、1ng/mlIL-6(Eurobio)、1ng/mlIL-6R(Tebu)、lng/mlSCF(Tebu)、1ng/mlbFGF(Peprotech)、1%青链霉素(Biowhittaker)组成)。传代数次后，去除一些生长因子，使细胞生长在最简培养基中以避免分化。去除的生长因子是(SCF和FGF)，或者是(SCF、FGF、IL-6、IL-6R)。培养鸡ES细胞以避免分化的培养基包含添加了10%胎牛血清(JRH)、0.16mMp-巯基乙醇(SIGMA)、1%非必需氨基酸(Biowhittaker)、1mM丙酮酸钠(Biowhittaker)、2mML-谷氮酰胺(Biowhittaker)的基础培养基(即DMEM-F12)并添加了1ng/mlIGF-1、1ng/mlCNTF、1ng/mlIL-6、1ng/mlIL-6R、1%青链霉素。或者，培养鸡ES细胞以避免分化的培养基包含添加了10%胎牛血清(JRH)、0.16mM(3-巯基乙醇(SIGMA)、1%非必需氨基酸(Biowhittaker)、1mM丙酮酸钠(Biowhittaker)、2mML-谷氨酰胺(Biowhittaker)的基础培养基(即DMEM-F12)并添加了1ng/mlIGF-1、1ng/mlCNTF、1%青链霉素(Biowhittaker)。鸡ES细胞能从鸡的不同品系中分离和扩大(表l)。品系实验数目分离数目成功率％31<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表l:从鸡的各种品系中分离ES细胞体外分离和扩增的细胞的ES状态的特征依赖于已证明对于小鼠和人ES细胞具有特异性的一系列生物学标准自我更新的性质、细胞形态学、干细胞特异性标记物的表达和细胞的全能性(即体外不同谱系中以及在体内分化以促进胚胎构成的能力)。绝大多数分离体的生长特征与那些维持培养一年以上的鸡胚层细胞分离体观察到的生长特征相同(图1)，提示它们具有无限的自我更新的潜能。胚层细胞以集落形式生长。它们是圆形的细胞具有大的胞核和小的胞桨(图2BR22p2&BR22p3)。有趣的是，观察到胚层细胞的形态在培养期间从紧密联结的细胞(图2BR22p2&BR22p3)演化成松散联结的更加分散的细胞(图2,BR29pl2)。松散联结的细胞可在最简培养基中长期稳定化。不同形态的细胞已根据干细胞特异性标记物的表达和促进胚胎构成的能力而将其进一步鉴定。ES细胞经典的分类方法是根据以下不同标记物的表达ECMA-7(Kemler等人，1981J.Embryol.Exp.Morphol.64:45-60)、SSEA-1(Solter和Knowles,1978Proc.Natl.Acad.Sci.USA75(11):5565-5569)、EMA-1(Hahnel和Eddy,1986J.reprod.Immunol.10(2)89-110);也可根据特异性的酶活性(端粒酶和碱性磷酸酶活性)的存在和分化了的细胞的标记物(如TROMA-l)的缺失。在体外扩增的胚层细胞上测定了EMA-1和SSEA-1标记物的表达和碱性磷酸酶的活性。也同时分析在培养过程中胚层细胞形态学的变化，加入胚原基谱系(Tsunekawa等人，2000Development127:2741-2750)、中胚层谱系(Wilkinson等人，1990，Nature343:657-659)和造血谱系(Uchida等人，1994Blood83:3758-3779)的特异性标记物以使分析完整。由于不能得到抗Bmchyury、Thy-l禾Qvasa的抗体，因此通过RT-PCR检测相应基因的转录。该检测可在整个扩大培养期进行并能就不同形态进行。SSEA-1和EMA-1在整个长期培养期内持续表达(图3)。碱性磷酸酶活性在同一培养期内也保持稳定(图4)。图5阐释了细胞维持培养过程中分化标记物表达的演化。VasamRNA在雄性性腺内正如预期的那样高度表达(图5第3道)。X期胚胎(检测不到VasamRNA的表达，第4道)，尽管精子细胞出现在X期胚胎中。Vasa基因在维持培养的细胞中虽微弱表达但可再现(18至36道)。X期胚胎中缺乏Vasa转录本可能是因为RTPCR敏感性差的原因。体外扩增的细胞中Vasa基因的表达可能意味着这些细胞具有种系能力或X期胚胎中出现的精子细胞己在体外扩增。BrachyurymRNA(中胚层谱系标记物)已在X期胚胎(新鲜产的卵的胚胎)检测到(图5第4道)。细胞维持培养过程中表达增加(图5，BR8:12道和13道；BR15:19至26道；BR18:27至30道；BR19:32至34道)。还检测到维持培养的细胞中Thy-l(造血细胞谱系标记物)的mRNA(泳道7、8;11、12、13;16至24;27至34)。胚层细胞表达HNK1(雏鸟神经嵴细胞标记物)。维持培养的细胞中HNK1的表达保持稳定(数据未显示)。未分化细胞标记物在整个所有培养期内都表达(数据未显示)。培养的胚层细胞表达未分化细胞标记物和神经嵴细胞标记物和中胚层细胞标记物。令人吃惊的是，被认为是精子细胞特异性的Vasa基因在ES细胞内转录。体外扩增的鸡细胞的全能性通过评价其体内促进胚胎重建的能力而检测。建立将不同数目的鸡ES细胞注射入受体鸡胚胎的实验以确定在嵌合体水平的影响。也研究了照射受体胚胎对定居效率的影响。选择4个参数以监视注射和辐射的影响(i)胚胎成活率；(ii)表现型嵌合体百分数(有色羽毛胚胎的百分数)；(iii)表现型嵌合体的延伸(有色羽毛的百分数)；(iv)体细胞嵌合体百分数(羽毛以外的组织的嵌合体)。将300、5,000、15,000或30,000个ES供体细胞注射入新鲜产的之前接受过Y射线照射的或未照射过的受体胚胎的胚下腔内。注射卵根据标准条件孵育。培养的胚层细胞在培养第14天至第43天期间每星期注射一次以确定在培养时间内定居潜能的演化。所有胚胎在孵育18天进行分析。培养的胚层细胞(供体细胞)来自有色芦花斑纹鸡品系或S86N鸡品系，其在显性白色基因座/上是隐性纯合子(ii)。将供体细胞注射入在/基因座是显性纯合子的白色来亨鸡品系(受体品系)的受体胚胎内。体细胞嵌合体可通过孵化后黑色羽毛的存在而鉴定。然而，发展了PCRRFLP方法以区分供体细胞和受体胚胎的基因指纹(图6)。受体品系的PCRRFLP图谱是1或2条带的特征，这取决于不同个体。供体品系的PCRRFLP图谱是3条带的特征。嵌合组织通过其是供体典型的3条带而鉴定。然后可能确定注射细胞是否具有使羽毛以外的组织定居的能力。正如研究了长期维持培养的细胞其特异性标记物的表达，还研究了长期维持培养的细胞其体外定居的能力，并且同样是根据细胞形态学进行的研究。已鉴定出一些表现型嵌合体(即这样的动物，其羽毛被来自供体品系的细胞所拓殖)和鸡体细胞嵌合体(即这样的动物，其除了羽毛之外的组织被来自供体品系的细胞所拓殖)鸡。已显示出供体细胞出现在包括性腺在内的所有三个胚层的衍生物中。这个结果证明根据本发明的方法获得的离体扩增的鸡ES细胞能植入并重建包括性腺在内的受体胚胎的各种组织。令人吃惊的是，本发明人证明，注射大于现有技术建议的注射量(即约300至500个照射细胞)的量不会影响胚胎的存活率。而且，无论是否进行照射步骤，注射大量细胞(也就是说大于15000并最终30000)使表现型嵌合体的百分数显著增加。注射30000个细胞并不是上限，可考虑注射更多的细胞，唯一的限制是受体胚胎在接受这些细胞后能够存活和发育。本发明人证实在照射过的受体胚胎中注射15000个细胞和在未照射过的胚胎中注射30000个细胞结果最好，并特异性地在性腺中胚胎嵌合体的比例更高。本发明人证实使用的照射范围不影响鸡胚的存活率。而且，定居潜能似乎不取决于胚层鸡细胞培养的时间长度(数据未显示)。总之，资料支持体外分离并扩增的ES细胞是真正的胚胎干细胞的想法。实施例3:鸡ES细胞种系传递伴随发展的最好的注射方法论，9%的注射鸟是性腺嵌合体(数据未显示)。为了谱系传递的组织，根据显示能优化性腺定居的最好的方法，通过将培养细胞注射入受体胚胎内产生一群584只动物。鸟类的表现型嵌合体从孵化时的一些羽毛(后来丢失)，延伸到成年后大于95%(图7和表2)。雌鸟鉴定照射培养天数表现型嵌合体%PGC注射潜在数目2940X41900.00251730X2802.41692X21<50.0644164no70<5<10-34316no46仅孵化时<10—34542X5902.7x10"表2:注射雌鸟和l匿鸟的表现型嵌合体的延伸注射芦花斑纹鸡细胞的雌鸡与芦花斑纹雄鸡交配以评价供体谱系对种系的贡献。通过检测黑色和黄色子代的分布评价种系传递。检测了雌鸡的221只子代。在16006只Fl鸡中，5只雏鸡表现出白色羽毛的百分数可变(一只孵出前死亡)，一只雏鸡表现出典型的芦花斑纹鸡的羽毛着色(图8A)。表3描述了产生戸花斑纹鸡样羽毛着色的子代的雌鸡和注射条件。甚至培养59天后，细胞仍能使种系定居。种系传递与雌鸡表现型嵌合体的高百分率无关。的确，戸花斑纹鸡样雏鸡的母亲是白色的。假定50PGC(Eyal-Giladi等人，1976)存在于X期胚胎中，以此来评价PGC注射的潜在数目。根据使细胞成功传代的稀释因子和注射入受体胚胎的细胞悬浮液的浓度和体积计算PGC的最终数目。培养天数表现型嵌合体％基因型嵌合体％142.30226.4035<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表3:培养ES细胞对体内定居的影响[表现型嵌合体％:有色羽毛的胚胎数目/18天活的胚胎的数目；基因型嵌合体％:羽毛以外其他组织的胚胎嵌合体数目/18天活的胚胎的数目]。5只Fl子代(16006只鸟)中的4只雏鸟存活到成年。其中4只雌鸟用雄性芦花斑纹雄鸟的精液授精。雌鸟5664-5665子代是卢花斑纹样鸡(图8B和表4)。另3只雌鸟的子代中是卢花斑纹样和白色来亨鸡样雏鸡(表4)。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表4:Fl鸟子代注射的嵌合体与声花斑纹鸡交配产生的雌鸡用芦花斑纹鸡的精液授精。孵育卵直至孵化。记录子代表现型。本发明人提供培养鸡ES细胞的方法。文献仅记录了白色来亨鸡和芦花斑纹鸡品系的胚层细胞的扩增(Pain等人，1996Dev.122(8)2339-2348,Petitte等人，1990108(1):185-189，Zhu等人，2005NatBiotechnol.23(9):1159-1169)。本研究发展了该培养过程，特别是联合使用特异性生长因子和其演化允许可再现地分离和从不同品系的鸡中扩增细胞。扩增效率是品系依赖的，结果与描述的小鼠建立ES细胞系的种系区别一致(Kawase等人，1994Int.J.Dev.Biol.38(2):385-390)。有趣地是，不像小鼠，长时间培养维持的雏鸡ES细胞的全能性通过去除几种生长因子而支持。也就是说，长时间培养在完全培养基中和去除了如IL-6、IL-6R、SCF和FGF的生长因子的完全培养基中的鸡ES细胞确实具有全能性。应注意，人ES细胞不能在小鼠ES细胞建立的培养条件下培养。Pain等人(1996)所述，鸡胚层长期培养(大于160天)过程中，小细胞的大集落，紧密地填充在具有与小鼠ES细胞类似的典型的"ES样"形态学特征的巢中。作为对照，本发明人长时间培养维持的鸡胚层细胞形态学不能保持如此稳定，并从圆形的紧紧相连的细胞变成松散连接的细胞。这个形态演化是一致的且与鸡品系无关。这个形态学变化不影响ES细胞特有的自我更新性能。在不同谱系中细胞的潜在定向发育(commitment)可通过下列达到(i)免疫荧光染色或RT-PCR分析的生物化学鉴定；(ii)达到培养细胞的生物特性的转基因方法学。细胞根据所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的特异性标记物而鉴定。选择那些提示非常早期分化的标记物。无一胚层的细胞形态呈现出特异性标记物的组合。能检测未分化细胞的标记物，所有三个胚层的标记物和像vasa这样的种系标记物。形态变化特异性表达的标记物不会发生演化。甚至是那些具有最分化的形态的细胞表达ES细胞特异性标记物而并不表达分化标记物。将体外扩增的细胞悬浮液注射入受体胚胎内。羽毛颜色来源于色素从黑色素细胞转移到羽毛的柄中。黑色素细胞起源于胚胎躯干神经嵴细胞。神经嵴细胞的分化自胚胎发育的非常早期即发生。注射了黑色品系鸡的细胞的白色受体胚胎的羽毛颜色可能不反映注射细胞的全能性，但可提示定向发育成黑色素细胞的细胞能够加入受体成黑色素细胞谱系。因此，注射细胞对于受体胚胎的贡献的研究并不限于对羽毛的观察还包括对所有三个胚层衍生的组织的观察。以培养中观察到的细胞的每种主要形体(成束、成簇和托尾状)而获得表现型和体细胞嵌合体，这支持细胞的未分化状态而不论其形态如何。有趣的是，性腺也被注射的细胞拓殖。细胞处于ES状态的最终证据是种系传递。1只F0(注射)雌鸟(0.3%)支持种系传递。这只雌鸟的超过16只雏鸟子代中，1只Fl雏鸟是芦花斑纹样(6.25%)。Fl雌鸟的所有F2雏鸟表现出芦花斑纹表现型，这提示供体性状的获得通过几代是稳定的。黑色羽毛的百分率可变的F1雌鸟的子代中，一半是芦花斑纹样，另一半具有如孟德尔遗传规律所预期的白色来亨鸡表现型。因此，本发明人证明，鸡胚层细胞具有种系传递的能力。因此鸡胚层细胞可用于发展禽类转基因。实施例4:鸭ES细胞的分离和扩增4.1原材料北京鸭品系GL30的鸭卵获自GRIMAUDFRERESSELECTION(LaCorb化re,RoussayFrance)。亲代鸭接种抗大肠杆菌(自体疫苗Coli01&02)、抗巴氏杆菌(Landavax)、鸭病毒性肝炎(Hepatovax)、猪红斑丹毒丝菌(Ruvax)、禽类偏肺病毒(Nemovac)、鼠伤寒沙门氏杆菌及肠炎沙门氏杆菌(自体疫苗)、鸭疫里默氏杆菌(里默氏杆菌自体疫苗)、禽类偏肺病毒(NobilisRTV，灭活)和猪红斑丹毒丝菌(Ruvax)。接受后，受精北京鸭鸭卵用硫化三氯乙烯浴消毒随后用Fermacidal(Thermo)去除沾染物以避免沾在卵壳上的灰尘有关的污染的任何风险。線潘應鼠源细胞(STO细胞)用作词养层细胞以维持鸭干细胞多能性。这些饲养细胞在接种到塑料培养容器中之前通过Y射线照射(45至55戈)使其不能进行有丝分裂。照射剂量是诱导细胞周期确定终止但仍然能产生对于促进未分化细胞的细胞生长必要的生长因子和细胞外基质的亚致死剂量。STO细胞系获自A.Bernstein,OntarioCancerInstitute(Toronto,Canada)的连续细胞系SIM(山德士同系交配小鼠)的小鼠胚胎成纤维细胞，由美国典型微生物保藏中心(ATCC)供给(STO产品编号CRL-1503,批号1198713)。新鲜饲养细胞层每周制备两次。细胞进入指数生长期时进行分离并计数。将一部分细胞接种成为活的培养物，另一部分细胞用射线照射。照射时，在试管中制备10x106个细胞/ml的细胞悬浮液。使细胞暴露于45至55戈的照射剂量并将接种在塑料培养容器中。接种后，使用以失活饲养细胞包被的培养皿或培养盘至多5天。智孝基GTM-3培养基(Sigma，Catn。G9916)DMEM-HamF12(Cambrex,CatnoBE04-687)薪身欽谷氨酰胺(Cambrex,Catn。BE17-605E)抗生素青霉素/链霉素(Cambrex,Catn。BE17-602E)非必需氨基酸(Cambrex,Catn。BE13-114E)丙酮酸钠(Cambrex,Catn。BE13-115)维生素(Cambrex,Catn。13-607C)p-巯基乙醇(Sigma，Catn。M7522)酵母提取物(SAFC,Catn。58902C)厉f使用六种不同重组因子-重组人纤毛神经营养因子(CNTF)(Peprotechlnc,Catn。450-13)-重组人胰岛素样因子I(IGF1)(P印rotechlnc,Catn°l00-11)-重组人白细胞介素6(IL6)(Peprotechlnc，Catn。200-06)-重组人可溶性白细胞介素6受体(sIL6r)(PeprotechInc，Catn。200-06R)-重组人干细胞因子(SCF)(Peprotechlnc,Catn。300-07)-重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(PeprotechInc,Catn。100-l犯)所有这些因子，除IL6r外，均用大肠杆菌制备。可溶性IL6r用转染的HEK293细胞表达。胂麟,厲浙>^铺獰卿5Va/好，oz/""厕"方案中使用的未照射血清采集并产自澳大利亚。采集血清的动物是经USDA检查可屠杀的。这些血清在禽类干细胞培养过程中添加在培养基中。这批血清不照射以避免对于干细胞的维持培养重要的关键蛋白质或成分的破坏。庸^據a纽,cv/,"，7j方案中使用的照射批血清采集自美国。这批照射血清作为补充物添加到用于STO细胞(饲养细胞)的培养的DMEM培养基中。STO细胞不像干细胞一样需要特定品质的血清以支持其生长和维持培养。39为使培养基中血清的高浓度最小，我们培养STO细胞的培养基中胎牛血清的浓度仅为4%。4.2-鸭ES细胞的分离和培养方法打开约360只受精鸭卵，在打开过程中，从卵清中分离卵黄。将胚胎借助小的吸收滤纸(Whatmann3Mpaper)(用打孔器预先切成打孔形式)从蛋黄中取出，事先以打孔器制成打孔环的形式。孔的直径约5mm。这些小环在烤箱中用干热灭菌法灭菌约30分钟。操作中，在收集胚胎的过程中，小纸环放置在卵黄的表面并位于胚胎的中心，因此胚胎被纸环环绕。用小剪刀剪开胚胎，并整个取出的胚胎放入皮氏培养皿中，加入PBS。清除被纸环带出来的胚胎上培养基内和胚盘上多余的卵黄，这样胚胎就不含多余的卵黄磷蛋白，将其用巴斯德移液管收集起来。将鸭胚放在含1XPBS的50ml试管中。然后将鸭胚机械分离，用PBS洗涤，并于39°C,7.5%C02，完全培养基中接种在失活饲养细胞层STO细胞上。将饲养细胞以约2.7x104个细胞1/cn^接种在6孔板中或培养皿中。完全培养基由无血清培养基DMEM-HamF12添加10%胎牛血清，终浓度为1ng/ml的IGF1、CNTF和可选的IL-6、IL-6R、SCF和牛FGF，和1%非必需氨基酸、1%购买的维生素的混合物、终浓度为0.1mM的丙酮酸钠、终浓度为0.5mM的p-巯基乙醇、终浓度为2.1mM的谷氨酰胺、终浓度为100U/ml的青霉素、终浓度为100pg/ml的链霉素和1X酵母提取物构成。很快地，细胞传至第4代时，培养基中不再加入抗生素混合物。将鸭ES细胞培养在DMEM-HamF12完全培养基中直至第4代。4代后，将基础培养基改良，DMEM-HamF12完全培养基用下列之一置换-添加10%胎牛血清、终浓度为1ng/ml的IGF1和CNTF、1%非必需氨基酸、1%购买的维生素混合物、终浓度为0.1mM的丙酮酸钠、终浓度为0.5mM的p-巯基乙醇、终浓度为2.1mM的谷氨酰胺和IX酵母提取物的GTM-3培养基；或-添加10%胎牛血清、终浓度为1ng/ml的IGF1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、FGF，1%非必需氨基酸、1%购买的维生素混合物、终40浓度为0.1mM的丙酮酸钠、终浓度为0.5mM的p-巯基乙醇、终浓度为2.1mM的谷氨酰胺和IX酵母提取物的GTM-3培养基；鸭ES细胞在新培养基中可进一步培养至少14代而不分化。权利要求1、一种培养禽类胚胎干(ES)细胞的方法，该方法包含下列步骤a)将起源于受精未孵育的禽卵胚盘的ES细胞用添加下列成分的基础培养基悬浮-胰岛素样生长因子1(IGF-1)和纤毛神经营养因子(CNTF)；和-动物血清；和-可选的，至少一种选自白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素11(IL-11)、制瘤素或心营养素的生长因子；b)将步骤a)获得的ES细胞悬浮液接种于饲养细胞层上并继续培养ES细胞，使其至少传2至10代；c)可选地将至少一种选自SCF、FGF、IL-6、IL-6R、LIF、制瘤素、心营养素或IL-11的生长因子从培养基中去除；d)用步骤c)的培养基在饲养细胞层上继续培养ES细胞。2、根据权利要求1所述的培养禽类胚胎干(ES)细胞的方法，该方法包含下列步骤a)将起源于受精未孵育的禽卵胚盘的ES细胞用添加胰岛素样生长因子1(IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和动物血清的基础培养基悬浮；b)将步骤a)获得的ES细胞悬浮液接种于饲养细胞层上并继续培养ES细胞，使其至少传2至10代；c)可选地将至少一种选自SCF、FGF、IL-6或IL-6的生长因子从培养基中去除；d)用步骤c)的培养基在饲养细胞层上继续培养ES细胞。3、根据权利要求1所述的培养禽类胚胎干(ES)细胞的方法，该方法包含下列步骤a)将起源于受精未孵育的禽卵胚盘的ES细胞用添加胰岛素样生长因子1(IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和动物血清的基础培养基悬浮；b)将步骤a)获得的ES细胞悬浮液接种于词养细胞层上并继续培养ES细胞，使其至少传2至10代；c)可选地将至少一种选自SCF或FGF的生长因子从培养基中去除；d)用歩骤c)的培养基在饲养细胞层上继续培养ES细胞。4、根据权利要求1所述的方法，其中禽类是鸡。5、根据权利要求1所述的方法，其中禽类是鸭。6、一种将禽类胚胎干细胞进行遗传修饰的方法，该方法包含下列步骤a)用载体转染根据权利要求1-5所述方法培养的ES细胞；b)选择已转染的ES细胞；C)筛选和扩增选定的遗传修饰的ES克隆；d)在包含动物血清和至少包含胰岛素样生长因子1(IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)和可选地包含至少一种选自白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)的生长因子的培养基中在饲养细胞层上培养所述遗传修饰的ES细胞。7、一种获得嵌合体雏鸟的方法，该方法包含下列步骤a)将根据权利要求1-5所述的方法培养的ES细胞导入受体禽胚胎的胚下腔中；并b)孵育步骤a)获得的胚胎直至孵出雏鸟；c)选择所述包含已在所述雏鸟体内定居的异源细胞的嵌合体雏鸟。8、一种获得遗传修饰的嵌合体雏鸟的方法，该方法包含下列步骤:a)将于权利要求6的步骤d)中获得的遗传修饰的ES细胞导入受体禽胚胎的胚下腔中；并b)孵育步骤a)获得的胚胎直至孵出雏鸟；c)选择所述包含已在所述雏鸟体内定居的遗传修饰的异源细胞的嵌合体雏鸟。9、根据权利要求7和8所述的方法，其中所述嵌合体雏鸟的选择根据羽毛表现型的分析进行。10、根据权利要求7至9所述的方法，该方法包含在导入ES细胞之前确定受体胚胎性别的附加的步骤。11、根据权利要求7和IO所述的方法，其中步骤a)的培养的ES细胞己于体外培养了至少5天。12、根据权利要求7至11所述的方法，其中受体胚胎来源于新鲜产下的未孵育卵并包含约5,000至约70,000个细胞。13、根据权利要求12所述的方法，其中所述受体胚胎处于包含于Eyal-Giladi&Kochav分类的VI期和XII期之间的时期，优选处于约Eyal-Giladi&Kochav分类的X期。14、根据权利要求7至13所述的方法，其中将至少1000个ES细胞，优选至少15,000个ES细胞导入受体禽胚的胚下腔内。15、根据权利要求7至14所述的方法，其中将至少30,000个ES细胞导入受体禽胚的胚下腔内。16、根据权利要求7至15所述的方法，其中导入受体禽胚的胚下腔内的ES细胞是雌性和雄性ES细胞的混合细胞群。17、根据权利要求7至15所述的方法，其中将雌性ES细胞导入雌性受体禽胚的胚下腔内。18、根据权利要求7至15所述的方法，其中将雄性ES细胞导入雄性受体禽胚的胚下腔内。19、根据权利要求7至18所述的方法，该方法包含在将ES细胞导入所述受体禽胚的胚下腔内之前，用X或Y射线照射受体胚胎的附加的歩骤。20、根据权利要求19所述的方法，其中鸡受体胚胎用X射线以3至6戈之间的剂量照射，优选约4戈剂量照射。21、根据权利要求7至20所述的方法，其中将约15,000个鸡ES细胞导入之前用约4戈的X射线照射过的受体鸡胚的胚下腔内。22、根据权利要求7至20所述的方法，其中将至少30,000个鸡ES细胞导入未经照射的受体鸡胚的胚下腔内。23、根据权利要求7至22所述的方法，其中所述受体鸡胚是白色来亨鸡品系的鸡胚，并且所述鸡ES细胞来源于选自芦花斑纹鸡、马朗鸡或S86N鸡的品系。24、根据权利要求7至22所述的方法，其中所述受体鸡胚是选自戶花斑纹鸡、马朗鸡或S86N鸡的品系的鸡胚，并且其中所述鸡ES细胞来源于白色来亨鸡。25、根据权利要求23至24所述的方法，其中包含异源细胞的嵌合体雏鸟的选择包含下列步骤a)从所述嵌合体雏鸟体内获得遗传物质样品；b)检测整合到禽类基因组中的禽类白血病病毒的序列多态性，并且其中该多态性通过使用下列引物组扩增而鉴定正向引物5'-GGTGTAAATATCAAAATTATC-3'(SEQIDn。l)和反向引物5'-CGGTTAAAATACGAATAGAGA-3'(SEQIDN。2)的组或正向引物5'-CTATGAGCAGTTACGAGGGTC-3'(SEQIDN03)和反向引物5'-CGGACCAACAGGCTAGTCTC-3'(SEQIDN。4)的组。26、根据权利要求25所述的方法，其中所述鉴定多态性存在或缺失的方法选自下列方法限制性片段长度多态性(RFLP)分析、杂交分析、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)、温度梯度凝胶电泳法(TGGE)、等位基因特异性寡核苷酸分析(ASO)或双脱氧指纹印迹法(ddF)。27、根据权利要求25和26所述的方法，其中分析所述多态性存在的所述步骤包含下列步骤a)用HincII限制性酶消化所述遗传物质；b)分离经所述消化获得的片段；c)检测所述片段产生的限制性图谱；并d)可选地将所述图谱与至少一种将白色来亨鸡、马朗鸡、芦花斑纹鸡、S86N鸡遗传物质用HincII限制性酶消化获得的限制性图谱进行比较，其中步骤c)和d)检测的限制性图谱的区别指示包含异源细胞的嵌合体雏鸟。28、根据权利要求25至27所述的方法，其中所述扩增用聚合酶链式反应(PCR)或逆转录PCR进行并且其中所述分析包含将PCR扩增的DNA用限制性酶HincII消化。29、一种获得嵌合体雏鸟子代的方法，其中所述方法包含下列步骤a)使选定于权利要求7或8的步骤c)获得的嵌合体雏鸟发育成熟成为成鸟；b)喂养所述具有异源细胞的成鸟，以产生子代鸟；和c)选择子代目的鸟。30、根据权利要求29所述的方法，其中所述鸟的选择通过其羽毛表现型分析而进行。31、根据权利要求29所述的方法，其中所述鸟的选择通过检测整合入鸟基因组中的禽类白血病病毒序列的HincII多态性的存在的基因型分析而进行。32、根据权利要求29至31所述的方法，该方法进一步包含表达包含在遗传修饰的异源细胞中的载体编码的异源多肽的步骤。33、根据权利要求32所述的方法，其中异源多肽传递至遗传修饰鸟产的发育禽卵中的蛋白中。34、一种禽类胚胎干细胞培养基，该培养基至少包含胰岛素样生长因子1(IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)和可选地包含至少一种选自白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)的化合物，其中所述培养基足以维持所述禽类胚胎干细胞的培养至少7天，优选至少100天。35、进一步包含饲养细胞层的如权利要求34所述的培养基。36、一种区分白色来亨鸡品系与其他品系的鸡的基因遗传多态性分析的方法，其中所述方法包含下列步骤a)获得来自所述白色来亨鸡品系的遗传物质的样品和其他品系鸡的遗传物质的样品；b)分析整合到鸡基因组中的禽类白血病病毒的序列中的多态性的存在，其中该多态性可通过用下列组的引物扩增而鉴定正向引物5'-GGTGTAAATATCAAAATTATC-3'(SEQIDn°l)和反向引物5'-CGGTTAAAATACGAATAGAGA-3'(SEQIDN。2)的组或正向引物5'-CTATGAGCAGTTACGAGGGTC-3'(SEQIDN。3)和反向引物5'-CGGACCAACAGGCTAGTCTC-3'(SEQIDN。4)的组。37、根据权利要求36所述的方法，其中所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)或逆转录PCR进行。38、根据权利要求37所述的方法，其中所述分析所述多态性存在的步骤包含下列步骤a)用Hindi限制性酶消化PCR扩增的DNA;b)分离经所述消化获得的片段；c)检测所述片段产生的限制性图谱；并d)将用Hindi限制性酶消化白色来亨鸡的遗传物质而获得的图谱与消化所述其他品系鸡的遗传物质而获得的图谱进行比较，其中Hindi限制性位点的存在指示是白色来亨鸡品系，而Hindi限制性位点的缺失则指示不是白色来亨鸡品系。39、根据权利要求36至38所述的方法，其中所述鉴定多态性存在或缺失的方法选自限制性片段长度多态性(RFLP)分析、杂交分析、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)、温度梯度凝胶电泳法(TGGE)、等位基因特异性寡核苷酸分析(ASO)或双脱氧指纹印迹法(ddF)。全文摘要本发明涉及培养禽类胚胎干(ES)细胞的方法，该方法包含下列步骤a)将起源于受精未孵育的禽卵胚盘的ES细胞用添加下列成分的基础培养基悬浮胰岛素样生长因子1(IGF-1)和纤毛神经营养因子(CNTF)；以及动物血清；和可选的至少一种选自白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素11(IL-11)、制瘤素或心营养素的生长因子；b)将步骤a)获得的ES细胞悬浮液接种于饲养细胞层上并继续培养ES细胞，使其至少传2至10代；c)可选地将至少一种选自SCF、FGF、IL-6、LIF、制瘤素、心营养素或IL-11的生长因子从培养基中去除；d)用步骤c)的培养基在饲养细胞层上继续培养ES细胞。文档编号C12N5/0735GK101506354SQ200780031230公开日2009年8月12日申请日期2007年8月9日优先权日2006年8月9日发明者I·瓦拉尔谢,L·巴塔尔,M·梅泰利申请人:维涡里斯公司